宋 慧 臧賀藏 李國強 解慧芳 邢 璐 李 龍 王素英 劉金榮* 鄭國清*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所/河南省智慧農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，鄭州 450002;2.安陽市農(nóng)業(yè)科學院 谷子研究所/河南省谷子育種工程技術(shù)研究中心，河南 安陽 455000)

谷子起源于中國，早在公元前5000—6000年二倍體谷子[Setariaitalica(L.)Beauv.]栽培種已在黃河流域廣泛種植[1]，谷子籽粒營養(yǎng)豐富、耐旱性強，是北方旱作地區(qū)重要的特色雜糧作物[2]。種質(zhì)資源是新品種選育和遺傳研究的基礎(chǔ)，我國擁有最豐富的谷子種質(zhì)資源，占世界總資源的70%左右[3]，在谷子育種領(lǐng)域兩次跨越式發(fā)展都與種質(zhì)資源的定向改良有關(guān)，具有里程碑意義的谷子常規(guī)品種‘豫谷1號’引領(lǐng)谷子由農(nóng)家種向育種家品種的跨越，改變了谷子作為低產(chǎn)作物的歷史，其親本是由日本引進的 ‘日本60日’和‘土龍’；雜交谷子育種帶動谷子由中高產(chǎn)作物邁向高產(chǎn)作物行列，其中，不育系‘A2’的親本來源于澳大利亞。當前，在豐富的種質(zhì)資源基礎(chǔ)上提高資源利用效率和拓寬種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)是培育谷子突破性新品種的核心，也是實現(xiàn)谷子種業(yè)創(chuàng)新的關(guān)鍵問題之一。

構(gòu)建骨干種質(zhì)能有效解決龐大種質(zhì)資源群體研究與高效利用之間的矛盾，國內(nèi)外學者分別基于表型性狀和分子標記構(gòu)建了花生[4]、水稻[5]、大豆[6]、小麥[7]和芝麻[8]等作物的骨干種質(zhì)，以最小的資源量覆蓋最全的資源群體遺傳多樣性，既保證了種質(zhì)資源的遺傳多樣性，又減少了資源樣本的數(shù)量，有利于資源研究。谷子種質(zhì)具有豐富的遺傳多樣性，王海崗等[9-10]對不同來源的878份谷子核心種質(zhì)進行了綜合鑒定和遺傳多樣性評估，利用SSR標記分析了山西省谷子資源的群體遺傳結(jié)構(gòu)多樣性。楊慧卿等[11]選用了來自國外及國內(nèi)的68份分蘗型谷子進行遺傳多樣性分析，其數(shù)量性狀遺傳變異豐富。丁銀燈等[12]對國內(nèi)外124份谷子種質(zhì)資源進行表型及SSR分析發(fā)現(xiàn)谷子單株生物產(chǎn)量、單穗重的數(shù)量性狀變異系數(shù)較大，遺傳多樣性指數(shù)較高。賈冠清等[13]以SSR標記為基礎(chǔ)，構(gòu)建了核心種質(zhì)，繪制了SNP標記的谷子單倍型圖譜，發(fā)掘出控制多個谷子主要農(nóng)藝性狀和植物學性狀的QTL位點，形成了一個基于關(guān)聯(lián)分析的谷子功能基因發(fā)掘平臺，為后續(xù)分子標記輔助育種提供支撐。針對當?shù)赜N現(xiàn)狀重新構(gòu)建和利用資源骨干種質(zhì)是拓寬谷子育種遺傳基礎(chǔ)、解決遺傳變異冗余和樣本利用效率低等問題的重要途經(jīng)。目前，以地方農(nóng)家品種為主構(gòu)建骨干種質(zhì)的研究鮮見報道。本研究以1 237份谷子種質(zhì)資源(包括野生種、農(nóng)家種、育成品種和國外引進品種)為材料，以19個數(shù)量和質(zhì)量表型性狀數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建谷子種質(zhì)資源的骨干種質(zhì)，利用極差、表型保留比例、表型相關(guān)性等對谷子骨干種質(zhì)的代表性、主成分分析、直方圖進行評價和確認，旨在高效發(fā)掘和利用以地方農(nóng)家品種為主的谷子種質(zhì)資源，以期為谷子種質(zhì)資源的高效創(chuàng)新利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及地點

由中國農(nóng)業(yè)科學院作物所提供1 237 份地理來源明確的種質(zhì)資源，包括引進品種、育成品種、地方品種、野生品種。試驗于2020年在河南省北關(guān)區(qū)柏莊鎮(zhèn)安陽市農(nóng)業(yè)科學院試驗基地進行，于5月20日播種，10月3日收獲。

1.2 試驗設(shè)計

小區(qū)面積2 m2，種植密度60萬株/hm2，行長1 m，行距40 cm，2行區(qū)種植。田間管理參照全國谷子聯(lián)合鑒定試驗的方法管理。

1.3 調(diào)查內(nèi)容及方法

根據(jù)谷子種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準對生育期、主莖節(jié)數(shù)、株高、穗下節(jié)間長度、主穗長度、葉面積、草重、刺毛顏色、幼苗葉色、幼苗葉姿、穗形、穗姿11個田間農(nóng)藝性狀和主穗長度、單株穗重、穗粗、主穗碼數(shù)、主莖單穗重、主莖單穗粒重、單株粒重、千粒重8個產(chǎn)量性狀，共19個谷子表型性狀進行采集。質(zhì)量性狀根據(jù)其表型進行賦值(表1)，數(shù)量性狀數(shù)據(jù)根據(jù)0.5個標準差為間距進行標準化，分為10級(1級≤X-2δ，10級>X+2δ，中間每級間差0.5δ，X為性狀平均值，δ為標準差)。

表1 谷子質(zhì)量性狀賦值Table 1 Quantified values of the qualitative traits of foxtail millet

1.4 分組及取樣比例

根據(jù)品種來源分為引進品種、農(nóng)家品種、野生品種和育成品種4個類型，按植物學性狀中穗形分成7組。分組取樣量指全資源份數(shù)的平方根值占小組平方根之和的比例(平方根取樣法)。

式中：Ni代表第i組的取樣份數(shù)，ni代表第i組的品種數(shù)，nj代表第j組的品種數(shù)，m代表總分組數(shù)，N代表總資源份數(shù)。

1.5 聚類分析

采用SPSS 22.0軟件以類平均數(shù)法(UPGMA)進行表型性狀的系統(tǒng)聚類分析，類內(nèi)采用Microsoft Excel中的Rand between函數(shù)隨機取樣。

1.6 檢測骨干種質(zhì)的代表性

利用t測驗、F測驗分別評價全部種質(zhì)和骨干種質(zhì)表型性狀的均值、方差、變異系數(shù)及Shannon-Weaver指數(shù)是否存在顯著差異。

變異系數(shù)(CV)=(標準偏差SD/平均值Mean)×100%，代表全部種質(zhì)和骨干種質(zhì)的離散程度。

(1)

式中：H′為Shannon-Weaver 多樣性指數(shù)，Pi為某性狀第i級的分布頻率，n為總分級數(shù)。

表型保留比例(the ratio of phenotypic retention，RPR)用于評價骨干種質(zhì)中覆蓋資源的變異程度。

(2)

式中：Pio為全部種質(zhì)中某性狀的表型變異數(shù)，Pi為骨干種質(zhì)中該性狀的表型變異數(shù)，n為表型性狀總數(shù)。

1.7 評價骨干種質(zhì)

利用主成分分析和直方圖比較全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)基于主成分的樣品分布圖及表型性狀的分布頻率，對構(gòu)建的骨干種質(zhì)的有效性進行確認。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子骨干種質(zhì)的篩選構(gòu)建

由表2可知，按照不同穗形將谷子全部種質(zhì)分7個小組，UPGMA法聚類分析后隨機取樣，每組取樣量為1～17份，得到113份種質(zhì)資源，經(jīng)初評后，將野生種質(zhì)中增補5份入選，共確定出118份骨干種質(zhì)，占全部種質(zhì)資源的9.9%。此骨干種質(zhì)中按地理生態(tài)區(qū)包括國外品種20份(17.09%)、農(nóng)家種56份(47.86%)、野生種5份(4.28%)、育成品種36份(30.77%)，代表了谷子資源的地理來源(P=0.579)，構(gòu)建的骨干種質(zhì)與全部種質(zhì)之間差異水平不顯著，即骨干種質(zhì)能夠代表全部種質(zhì)。按不同穗形可分為圓錐型39份(33.32%)、紡錘型23份(19.66%)、圓筒型21份(17.95%)、棍棒型16份(13.68%)、鴨嘴型4份(3.42%)、貓爪型8份(6.84%)、佛手型6份(5.13%)，方差分析表明，骨干種質(zhì)穗形代表了全部種質(zhì)的穗形組成(P=0.637)，差異水平不顯著，骨干種質(zhì)能代表全部種質(zhì)的類型。

表2 骨干種質(zhì)和全部種質(zhì)的植物學類型組成和地理來源的顯著性測驗Table 2 Significance tests for botanical type composition and geographical origin of backbone germplasm and all germplasm

2.2 谷子全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)的平均值、方差和極差比較評價

由表3可知，谷子骨干種質(zhì)的19個表型性狀的均值皆大于全部種質(zhì)，且骨干種質(zhì)中穗形、主穗碼數(shù)和千粒重與全部種質(zhì)之間差異不顯著。F測驗表明，骨干種質(zhì)大部分性狀的方差大于全部種質(zhì)，說明構(gòu)建的谷子骨干種質(zhì)遺傳冗余度明顯減小，變異率更高，全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)的差異未達到顯著水平，說明構(gòu)建的骨干種質(zhì)能代表全部種質(zhì)。

表3 全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)19個表型性狀平均值和方差的比較Table 3 Comparison of means and variances for ninteen traits in all germplasm and backbone germplasm

表3(續(xù))

2.3 極差、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)及變異系數(shù)的比較評價

由表4可知，谷子全部種質(zhì)質(zhì)量性狀的極差變異范圍全部保留在骨干種質(zhì)中；數(shù)量性狀變異范圍除單穗重(67.77%)、穗粗(77.09%)、千粒重(74.68%)外，其余性狀變異范圍84.66%～99.96%保留在了骨干種質(zhì)中。骨干種質(zhì)平均H′和CV分別為1.76±0.154和37.52±5.765，H′顯著高于全部種質(zhì)(P=0.004)，變異系數(shù)差異不顯著(P=0.356)。

2.4 分布頻率及表型保留比例的比較評價

由表5可知，骨干種質(zhì)覆蓋了全部種質(zhì)的表型分級?？ǚ綔y驗結(jié)果表明，表型差異均未達顯著水平，說明骨干種質(zhì)代表了全部種質(zhì)的變異，穗形的表型保留比例較大,可能是由于補充了一些特殊種質(zhì)和極端材料所致;其余性狀的表型保留比例均比較合適,表明骨干種質(zhì)保留了全部種質(zhì)豐富的變異,且豐度更高。

2.5 谷子骨干種質(zhì)的確認

由圖1可知，谷子全部種質(zhì)中存在大量樣本重疊和遺傳背景相似性，群體的遺傳冗余程度高，尤其坐標軸原點(0,0)交叉處樣本密度大，重疊程度高，經(jīng)篩選后谷子骨干種質(zhì)樣品主成分分布圖保留了谷子全部種質(zhì)的外部輪廓特征，降低了樣本之間交叉重疊(圖1(b))，樣本的分布和密度明顯減低，且較多外圍的個體入選到骨干種質(zhì)中，構(gòu)建的谷子骨干種質(zhì)既去除了全部種質(zhì)的大部分遺傳冗余，又確保了骨干種質(zhì)的代表性。因此，所構(gòu)建的骨干種質(zhì)能夠覆蓋全部種質(zhì)的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，表明骨干種質(zhì)的構(gòu)建是有效的。

表4 全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)極差、變異系數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)的比較Table 4 Comparison of range,coefficient of variation and genetic diversity index of all germplasm and backbone germplasm

表5 全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)表型性狀的分布頻率和表型保留比例的比較Table 5 Comparison of the distribution frequency and phenotypic retention ratio of traits between all germplasm and backbone germplasm

表5(續(xù))

圖1 全部(a)與骨干種質(zhì)(b)的樣品主成分分布圖Fig.1 Principal component plots for the all (a) and backbone germplasm (b)

由圖2可知，在8個產(chǎn)量性狀表型數(shù)據(jù)中，全部種質(zhì)和骨干種質(zhì)的主穗長度、主莖單穗重、主莖單穗粒重、穗粗、千粒重、單株穗重、單株粒重、主穗碼數(shù)分布均呈正態(tài)分布，且構(gòu)建的谷子骨干種質(zhì)與全部種質(zhì)分布趨勢一致。因此，構(gòu)建的骨干種質(zhì)很好地保留了全部種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，確保了骨干種質(zhì)的有效性。

由圖3可知，谷子田間農(nóng)藝性狀包括幼苗葉色、葉面積、穗姿、穗形、穗下節(jié)間長度、生育期、刺毛顏色、草重、株高、幼苗葉姿、主莖節(jié)數(shù)在全部種質(zhì)和骨干種質(zhì)中都表現(xiàn)出廣泛的變異，且大部分變異的分布頻率較為一致，均基本符合正態(tài)分布，因此，構(gòu)建的118份谷子骨干種質(zhì)能夠有效覆蓋全部種質(zhì)的遺傳多樣性和全部群體結(jié)構(gòu)。

2.6 不同表型性狀間相關(guān)分析

由表6和表7可知，構(gòu)建的谷子骨干種質(zhì)與全部種質(zhì)表型性狀之間相關(guān)性一致。全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)在葉面積、草重、單株穗重、主莖單穗重、主莖單穗粒重、單株粒重性狀都表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)，均可作為高產(chǎn)育種的決策指標。

(a)、(c)、(e)、(g)、(i)、(k)、(m)、(o)分別為谷子全部種質(zhì)的主穗長、主莖單穗重、主莖單穗粒重、穗粗、千粒重、單株穗重、單株粒重和主穗碼數(shù)；(b)、(d)、(f)、(h)、(j)、(l)、(n)、(p)分別為谷子骨干種質(zhì)的主穗長、主莖單穗重、主莖單穗粒重、穗粗、千粒重、單株穗重、單株粒重和主穗碼數(shù)。(a),(c),(e),(g),(i),(k),(m),(o) are main spike length，spike weight of main stem，grain weight per spike of main stem，spike diameter，1 000-grain weight，spike weight per plant，grain weight per plant，yard number of main spike in all resources of foxtail millet，respectively.(b)，(d)，(f)，(h)，(j)，(l)，(n)，(p) are main spike length，spike weight of main stem，grain weight per spike of main stem，spike diameter，1 000-grain weight，spike weight per plant，grain weight per plant，yard number of main spike in backbone resources of foxtail millet，respectively.圖2 全部資源與骨干種質(zhì)的8個谷子產(chǎn)量性狀表型頻率直方圖Fig.2 Phenotypic frequency histograms of 8 millet yield traits in all resources and backbone germplasm

3 討 論

3.1 構(gòu)建谷子骨干種質(zhì)對取樣方法的選擇

確定合適的取樣方法是構(gòu)建骨干種質(zhì)的基礎(chǔ)，常見的取樣方法有優(yōu)先取樣[14-15]、偏離度取樣[16-17]和隨機取樣[18-19]。優(yōu)先取樣能保留原種質(zhì)的表型性狀極值及遺傳變異結(jié)構(gòu)；偏離度取樣可以最大范圍覆蓋原種質(zhì)資源的遺傳變異；隨機取樣策略則維持原種質(zhì)的遺傳多樣性形式[20]。劉娟等[21]使用隨機取樣和位點優(yōu)先取樣策略構(gòu)建了新疆野杏的骨干種質(zhì)資源，比較發(fā)現(xiàn)位點優(yōu)先取樣的資源多態(tài)性位點數(shù)小于隨機取樣法。鄭福順等[22]分別選用隨機取樣法、優(yōu)先取樣法、偏離度取樣法進行取樣，利用UPGMA進行聚類對480份番茄種質(zhì)資源構(gòu)建了寧夏回族自治區(qū)番茄骨干種質(zhì)資源。劉方等[23]采用UPGMA聚類分析對不同地域的103份亞洲棉進行了表型遺傳分析，將其聚類為8個組群。李洪果等[24]利用多次聚類+位點優(yōu)先取樣法+馬氏距離+最短距離法的取樣最佳策略，從306份杜仲雄性種質(zhì)中構(gòu)建了包含33份材料的杜仲雄性資源的骨干種質(zhì)。潘英華等[25]先根據(jù)地理分布將4 137份普通野生水稻進行分組，再結(jié)合SSR標記分析，進行多次UPGMA聚類，構(gòu)建了包含351份種質(zhì)的廣西普通野生水稻資源的骨干種質(zhì)。本研究選取的1 237份谷子種質(zhì)資源是在已篩選916份核心種質(zhì)[13]的基礎(chǔ)上，又從全國補充321份種質(zhì)資源，擴充資源樣本群體的遺傳多樣性，然后對谷子資源根據(jù)地理來源和穗形分成7個小組，每組種質(zhì)從9到692份不等。每組的取樣量為1～17份；UPGMA法聚類分析后隨機取樣，得到113份種質(zhì)，初步評價后補充極值材料和特殊性狀種質(zhì)5份，提取118份(9.9%)的谷子種質(zhì)資源構(gòu)建骨干種質(zhì)。本研究采用均值、方差、極差、變異系數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)、分布頻率、表型保留比例等方法對構(gòu)建的骨干種質(zhì)進行評價，構(gòu)建的骨干種質(zhì)與全部種質(zhì)間的差異不顯著，最大限度的覆蓋了谷子資源的遺傳變異，進一步驗證了聚類分析和隨機取樣谷子骨干種質(zhì)的構(gòu)建的有效性。

(a)、(c)、(e)、(g)、(i)、(k)、(m)、(o)、(q)、(s)、(u)分別為谷子全部種質(zhì)的幼苗葉色、葉面積、穗姿、穗形、穗下節(jié)間長、生育期、刺毛顏色、草重、株高、幼苗葉姿、主莖節(jié)數(shù)；(b)、(d)、(f)、(h)、(j)、(l)、(n)、(p)、(r)、(t)、(v)分別為谷子骨干種質(zhì)幼苗葉色s、葉面積、穗姿、穗形、穗下節(jié)間長、生育期、刺毛顏色、草重、株高、幼苗葉姿、主莖節(jié)數(shù)。(a)，(c)，(e)，(g)，(i)，(k)，(m)，(o)，(q)，(s)，(u) seedling color，leaf area，spike posture，spike shape，internode length，growth stage，bristle color，grass weigh，plant height，seedling leaf posture，main stem node number in all resources of foxtail millet，respectively；(b)，(d)，(f)，(h)，(j)，(l)，(n)，(p)，(r)，(t)，(v) seedling color，leaf area，spike posture，spike shape，internode length，growth stage，bristle color，grass weigh，plant height，seedling leaf posture，main stem node number in all backbone of foxtail millet，respectively.圖3 全部種質(zhì)與骨干種質(zhì)的11個谷子農(nóng)藝性狀表型頻率直方圖Fig.3 Phenotypic frequency histogram of 11 foxtail millet agronomic traits in all resources and backbone germplasm

3.2 評價及確認谷子骨干種質(zhì)

遺傳多樣性指數(shù)、表型方差、表型分布頻率、變異系數(shù)、表型保留比率等是衡量骨干種質(zhì)的重要參考[26]。Hu等[27]采用UPGMA聚類+馬氏距離分析，通過t檢驗、同質(zhì)性檢驗對168份棉花種質(zhì)資源和21份骨干種質(zhì)的11個表型性狀進行比較，證明了構(gòu)建的骨干種質(zhì)的可靠性。本研究通過t檢驗、F測驗、對骨干種質(zhì)與全部種質(zhì)進行比較分析，t測驗表明，骨干種質(zhì)H′顯著高于核心種質(zhì)(P=0.004)，變異系數(shù)在骨干種質(zhì)和全部種質(zhì)中差異不顯著(P=0.356)，說明骨干種質(zhì)的樣本足夠大，且有效去除了谷子種質(zhì)資源中的冗余，保留了骨干種質(zhì)的遺傳多樣性，變異均勻度顯著提高。Shannon-Weaver多樣性指數(shù)和變異系數(shù)表明全部種質(zhì)和骨干種質(zhì)的19個表型性狀的H′和變異系數(shù)是非常相似的，大部分性狀的變異范圍均保留在骨干種質(zhì)中。卡方測驗結(jié)果表明，骨干種質(zhì)的19個表型性狀與全部種質(zhì)之間無顯著差異，表明骨干種質(zhì)保留了全部種質(zhì)豐富的變異，且豐度更高。另外，二者在穗形性狀組成(P=0.637)和地理來源(P=0.579)上也有很好的一致性。利用主成分分析和直方圖對骨干種質(zhì)進一步確認，骨干種質(zhì)的遺傳冗余較小，離散程度和分布特點與全部種質(zhì)一致；骨干種質(zhì)的性狀變異廣泛，分布頻率與全部種質(zhì)資源較符合，進一步驗證了骨干種質(zhì)良好的代表性和有效性。表型性狀相關(guān)性分析表明，產(chǎn)量性狀表型中葉面積、草重、單株穗重、主莖單穗重、主莖單穗粒重、單株粒重等性狀在骨干種質(zhì)和全部種質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，骨干種質(zhì)和全部種質(zhì)的葉面積與草重(r=0.282**、r=0.349**)、單株穗重(r=0.290**、r=0.289**)、單株穗粒重(r=0.339**、r=0.317**)均呈極顯著正相關(guān)，在育種過程中，優(yōu)先選擇時葉面積和生物量大的單株，5～6代穩(wěn)定后測量產(chǎn)量。優(yōu)先篩選與其產(chǎn)量極顯著正相關(guān)的易測量田間性狀，關(guān)聯(lián)出復雜數(shù)量性狀，從而便捷的實現(xiàn)育種目標。

4 結(jié) 論

基于地理來源和穗形分組，平方根法確定取樣量，組內(nèi)按表型數(shù)據(jù)進行UPGMA聚類分析，類內(nèi)隨機取樣，構(gòu)建了中國谷子地方品種的118份骨干種質(zhì)，占全部資源的9.9%，其性狀的均值、方差、極差、變異系數(shù)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)、表型保留比例等與全部種質(zhì)的差異不顯著，地理生態(tài)區(qū)和穗形分布一致，保持了中國谷子種質(zhì)資源豐富的表型分布頻率和表型相關(guān)性。主成分分析和直方圖結(jié)果也進一步確認了骨干種質(zhì)的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)與全部種質(zhì)的一致。因此，本研究構(gòu)建的骨干種質(zhì)具有很好的代表性。