黃瓜YABBYs家族及CsYAB1a基因功能初探
2022-11-07 03:20程志華張小蘭趙劍宇
應(yīng) 奧 程志華 張小蘭 趙劍宇
(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/設(shè)施蔬菜生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)
黃瓜(Cucumis
sativus
L.)是世界廣泛種植的蔬菜作物，屬葫蘆科黃瓜屬1年生草本植物。我國(guó)是世界第一大黃瓜生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，據(jù)FAO數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，2020年我國(guó)黃瓜產(chǎn)量達(dá)到7 336萬(wàn)t，占世界總產(chǎn)量的81.2%。黃瓜產(chǎn)量與其花及果實(shí)發(fā)育過(guò)程息息相關(guān)。研究表明，種子植物中特有的YABBYs
家族在開(kāi)花植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。迄今為止，YABBYs
家族成員已在番茄(Solanum
lycopersicum
L.)、水稻(Oryza
sativa
L.)、小白菜(Brassica
rapa
ssp.chinensis
)、葡萄(Vitis
pseudoreticulata
andVitis
vinifera
L.)、棉花(Gossypium
hirsutum
L.)、玉米(Zea
mays
L.)、白菜(Brassica
campestris
L. ssp.chinensis
var.parachinensis
)和小麥(Triticum
aestivum
L.)等多個(gè)物種中被鑒定和研究。黃瓜CsYAB5
和CsCRC
基因分別被報(bào)道參與黃瓜的維管模式和形態(tài)建成以及果實(shí)長(zhǎng)度的調(diào)控，然而除此之外針對(duì)黃瓜YABBYs
家族其他成員的研究報(bào)道相對(duì)較少。因此，鑒定黃瓜YABBYs
家族成員并探究它們調(diào)控黃瓜生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。YABBY
基因是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，屬于鋅指蛋白家族，由2個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域組成：N端C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和C端螺旋-環(huán)-螺旋(Helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)域(稱為YABBY結(jié)構(gòu)域)。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，它們被分為5個(gè)亞家族：CRABS CLAW (CRC)、FILAMENTOUS FLOWER(FIL，又名YABBY1)/YABBY3(YAB3)、INNER NO OUTER(INO，又名YABBY4)、YABBY2(YAB2)和YABBY5(YAB5)。YAB1和YAB3可能源于1次基因復(fù)制事件，同屬1個(gè)亞家族。5個(gè)亞家族在早期被子植物類群(即ANA：無(wú)油樟目(Amborellales)、睡蓮目(Nymphaeales)和木蘭藤目(Austrobaileyales))的出現(xiàn)表明開(kāi)花植物的共同祖先至少含有5個(gè)YABBYs
基因。擬南芥(Arabidopsis
thaliana
)的YABBYs
家族包含6個(gè)成員：CRC
、YAB4
、YAB1
、YAB3
、YAB2
和YAB5
基因。YAB1
、YAB2
、YAB3
和YAB5
基因是“營(yíng)養(yǎng)YABBYs
基因”，主要參與側(cè)生器官的極性發(fā)育、邊緣的形成、葉片的成熟和莖尖分生組織的發(fā)育并且調(diào)控葉序性；CRC
和YAB4
基因是“生殖YABBYs
基因”，分別在發(fā)育中的心皮和胚珠外珠被特異表達(dá)。YABBYs
家族參與脅迫響應(yīng)、葉緣和近軸極性的建立以及器官發(fā)育等過(guò)程的調(diào)控。黃瓜YABBYs
家族的CsYAB5
基因在葉片、花瓣和雄蕊原基的遠(yuǎn)軸端以及葉脈維管組織表達(dá)，調(diào)控黃瓜的維管模式和形態(tài)建成過(guò)程；而CsCRC
基因在心皮和蜜腺的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中在遠(yuǎn)軸端持續(xù)表達(dá)，參與調(diào)控黃瓜果實(shí)的伸長(zhǎng)。番茄和金魚(yú)草(Antirrhinum
majus
L.)的YABBY
基因與擬南芥YABBY
基因的功能類似,但一些單子葉植物(例如玉米和水稻)的YABBY
基因不能參與極性調(diào)控，與擬南芥YABBY
基因的功能差異較大。例如，AtYAB2
和AtCRC
的水稻同源基因OsYAB1
和DROOPING
LEAF
(DL
)在花器官未表現(xiàn)出極性表達(dá)模式。除了影響器官發(fā)育，YABBY
基因還參與脅迫反應(yīng)的調(diào)控。例如，菠蘿(Ananas
comosus
)AcYAB4
基因參與植物耐鹽性的調(diào)控，大豆(Glycine
max
)GmYAB10
基因與高鹽和干旱脅迫有關(guān)，南瓜(Cucurbita
moschata
)YABBY
基因?qū)}脅迫處理有響應(yīng)。此外，YABBY
基因還受到生長(zhǎng)素和赤霉素等激素的調(diào)控。本研究以黃瓜YABBYs
家族成員為切入點(diǎn)，通過(guò)同源比對(duì)、理化性質(zhì)統(tǒng)計(jì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、染色體位置繪制、基因結(jié)構(gòu)分析和時(shí)空表達(dá)分析等方法，旨在對(duì)黃瓜YABBY
s基因進(jìn)行鑒定和分析，同時(shí)結(jié)合異源轉(zhuǎn)化擬南芥試驗(yàn)，以期對(duì)CsYAB1a
基因的生物功能進(jìn)行初步探究，為進(jìn)一步在黃瓜中進(jìn)行深入研究提供理論基礎(chǔ)。1 材料與方法
1.1 試驗(yàn)材料
1
.1
.1
植物材料以黃瓜高代自交系品種‘新泰密刺’為試驗(yàn)材料。55～60 ℃溫湯浸種30 min后，將充分泡脹的種子均勻擺放在事先鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)的濕潤(rùn)濾紙上，于28 ℃暗培養(yǎng)催芽24～36 h，期間保持濾紙濕潤(rùn)。選擇下胚軸1～3 cm長(zhǎng)的種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽，置于24 ℃光照培養(yǎng)室中生長(zhǎng)(16 h光照/8 h黑暗)，待黃瓜幼苗長(zhǎng)至兩葉一心后定植于溫室。黃瓜材料用于RNA提取實(shí)驗(yàn)和原位雜交實(shí)驗(yàn)，分別用液氮和Formalin-Aceto-Alcohol(FAA)固定液保存，置于-80和4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>以
Columbia
(Col
)生態(tài)型擬南芥為試驗(yàn)材料。4 ℃黑暗春化處理3 d后，在超凈臺(tái)中用體積比為3%的次氯酸鈉水溶液消毒，播種于Murashige and Skoog(MS)固體培養(yǎng)基，置于24 ℃光照培養(yǎng)室中生長(zhǎng)(16 h光照/8 h黑暗)。約10 d后，待其長(zhǎng)出2片真葉后移栽到土壤培養(yǎng)基質(zhì)(m
(草炭)∶m
(蛭石)≈1∶1)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。1
.1
.2
試劑與菌株定量實(shí)驗(yàn)試劑：EastepSuper總RNA提取試劑盒(目錄號(hào)：LS1040)購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)astKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑(目錄號(hào)：KR118)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，TB GreenPremix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus) (目錄號(hào)：RR820A)購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。
構(gòu)建載體試劑：質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)(目錄號(hào)：DP103)購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI購(gòu)于NEB(北京)有限公司，2×PhantaMax Master Mix (Dye Plus)(目錄號(hào)：P525)、FastPureGel DNA Extraction Mini Kit(產(chǎn)品目錄號(hào)：DC301)和ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit(產(chǎn)品目錄號(hào)：C113)購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，2×Es Taq MasterMix (Dye)(目錄號(hào)：CW0690)購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。
原位雜交試劑：DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)購(gòu)于上海羅氏制藥有限公司。
載體和感受態(tài)細(xì)胞：雙元植物農(nóng)桿菌表達(dá)載體pBI121為本實(shí)驗(yàn)室保存，DH5α Chemically Competent Cell(目錄號(hào)：KTSM101L)購(gòu)于深圳康體生命科技有限公司，GV3101根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞(目錄號(hào)：ZC141)購(gòu)于北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。
1.2 試驗(yàn)方法
1
.2
.1
黃瓜YABBYs
基因的鑒定分別在擬南芥基因庫(kù)TAIR(https:∥www.arabidopsis.org/)和黃瓜基因庫(kù)CuGenDB(http:∥cucurbitgenomics.org/)查找并保存擬南芥和黃瓜YABBYs
家族全部成員的基因組、CDS、氨基酸序列、黃瓜7條染色體長(zhǎng)度以及黃瓜YABBYs
家族成員在染色體的位置信息用于后續(xù)分析(表1)。利用黃瓜基因庫(kù)的BLAST工具(http:∥cucurbitgenomics.org/blast)進(jìn)行BLASTp比對(duì)，篩選標(biāo)準(zhǔn)為E
-value1
.2
.2
擬南芥和黃瓜YABBYs
基因的分析利用ExPaSy的ProtParam工具(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析基因的理化性質(zhì)，利用軟件MEGAX構(gòu)建家族進(jìn)化樹(shù)。其中，通過(guò)Clustal W工具進(jìn)行多序列比對(duì)，采用NJ鄰接法Bootstrap重復(fù)1 000次；利用Gene Structure Display Serve 2.0(http:∥gsds.gao-lab.org/)分析基因結(jié)構(gòu)；利用UGENE軟件分析保守結(jié)構(gòu)域，將氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果修剪整齊后上傳MEME(http:∥meme-suite.org)分析保守基序；通過(guò)MG2C_v2.1(http:∥mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制基因在染色體上的位置。
1
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黃瓜YABBY基因家族成員的表達(dá)分析使用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取黃瓜各部位RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，RNA和cDNA分別置于-80和-20 ℃保存?zhèn)溆?實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書)。使用TB Green酶，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)情況。黃瓜樣品內(nèi)參基因?yàn)?p>Ubiquitinextension
protein
(UBI
)，擬南芥樣品內(nèi)參基因?yàn)?p>ACTIN2。利用NCBI的Primer designing工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)熒光定量引物。通過(guò)2法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)采用3次技術(shù)重復(fù)，3次生物學(xué)重復(fù)(引物序列見(jiàn)表2)。1
.2
.4
黃瓜CsYAB1a
基因的原位雜交實(shí)驗(yàn)取黃瓜樣品置于3.7% FAA固定液中4 ℃保
表1 本研究所涉及基因的信息
Table 1 Gene information used in this study
基因Gene name物種Species基因號(hào)LocusCsYAB1aCucumis sativusCsaV3_5G003950CsYAB1bCucumis sativusCsaV3_3G003040CsYAB2Cucumis sativusCsaV3_6G038650CsYAB4aCucumis sativusCsaV3_5G031440CsYAB4bCucumis sativusCsaV3_2G024750CsYAB5aCucumis sativusCsaV3_2G002960CsYAB5bCucumis sativusCsaV3_1G030340CsCRCCucumis sativusCsaV3_5G033400UBICucumis sativusCsaV3_5G031430AtYAB1Arabidopsis thalianaAT2G45190AtYAB2Arabidopsis thalianaAT1G08465AtYAB3Arabidopsis thalianaAT4G00180AtYAB4Arabidopsis thalianaAT1G23420AtYAB5Arabidopsis thalianaAT2G26580AtCRCArabidopsis thalianaAT1G69180AtAGArabidopsis thalianaAT4G18960AtALCArabidopsis thalianaAT5G67110AtAP1Arabidopsis thalianaAT1G69120AtAP3Arabidopsis thalianaAT3G54340AtAS1Arabidopsis thalianaAT2G37630AtAS2Arabidopsis thalianaAT1G65620AtCALArabidopsis thalianaAT1G26310AtCLV3Arabidopsis thalianaAT2G27250AtFTArabidopsis thalianaAT1G65480AtFULArabidopsis thalianaAT5G60910AtHANArabidopsis thalianaAT3G50870AtHEC3Arabidopsis thalianaAT5G09750AtINDArabidopsis thalianaAT4G00120AtKAN1Arabidopsis thalianaAT5G16560AtKAN2Arabidopsis thalianaAT1G32240AtLFYArabidopsis thalianaAT5G61850AtPIArabidopsis thalianaAT5G20240AtSHP1Arabidopsis thalianaAT3G58780AtSHP2Arabidopsis thalianaAT2G42830AtSPLArabidopsis thalianaAT4G27330AtSPTArabidopsis thalianaAT4G36930AtSUPArabidopsis thalianaAT3G23130AtTFL1Arabidopsis thalianaAT5G03840AtWOX1Arabidopsis thalianaAT3G18010AtWUSArabidopsis thalianaAT2G17950AtYUC11Arabidopsis thalianaAT1G21430ACTIN2Arabidopsis thalianaAT3G18780
存，用曙紅染色，依次將樣品浸泡在FAA水溶液、酒精梯度、二甲苯和石蠟中，最終用石蠟包埋。將石蠟塊切成10 μm的切片，在37 ℃水中展片，42 ℃過(guò)夜烘片，烘干的石蠟切片4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>從
CsYAB1a
基因組序列中選取1段約500 bp的特異片段，以此設(shè)計(jì)引物CsYAB1a
-probe-F/R。以cDNA為模版，使用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物回收。以回收產(chǎn)物為模版，使用引物CsYAB1a
-SP6和CsYAB1a
-T7為其加上SP6和T7 酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠驗(yàn)證后回收，回收產(chǎn)物即為探針模版。使用地高辛RNA標(biāo)記試劑盒合成探針，SP6 探針作為負(fù)對(duì)照。將石蠟切片依次進(jìn)行脫蠟、去蛋白、乙?；兔撍幚砗螅筇结?0 ℃過(guò)夜，使探針與目的片段結(jié)合。洗去探針，封閉處理后與抗體共孵育，最后洗去抗體。在避光情況下，使用5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate(BCIP)和Nitro blue tetrazolium chloride(NBT)染色處理，3 d后用顯微鏡觀察樣品組織染色情況。樣品組織的識(shí)別參照Bai等，原位雜交實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hang等。
1
.2
.5
黃瓜CsYAB1a
基因的克隆使用基因克隆引物CsYAB1a
-clone-F/R克隆CsYAB1a
基因CDS序列全長(zhǎng)，跑膠驗(yàn)證后回收?；厥债a(chǎn)物命名為CsYAB1a
-clone，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?p>1.2
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黃瓜CsYAB1a
基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化使用質(zhì)粒提取試劑盒從大腸桿菌中提取雙元植物農(nóng)桿菌表達(dá)載體pBI121質(zhì)粒，使用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI對(duì)pBI121進(jìn)行雙酶切。以膠回收產(chǎn)物CsYAB1a
-clone為模版，使用引物CsYAB1a
-clone-XbaI-F和CsYAB1a
-clone-BamHI-R為基因的CDS序列添加同源臂接頭。使用同源重組酶將切開(kāi)的載體和帶有同源臂接頭的基因片段進(jìn)行同源重組，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)。篩選陽(yáng)性克隆送至生工生物工程股份有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為載體35S啟動(dòng)子上特異片段35S-F和CsYAB1a
-clone-R。將返還的測(cè)序正確的CsYAB1a
-OX質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至GV3101根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)農(nóng)桿菌蘸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥。1
.2
.7
轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株的篩選與鑒定收獲農(nóng)桿菌侵染的擬南芥T代植株種子，使用含40 mg/L硫酸卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。提取T代擬南芥葉片DNA進(jìn)行PCR鑒定，鑒定引物為35S-F和CsYAB1a
-clone-R。對(duì)表型發(fā)生變化的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行單株收種，再次播種后即為T代轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)其進(jìn)行表型觀察和表達(dá)分析。表2 本研究所使用的引物序列
Table 2 Primer sequences used in this study
引物用途Purposes ofprimers名稱Name序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)CsYAB1a-clone-FATGTCATCATCTTCTTGCTCATCCsYAB1a-clone-RTTAGAAATGGGAGACACCAACA克隆CsYAB1a基因CloningCsYAB1a gene CsYAB1a-clone-XbaI-FGAGAACACGGGGGACTCTAGAATGTCATCATCTTCTTGCTCATCCsYAB1a-clone-BamHI-RGGACTGACCACCCGGGGATCCTTAGAAATGGGAGACACCAACA35S-FGTAAGGGATGACGCACAATCqCsYAB1a-FTGATGAGCTCCCTAGGCCACqCsYAB1a-RCTTAGCAGCGGCACTGAAGGqCsYAB1b-FACTGGGCTCATTTCCCTCACAqCsYAB1b-RTTCTCTCCCCCTTGTTGCCCqCsYAB2-FAGAAGCCTTTAGCACAGCAGCqCsYAB2-RGGTGGCAGAAACCCATTGGAGqCsYAB4a-FCCATCTCTTTGATCTGCCCGAqCsYAB4a-RGACTCGAGCAATGGCCACAC黃瓜熒光定量RT-qPCRin cucumberqCsYAB4b-FCCCGGAGAAGAAACAGCGAGqCsYAB4b-RCTCCTTCAGCATTGACTGGCGqCsYAB5a-FACCCACAGGGAAGCCTTCAGqCsYAB5a-RCTCAGATCCATCATTCTTACTCTGCqCsYAB5b-FGGGAAGCATTCAGTACGGCAGqCsYAB5b-RAGCCCTTGGCATTAAACGCTqCsCRC-FTCGAAAGGGTGCTTCCACATCTqCsCRC-RTCTGGGTTTGCAGCTTTGATACGqUBI-FCACCAAGCCCAAGAAGATCqUBI-RTAAACCTAATCACCACCAGCqCsYAB1a-FTGATGAGCTCCCTAGGCCACqCsYAB1a-RCTTAGCAGCGGCACTGAAGGqAtAG-FATAATCAGCATACAAAACTCCAACqAtAG-RATACTTCTCTCTAATCTGCCTTCCqAtALC-FTCCAGACTTTAGCCGTTATGAATGqAtALC-RAGCACATTCCTTGACTTGTTTTAGqAtAP1-FGTTGCTCTTGTTGTCTTCTCCCqAtAP1-RCTCCATCGACCAGTTTGTATTGqAtAP3-FTATTTCTGATGTCGATGTTTGGGCqAtAP3-RACTTTTGTTCTTTTTCTTGGTGGTqAtAS1-FCAGAGGAAGAGCAGAGGCTTGqAtAS1-RCTTCCCACCACTTCCCTAACCqAtAS2-FTGCGCCGCTTGCAAATqAtAS2-RAAATAGGGCGCGAATACACATTqAtCAL-FGGAGAGAAACCAAAGGCATTATCqAtCAL-RTCCTTTCTTTGGAGGTGGTTGAqAtCLV3-FATGGAGAAGCAGAGAAGGCAAAqAtCLV3-RGGGTTCACATGATGGTGCAAqAtCRC-FCTCTCGTTTCTCACCACAACTC
表2(續(xù))
引物用途Purposes ofprimers名稱Name序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)qAtCRC-RGCTTCTTCTCAGGAGGTTTGACqAtFT-FAACCCTCACCTCCGAGAATATCqAtFT-RTGCCAAGCTGTCGAAACAATATqAtFUL-FAAGAAAGAACCAAGCTATGTTCGqAtFUL-RGGAGGTTACGCAGTATTGAGGCqAtHAN-FTCTCCGCTAACAAGCCAAGTqAtHAN-RGAGCCCACGGAGTACCATTAqAtHEC3-FAGGGAAATGAGAAGAAGAGAAAGGqAtHEC3-RATGAATAATTATAATATGAACCCATCTC擬南芥熒光定量RT-qPCRin ArabidopsisqAtIND-FAAGATCCGAATTCTCAAGAGGATCqAtIND-RAGGGTTGGGAGTTGTGGTAATAAqAtKAN1-FGATCCAGCATTCAAAATCAGGqAtKAN1-RTCCAAATTGATCAAGAAAGTCAqAtKAN2-FTTTGCATGGGAAGTTAATCGqAtKAN2-RTTGTTCCCGAGATGCTTGATqAtLFY-FCATATCTTTCGTTGGGAGCTTCTTGqAtLFY-RCTGAATACTTGGTTCGTCACCTTGqAtPI-FCTTACAACTGGAGCTCAGGCAqAtPI-RGCTCGAGATTAAGACACACAGqAtSHP1-FATACAAGGGACGACAGTTTACGAAqAtSHP1-RCACAAGTTGAAGAGGAGGTTGGTqAtSHP2-FTCTCCGCTCCAAGATTACTGAAqAtSHP2-RCCGACTGGTGAGAAGAAGTAACAqAtSPL-FCTTGGGAAGCCTTGTAGCACqAtSPL-RAGCTCGAGCGTCAGAGAATCqAtSPT-FTCACTTTGGACCTTTCCCTCTCqAtSPT-RCTTTTAGGTCAGGTTGTCCATCqAtSUP-FTTTCTCCTCCATCCTCACCAAGqAtSUP-RTAATCAAACCAATCTCAAGCTCqAtTFL1-FGCTCTTTCCTTCTTCTGTTTCCTCCqAtTFL1-RCAGCGGTTTCTCTTTGTGCGTqAtWOX1-FCTGGATATGTTCGGTCGGATGqAtWOX1-RCTCCACCCGTATATTCGCTGqAtWUS-FGGCTGAGACAGTTCGGAAAGATTqAtWUS-RAGTTGGGTGATGAAGATGGTGTGqAtYUC11-FGGAAACACCAAAAATGTGGACTCqAtYUC11-RACCATTCTTCCCCTTCCAGTGqACTIN2-FCCTTCGTCTTGATCTTGCGGqACTIN2-RAGCGATGGCTGGAACAGAACCsYAB1a-probe-FCAATAGATGATCCAATATTATTCAAAA克隆原位雜交探針Cloning probesused for in situhybridizationCsYAB1a-probe-RGTTATGAGAAGGAGAAAAGAAAGAATCsYAB1a-SP6GATTTAGGTGACACTATAGAATGCTCAATAGATGATCCAATATTATTCsYAB1a-T7TGTAATACGACTCACTATAGGGGTTATGAGAAGGAGAAAAGAAA
1
.2
.8
黃瓜YABBYs
基因啟動(dòng)子的響應(yīng)元件分析與外源激素噴施處理在黃瓜基因組文件(從黃瓜基因庫(kù)CuGenDB下載)找到各基因的啟動(dòng)子序列(ATG前3 kb序列)，通過(guò)PlantCARE網(wǎng)站(http:∥bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析激素響應(yīng)元件。對(duì)黃瓜雌花芽進(jìn)行外源激素噴施處理，共分為3組：脫落酸組(200 mg/L)、生長(zhǎng)素組(50 mg/L)和空白對(duì)照組(CK)。向各組添加體積比為0.5%的表面活性劑吐溫20以促進(jìn)噴施液的附著。噴施前及噴施后1、3、6、12、24和48 h取雌花芽用于檢測(cè)基因表達(dá)量的變化。激素處理實(shí)驗(yàn)參照Cheng等。
2 結(jié)果與分析
2.1 黃瓜YABBYs家族成員鑒定
將擬南芥YABBYs
家族6個(gè)成員的蛋白質(zhì)序列在黃瓜基因組庫(kù)中進(jìn)行BLASTp比對(duì)，獲得8個(gè)黃瓜YABBYs
家族成員。將這8個(gè)基因在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行反向BLASTp比對(duì)，根據(jù)蛋白相似度依次命名。利用NCBI的Conserved domain search工具確定黃瓜YABBYs
家族成員均含有YABBY超家族結(jié)構(gòu)域。統(tǒng)計(jì)黃瓜YABBYs蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果如表3所示?；虻入婞c(diǎn)集中在7.15～9.51，即黃瓜YABBYs蛋白分子或者表面不帶電荷時(shí)pH>7；脂肪族氨基酸系數(shù)集中在60.23～81.14；親水系數(shù)均<0，表明黃瓜YABBYs蛋白全部為親水蛋白。表3 黃瓜基因的基本信息
Table 3 Basic information on genes
基因名稱Gene name基因號(hào)Locus氨基酸數(shù)目/aaNumber ofaminoacids分子量Molecularweight等電點(diǎn)TheoreticalpI脂肪族指數(shù)Aliphaticindex親水系數(shù)Grand average ofhydropathicity(GRAVY)CsYAB1aCsaV3_5G00395024827 424.928.6667.98-0.408CsYAB1bCsaV3_3G00304018520 590.388.8565.89-0.394CsYAB2CsaV3_6G03865017319 261.859.5165.95-0.609CsYAB4aCsaV3_5G03144021424 622.287.1572.85-0.357CsYAB4bCsaV3_2G02475035239 477.619.3881.14-0.496CsYAB5aCsaV3_2G00296019221 526.248.8867.60-0.542CsYAB5bCsaV3_1G03034019321 678.747.5677.82-0.264CsCRCCsaV3_5G03340017519 293.618.7160.23-0.550
2.2 黃瓜YABBYs基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析
構(gòu)建擬南芥和黃瓜YABBYs
家族進(jìn)化樹(shù)并分析基因結(jié)構(gòu)(圖1)，14個(gè)基因被劃分為5個(gè)亞家族，依次為：YAB1/YAB3、YAB5、YAB2、CRC和YAB4。每個(gè)基因包含6～7個(gè)外顯子。以上結(jié)果表明，黃瓜和擬南芥YABBYs
基因在基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系上具有相似性和保守性。2.3 黃瓜YABBYs基因結(jié)構(gòu)域及保守氨基酸分析
黃瓜YABBYs
家族的8個(gè)成員均含有YABBY超家族結(jié)構(gòu)域，它由C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和YABBY結(jié)構(gòu)域組成(圖2(a))。其中C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域(圖2(b))由半胱氨酸、纈氨酸和亮氨酸等保守氨基酸組成，YABBY結(jié)構(gòu)域(圖2(c))由脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和賴氨酸等保守氨基酸組成。說(shuō)明黃瓜YABBYs
基因在蛋白結(jié)構(gòu)上比較保守，可能和其他物種的YABBYs
基因有相似的生物學(xué)功能。2.4 黃瓜YABBYs基因染色體定位
8個(gè)黃瓜YABBYs
基因分布在5條染色體上。5號(hào)染色體上包含的基因最多，為3個(gè)，分別為CsYAB1a
、CsYAB4a
和CsCRC
；1、3和6號(hào)染色體上均只包含1個(gè)基因，分別為CsYAB5b
、CsYAB1b
和CsYAB2
(圖3)。
紅色三角形和綠色圓形分別代表來(lái)自黃瓜和擬南芥中的YABBYs基因。 Red triangles and green circles represent YABBYs gene from cucumber and Arabidopsis， respectively.圖1 黃瓜和擬南芥YABBYs基因的進(jìn)化分析和結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Evolutionary and structural analyses of YABBYs gene in cucumber and Arabidopsis
(a)黃瓜YABBYs基因的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果；(b)C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域；(c)YABBY結(jié)構(gòu)域。相同或相似的氨基酸用深或淺紫色表示，C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和YABBY結(jié)構(gòu)域用黑色框標(biāo)出，C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域中的典型氨基酸殘基用紅色星號(hào)表示。(a) Amino acid sequence alignment results of CsYABBYs genes; (b) C2C2 zinc finger domain; (c) YABBY domain. The same or similar amino acids were shown in dark or light purple, the C2C2 zinc finger domain and the YABBY domain were marked in black boxes, and typical amino acid residues within the C2C2 domain were indicated with red asterisks.圖2 黃瓜YABBYs基因的氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Alignment of amino acid sequences of CsYABBYs gene
2.5 黃瓜YABBYs基因表達(dá)模式分析
為探究8個(gè)YABBYs
基因在黃瓜不同組織部位的表達(dá)情況，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)黃瓜幼嫩的莖、葉、雄花芽、雌花芽、雄花、雌花和開(kāi)花當(dāng)天子房共7個(gè)部位進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)(圖4)。結(jié)果表明，黃瓜YABBYs
基因均能在生殖器官中檢測(cè)到表達(dá)。其中，擬南芥中2個(gè)生殖YABBYs
基因的黃瓜同源基因CsYAB4a
、CsYAB4b
以及CsCRC
分別在子房或花芽特異表達(dá)；5個(gè)營(yíng)養(yǎng)YABBYs
基因的黃瓜同源基因則在7個(gè)部位中幾乎均能檢測(cè)到表達(dá)；而擬南芥中參與果實(shí)開(kāi)裂過(guò)程的FIL
基因的黃瓜同源基因CsYAB1a
主要在花芽、葉片和子房中表達(dá)。根據(jù)上述結(jié)果推測(cè)，黃瓜YABBYs
基因可能會(huì)影響黃瓜的生殖發(fā)育過(guò)程。
圖3 黃瓜YABBYs基因的染色體定位Fig.3 Chromosomal mapping of CsYABBYs genes
MFB：各種大小混合的雄花芽；FFB：肉眼可見(jiàn)的雌花芽；MF：開(kāi)花當(dāng)天的雄花；FF：開(kāi)花當(dāng)天的雌花；Ovary：開(kāi)花當(dāng)天的雌花子房。誤差線為技術(shù)學(xué)重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)差。 MFB: Male flower buds of various sizes mixed; FFB: Female flower buds visible to the naked eye; MF: Male flowers on the day of flowering; FF: Female flowers on the day of flowering; Ovary: Ovaries of female flowers on the day of flowering. The error line was the standard deviation between technical repetitions.圖4 黃瓜YABBYs基因在不同部位的表達(dá)情況Fig.4 Expression of CsYABBYs genes in different tissues
2.6 黃瓜CsYAB1a基因時(shí)空表達(dá)模式分析
熒光定量結(jié)果表明，CsYAB1a
基因主要在花芽、葉片和子房中表達(dá)(圖4(a))。通過(guò)原位雜交技術(shù)對(duì)CsYAB1a
基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行探究發(fā)現(xiàn)，CsYAB1a
基因在花原基遠(yuǎn)軸端(圖5(a)和(b))、雌雄花芽的花瓣原基(圖5(c)和(e)～(f’))，以及雌花芽的子房外果皮(圖5(f)和(f”))有較強(qiáng)富集。上述結(jié)果表明，CsYAB1a
基因可能參與花和果實(shí)的發(fā)育調(diào)控。
(a)～(b)頂點(diǎn)的花原基;(c)早期雄花芽的花瓣原基;(e)～(e’)雄花芽的花瓣原基;(f)～(f”)雌花芽的花瓣原基和子房外果皮。(e’)、(f’)和(f”)分別為(e)和(f)中紅虛線框的放大圖；(d)和(g)SP6負(fù)對(duì)照。標(biāo)尺=100 μm。(a)-(b) Floral primordium of tips； (c) Petal primordium of early male flower buds； (e)-(e’) Petal primordium of male flower buds； (f)-(f”) Petal primordium and the ovary exocarp of female flower bud. (e’), (f’) and (f”) The enlarged images of the red dotted line box in (e) and (f), respectively; (d) and (g) SP6 were negative control. Scale bars=100 μm.圖5 CsYAB1a基因在頂點(diǎn)和花芽的時(shí)空表達(dá)模式Fig.5 Spatio-temporal expression patterns of CsYAB1a gene at tips and flower buds
2.7 35S::CsYAB1a異源過(guò)表達(dá)擬南芥表型鑒定及分析
為深入研究CsYAB1a
基因的生物學(xué)功能，本研究構(gòu)建了35S
::CsYAB1a
過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至野生型擬南芥Col
中進(jìn)行異源過(guò)表達(dá)，最終篩選得到了8個(gè)表型發(fā)生明顯變化的T代株系(標(biāo)記為#1～#8)，挑選代表性株系#4、#2和#5進(jìn)行后續(xù)取樣鑒定和表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。熒光定量結(jié)果顯示CsYAB1a
基因在黃瓜花芽和葉片中均有較高的表達(dá)水平(圖4(a))。因此，本研究檢測(cè)了CsYAB1a
基因在野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的莖尖分生組織(SAM)和幼嫩蓮座葉的表達(dá)水平。結(jié)果表明，CsYAB1a
基因在過(guò)表達(dá)擬南芥的SAM和葉片中均有表達(dá)，且在#4、#2和#5株系中表達(dá)量依次升高。與此同時(shí)，過(guò)表達(dá)擬南芥的蓮座葉、花和果實(shí)均出現(xiàn)了顯著的表型變化。例如：蓮座葉由野生型的橢圓形變?yōu)榕樞稳~(葉形指數(shù)=葉長(zhǎng)/葉寬>3)，過(guò)表達(dá)擬南芥的蓮座葉更為細(xì)長(zhǎng)(平均長(zhǎng)寬分別為野生型的0.6和0.4倍)，同時(shí)葉片向遠(yuǎn)軸端(葉背面)卷曲(圖6(a))。此外，過(guò)表達(dá)擬南芥的總狀花序包含更多的花(圖6(b))。
(a)蓮座葉表型；(b)總狀花序表型。(a)標(biāo)尺=1 cm;(b)標(biāo)尺=1 mm。(a) Phenotype of rosette leaf; (b) Phenotype of SAM. (a) Scale bar=1 cm; (b) Scale bar=1 mm.圖6 35S::CsYAB1a異源過(guò)表達(dá)擬南芥的蓮座葉和花序的觀察Fig.6 Rosette leaf and SAM observation of 35S::CsYAB1a overexpression Arabidopsis
與野生型相比，過(guò)表達(dá)擬南芥的雄蕊和心皮數(shù)目有所增多，野生型擬南芥花含有6枚雄蕊(4長(zhǎng)2短)和1枚由2個(gè)心皮形成的圓柱狀雌蕊，過(guò)表達(dá)擬南芥花平均含有6～7枚雄蕊，個(gè)別花中甚至含有10枚以上雄蕊(圖7(a))。與此同時(shí)，過(guò)量表達(dá)CsYAB1a
基因?qū)е滦钠?shù)目增多，繼而形成了畸形雌蕊(圖7(b)和(c))?；未迫锇凑毡硇涂煞譃?類(圖7(b))，從左至右畸形程度依次加深)：由3～4個(gè)心皮形成的柱狀雌蕊、由2～4個(gè)心皮并排形成的雌蕊(未融合成柱狀)和由2～4個(gè)單心皮雌蕊組成的雌蕊群。后2類畸形雌蕊(群)有多個(gè)柱頭，且發(fā)育后期會(huì)出現(xiàn)外露的胚珠(圖7(c))。
(a)雄蕊表型；(b)雌蕊表型；(c)發(fā)育后期雌蕊表型。標(biāo)尺=1 mm。(a) Phenotype of stamens; (b) Phenotype of pistils; (c) Phenotype of pistils at late stages of development. Scale bar=1 mm.圖7 35S::CsYAB1a異源過(guò)表達(dá)擬南芥花器官的觀察Fig.7 Floral organ observation of 35S::CsYAB1a overexpression Arabidopsis
本研究觀察和統(tǒng)計(jì)了轉(zhuǎn)基因擬南芥果實(shí)的表型,與野生型相比，35S
::CsYAB1a
過(guò)表達(dá)擬南芥的果實(shí)和花柄變短，部分果實(shí)發(fā)育畸形(圖8)。成熟野生型擬南芥的果實(shí)縱徑約為13.5 mm，而過(guò)表達(dá)擬南芥的果實(shí)縱徑介于4.1～5.7 mm(圖8(a))；成熟野生型擬南芥的花柄長(zhǎng)度約為6.0 mm，而過(guò)表達(dá)擬南芥的花柄長(zhǎng)度約為3.0 mm(圖8(b))。根據(jù)上述結(jié)果，推測(cè)黃瓜CsYAB1a
基因可能調(diào)控花和果實(shí)的發(fā)育。
(a)果實(shí)表型；(b)花柄表型；(c)畸形果實(shí)(在不同發(fā)育時(shí)期)表型。標(biāo)尺=1 mm。(a) Phenotype of silique; (b) Phenotype of flower stalk; (c) Phenotype of malformed fruit (in different periods). Scale bar=1 mm.圖8 35S::CsYAB1a異源過(guò)表達(dá)擬南芥果實(shí)表型的觀察Fig.8 Siliques observation of 35S::CsYAB1a overexpression Arabidopsis
為了對(duì)過(guò)表達(dá)擬南芥出現(xiàn)的表型變化進(jìn)行解釋，本研究選取了27個(gè)調(diào)控?cái)M南芥花發(fā)育和葉片極性的相關(guān)基因，包括：AGAMOUS
(AG
)、ALCATRAZ
(ALC
)、APETALA
1
(AP1
)、APETALA
3
(AP3
)、ASYMMETRIC
LEAVES
1
(AS1
)、ASYMMETRIC
LEAVES
2
(AS2
)、CAULIFLOWER
(CAL
)、CLAVATA
3
(CLV3
)、CRC
、FLOWERING
LOCUS
T
(FT
)、FRUITFULL
(FUL
)、HANABA
TANARU
(HAN
)、HECATE
3
(HEC3
)、INDEHISCENT
(IND
)、KANADI
1
(KAN1
)、KANADI
2
(KAN2
)、LEAFY
(LFY
)、PISTILLATA
(PI
)、SHATTERPROOF
1
(SHP1
)、SHATTERPROOF
2
(SHP2
)、SPOROCYTELESS
(SPL
)、SPATULA
(SPT
)、SUPERMAN
(SUP
)、TERMINAL
FLOWER
1
(TFL1
)、WUSCHEL
RELATED
HOMEOBOX
1
(WOX1
)、WUSCHEL
(WUS
)和YUC11
，檢測(cè)其在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量變化。熒光定量結(jié)果表明(圖9)，SPL
、SHP2
、SHP1
、AP1
和CAL
在過(guò)表達(dá)擬南芥SAM中顯著上調(diào)，而IND
和HEC3
的表達(dá)量則顯著下調(diào)。同時(shí)，葉片極性基因KAN1
、KAN2
以及AS1
在過(guò)表達(dá)擬南芥蓮座葉的表達(dá)量顯著下調(diào)。其余與花發(fā)育相關(guān)的基因(ALC
、AP3
、CRC
、HAN
、LFY
、PI
、SUP
、TFL1
、WOX1
、WUS
和YUC11
)以及葉片極性基因AS2
則未檢測(cè)出顯著的表達(dá)量差異。
**或*表示在t檢驗(yàn)下0.01或0.05水平上差異顯著。圖11同。 ** or * indicates a significant difference at the 0.01 or 0.05 level under t-test. The same as Figure 11.圖9 潛在下游基因在35S::CsYAB1a異源過(guò)表達(dá)擬南芥的相對(duì)表達(dá)情況Fig.9 Expression of potential downstream genes in 35S::CsYAB1a overexpression Arabidopsis
2.8 黃瓜YABBYs基因啟動(dòng)子激素響應(yīng)元件分析
為了從另一個(gè)角度解釋過(guò)表達(dá)擬南芥出現(xiàn)的表型變化，本研究探究了黃瓜YABBYs
基因和植物激素的關(guān)系。利用PlantCARE網(wǎng)站分析黃瓜8個(gè)YABBYs
基因啟動(dòng)子(3 kb內(nèi))包含的順式作用元件，結(jié)果表明：黃瓜YABBYs
基因的啟動(dòng)子含有10種激素響應(yīng)元件，對(duì)應(yīng)脫落酸、生長(zhǎng)素、赤霉素、茉莉酸甲酯和水楊酸5種植物激素。其中CsYAB2
基因啟動(dòng)子包含激素響應(yīng)元件最多，達(dá)到11個(gè)，而CsYAB5a
基因啟動(dòng)子中僅包含2個(gè)激素響應(yīng)元件(圖10(a))。另外，脫落酸響應(yīng)元件占比最大，而水楊酸響應(yīng)元件占比最小(圖10(b))。
ABRE為脫落酸響應(yīng)元件；AuxRR-core、TGA-box和TGA-element為生長(zhǎng)素響應(yīng)元件；GARE-motif、P-box和TATC-box為赤霉素響應(yīng)元件；CGTCA-motif和TGACG-motif為茉莉酸甲酯響應(yīng)元件；TCA-element為水楊酸響應(yīng)元件。 ABRE is an abscisic acid response element; AuxRR-core, TGA-box and TGA-element are auxin response elements; GARE-motif, P-box and TATC-box are gibberellin responsive elements； CGTCA-motif and TGACG-motif are MeJA response elements； TCA-element is a salicylic acid response element.圖10 黃瓜YABBYs基因啟動(dòng)子包含的激素響應(yīng)元件Fig.10 Hormone response elements contained in the promoters of CsYABBYs genes
CsYAB1a
基因包含3種植物激素的響應(yīng)元件(圖10)。本研究選取YABBYs
家族中激素響應(yīng)元件占比最大的脫落酸以及與果實(shí)長(zhǎng)度密切相關(guān)的生長(zhǎng)素，對(duì)CsYAB1a
基因最為富集的雌花芽進(jìn)行外源脫落酸和生長(zhǎng)素噴施處理，后續(xù)取樣檢測(cè)基因的表達(dá)量變化。多次取樣導(dǎo)致組間植物樣本存在差異，本研究選取同樣具有脫落酸和生長(zhǎng)素響應(yīng)元件且在雌花芽表達(dá)量最高的CsCRC
基因作為響應(yīng)趨勢(shì)的參照(圖11)。外源脫落酸噴施處理后，CsYAB1a
和CsCRC
基因均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，噴施處理1 h和24 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)(圖11(a)和(c))。外源生長(zhǎng)素噴施處理后，兩者呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，噴施生長(zhǎng)素1 h和6 h后出現(xiàn)顯著上調(diào)和下調(diào)(圖11(b)和(d))。2個(gè)基因?qū)ν庠醇に貒娛┨幚砭许憫?yīng)，且變化趨勢(shì)相似(說(shuō)明結(jié)果可信)，CsCRC
基因的響應(yīng)則更明顯。上述結(jié)果表明，35S
::CsYAB1a
異源過(guò)表達(dá)擬南芥的表型變化可能與激素水平變化有關(guān)，YABBYs
家族部分成員可能通過(guò)脫落酸或生長(zhǎng)素途徑調(diào)控黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育。3 討論與結(jié)論
3.1 YABBYs基因的進(jìn)化及結(jié)構(gòu)分析
圖11 外源激素噴施處理后CsYAB1a和CsCRC基因的響應(yīng)情況Fig.11 Response of CsYAB1a and CsCRC genes after exogenous hormone spraying
YABBY
是一類被子植物特異的轉(zhuǎn)錄因子。YABBY
成員調(diào)控葉片和花器官的發(fā)育。截至目前，YABBY
基因的數(shù)量在多個(gè)物種中被報(bào)道研究,番茄含有9個(gè)YABBYs
基因，分布在12條番茄染色體中的7條；水稻含有8個(gè)YABBYs
基因，它們形成了4個(gè)亞群；小白菜含有12個(gè)YABBYs
基因，分布在20條白菜染色體中的6條；玉米含有13個(gè)YABBYs
基因。陸地植物苔蘚(Bryophyta)和石松(Lycopodiophyta)沒(méi)有YABBY
成員，因此認(rèn)為該基因家族是種子植物特有的。YABBY
轉(zhuǎn)錄因子在種子植物中得到了廣泛研究，但多數(shù)僅為物種內(nèi)基因家族成員的鑒定、表達(dá)分析以及進(jìn)化方面的工作，其家族成員的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步探究。本研究通過(guò)對(duì)擬南芥YABBYs
家族6個(gè)成員的蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，得到了8個(gè)黃瓜YABBYs
家族成員；擬南芥和黃瓜的YABBYs蛋白同源相似度較高(54%～71%)；進(jìn)化分析結(jié)果表明，黃瓜YABBYs
家族的8個(gè)成員被劃分為5個(gè)亞家族，這與擬南芥YABBYs
基因的進(jìn)化情況一致。研究表明，YAB1
和YAB3
基因可能源于1次基因復(fù)制事件，在擬南芥中兩者存在功能冗余，在黃瓜中沒(méi)有鑒定到AtYAB3
的同源基因。另外，AtYAB1
、AtYAB4
和AtYAB5
基因在黃瓜中分別對(duì)應(yīng)2個(gè)同源基因，體現(xiàn)了黃瓜YABBYs
家族的特異性。同時(shí)，擬南芥和黃瓜YABBYs
家族14個(gè)成員的外顯子均為6～7個(gè)，暗示YABBYs
基因在不同物種中較為保守。YABBY
基因由N端的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的YABBY結(jié)構(gòu)域組成，它們與高遷移蛋白盒(HMG-box)的前2個(gè)螺旋序列類似，是1種特殊的并置結(jié)構(gòu)域，在其他真核生物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。這2個(gè)結(jié)構(gòu)域與DNA的特異性結(jié)合有關(guān)。8個(gè)黃瓜YABBYs
基因均包含C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和YABBY結(jié)構(gòu)域，表明YABBYs
基因具有保守性。上述同源比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和保守結(jié)構(gòu)域的結(jié)果在Yin等研究中得到進(jìn)一步驗(yàn)證。3.2 CsYAB1a基因的表達(dá)模式及功能
FIL
基因(又名YAB1
)在起始原基的遠(yuǎn)軸端表達(dá)，決定遠(yuǎn)軸端細(xì)胞的命運(yùn)。FIL
基因還參與花發(fā)育，并在擬南芥以外的其他物種中得到研究。例如：大豆GmFILa
基因參與擬南芥葉片近遠(yuǎn)軸端極性的調(diào)控、影響花期和頂端分生組織的發(fā)育；綠竹(Bambusa
oldhamii
)BoYAB1
基因參與擬南芥葉片發(fā)育和花期調(diào)控，異位過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥花期延遲和葉片向遠(yuǎn)軸端卷曲；此外，FIL
基因還影響花青素的積累。本研究利用熒光定量和原位雜交技術(shù)對(duì)CsYAB1a
基因表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃瓜CsYAB1a
基因在花原基遠(yuǎn)軸端、雌雄花芽的花瓣原基以及雌花芽的子房外果皮有明顯富集。在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)CsYAB1a
基因?qū)е麓菩廴锇l(fā)育畸形、果莢變短和葉片細(xì)長(zhǎng)并向遠(yuǎn)軸端卷曲等。上述結(jié)果表明，CsYAB1a
基因的功能相對(duì)保守且可能參與黃瓜果實(shí)和葉片發(fā)育的調(diào)控過(guò)程。前人研究表明，擬南芥spl
突變體的雌雄蕊發(fā)育均受到抑制，且FIL通過(guò)和SPL蛋白互作來(lái)調(diào)控珠被發(fā)育；IND
和HECs
基因同屬非典型bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，擬南芥ind
和hec3
突變體分別出現(xiàn)成熟果實(shí)不開(kāi)裂和育性降低的表型；KANs
和ASs
基因參與近遠(yuǎn)軸端建成和維管發(fā)育，kan1kan2kan3
三重突變體會(huì)形成近軸化葉片；as1
和as2
突變體表現(xiàn)出極性缺陷。根據(jù)前人的報(bào)道和熒光定量結(jié)果，我們推測(cè)35S
::CsYAB1a
異源過(guò)表達(dá)擬南芥出現(xiàn)的表型可能與CsYAB1a
基因引起AtSPL
、AtIND
、AtHEC3
、AtKAN2
、AtAS1
和AtKAN1
基因的表達(dá)量變化有關(guān)。此外，AtSPL
和AtIND/HEC3
的黃瓜同源基因(分別為CsSPL
和CsIVP
)對(duì)于黃瓜的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。黃瓜CsSPL
沉默植株的雄雌生殖力均顯著下降，花粉畸形，胚珠發(fā)育受到抑制；黃瓜CsIVP
-RNAi轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出多種發(fā)育缺陷，例如：植株矮壯、葉片變形、花發(fā)育異常和雄性不育。上述3個(gè)基因的表達(dá)水平在CsYAB1a
轉(zhuǎn)基因擬南芥中發(fā)生了顯著變化，表明CsYAB1a
基因可能與其有直接的關(guān)聯(lián)，詳細(xì)調(diào)控機(jī)制需在黃瓜中做進(jìn)一步的驗(yàn)證分析。3.3 黃瓜YABBYs基因可能參及激素調(diào)控途徑
植物激素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。前人研究表明，YABBY
受生長(zhǎng)素和赤霉素等激素的影響。例如：水稻OsYABBY
4基因通過(guò)促進(jìn)赤霉素通路調(diào)控植株高度，外源施用赤霉素可恢復(fù)過(guò)表達(dá)OsYABBY1
引起的半矮化表型。此外，多個(gè)物種的YABBY
基因?qū)ν庠磭娛┘に赜许憫?yīng)，例如：毛竹(Phyllostachys
edulis
)PeYABBYs
基因?qū)ν庠磭娛┏嗝顾睾兔撀渌嵊许憫?yīng)，小白菜BcYABBYs
基因和大豆GmFILa
基因?qū)ν庠磭娛┥L(zhǎng)素、脫落酸和水楊酸有響應(yīng)，菠蘿AcYABBY
基因?qū)ν庠磭娛┮蚁┖兔撀渌嵊许憫?yīng)。黃瓜YABBYs
基因啟動(dòng)子的激素響應(yīng)元件中脫落酸響應(yīng)元件占比最大。對(duì)黃瓜雌花芽進(jìn)行外源脫落酸和生長(zhǎng)素噴施處理，取樣檢測(cè)CsYAB1a
和CsCRC
基因的表達(dá)量變化，結(jié)果表明，2個(gè)基因?qū)ν庠醇に貒娛┨幚砭许憫?yīng)，且變化趨勢(shì)相似，CsCRC
基因的響應(yīng)更為明顯。結(jié)合前人研究結(jié)果推測(cè)YABBYs
家族部分成員可能通過(guò)脫落酸或生長(zhǎng)素途徑來(lái)調(diào)控黃瓜果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究為深入解析黃瓜YABBYs
基因的功能奠定了基礎(chǔ)。猜你喜歡
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