葉玉萍 林崇峰 鄭楠

乳腺癌是當(dāng)前女性中發(fā)病率第一位的惡性腫瘤，2018年，全球有200萬(wàn)例乳腺癌被確診[1]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer,TNBC）是乳腺癌中最具侵襲性的組織學(xué)亞型，其對(duì)化療的反應(yīng)小，總體預(yù)后不良，缺乏常規(guī)的靶向治療方法[2-3]。當(dāng)前乳腺癌的治療策略包括手術(shù)切除、放療、化療等。然而，化療和放療存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)，會(huì)降低患者的生活質(zhì)量[4]。較多的乳腺癌患者對(duì)紫杉醇初始化療沒(méi)有反應(yīng)，或者在隨后的治療中發(fā)生獲得性耐藥和交叉耐藥，患者預(yù)后較差，死亡率較高[5-7]。因此，探尋TNBC的新療法、增效劑或者輔助藥物聯(lián)合治療以提高療效意義重大。

研究發(fā)現(xiàn)，在耐藥性結(jié)腸癌細(xì)胞中磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide-3-kinase,PI3K）途徑被異常激活，且與耐藥細(xì)胞的惡性侵襲表型有關(guān)[8]。在TNBC中，PI3K相關(guān)信號(hào)通路可以通過(guò)受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase,RTK）信號(hào)傳導(dǎo)在細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的調(diào)節(jié)之間發(fā)揮重要作用[9-10]。PI3K下游最相關(guān)的節(jié)點(diǎn)是蛋白激酶B（protein kinase B,Akt）和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR），該途徑受多種磷酸酶的調(diào)節(jié)，包括磷酸酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）以及ⅡB型肌醇多磷酸-4-磷酸酶（inositol polyphosphate 4-phosphatasetypeⅡ,INPP4B），從而驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)展和對(duì)化療的抵抗[11]。有研究指出，常用抗寄生蟲(chóng)藥物氯硝柳胺具有一定的抗腫瘤活性，可以保護(hù)機(jī)體免受致癌因素的損傷，同時(shí)可抑制腎癌的侵襲和遷移[12]，其作用機(jī)制可能與氯硝柳胺通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[13]。氯硝柳胺是否可以抑制紫杉醇耐藥性TNBC的發(fā)展以及其作用機(jī)制均尚未清楚?；诖耍狙芯客ㄟ^(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)探討氯硝柳胺抑制紫杉醇耐藥性TNBC的效果，并分析可能的作用機(jī)制，以期為臨床治療TNBC提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇耐藥性TNBC細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自北京泓信干細(xì)胞生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 氯硝柳胺購(gòu)自佛山信航生物科技有限公司（規(guī)格：50 mg/支），紫杉醇購(gòu)自曼思特生物有限公司（規(guī)格：20 mg/支，批號(hào)：33069-62-4），PI3K/Akt通路抑制劑LY294002購(gòu)自賽多利斯生物試劑公司（規(guī)格：20 mg/支），GAPDH一抗（規(guī)格：100 μl/支）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）一抗（規(guī)格：100 μl/支）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。PI3K一抗（規(guī)格：200 μl/支）、磷酸化PI3K（phospho-phosphoinositide-3-kinase，p-PI3K）一抗（規(guī)格：100 μl/支）購(gòu)自維潤(rùn)賽潤(rùn)生物試劑有限公司。磷酸化Akt（phospho-protein kinase B，p-Akt）一抗（規(guī)格：100 μl/支）、Akt一抗（規(guī)格：100 μl/支）購(gòu)自美國(guó) CST公司，P糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）（規(guī)格：100 μl/支）購(gòu)自博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MDA-MB-231細(xì)胞株使用添加10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)，將細(xì)胞放在37℃和5%CO2的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞80%融合后行Western blot法檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

1.3.2 細(xì)胞分組和細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞接種在96孔板中并分為3組，對(duì)照組使用紫杉醇（1 μmol/L）處理，氯硝柳胺組使用氯硝柳胺（3 μmol/L）處理，聯(lián)合用藥組使用氯硝柳胺（3 μmol/L）+LY294002（1 μmol/L）處理。各組細(xì)胞孵育12 h后按照試劑說(shuō)明書(shū)使用MTT試劑進(jìn)行染色，反應(yīng)30 min后洗滌未結(jié)合的染料，并將染色的細(xì)胞溶解在10 mmol/L Tris（pH 10.0）中，在490 nm處檢測(cè)吸光度以反映細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 使用FITC Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）按照試劑盒說(shuō)明書(shū)定量確定凋亡細(xì)胞的百分比：各組細(xì)胞不同處理24 h后，將1×107個(gè)細(xì)胞與FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶（PI）試劑在室溫下于黑暗中染色15 min，洗滌后，在BDFACS Canto流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，型號(hào)：Attune NxT）上進(jìn)行每個(gè)樣品的采集，并使用BDFACS Diva軟件分析收集的數(shù)據(jù)，并確定各組凋亡細(xì)胞的百分比（凋亡率）。

1.3.4 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 將Transwell小室置于6孔板中，6孔板中加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，各組細(xì)胞處理24 h后將2×104個(gè)（200 μl）細(xì)胞加入小室內(nèi)，37 ℃孵育48 h，PBS洗滌3次后在含有0.1%結(jié)晶紫和20%甲醇的染料溶液中染色30 min，使用倒置顯微鏡觀察遷移細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個(gè)視野進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)，遷移率=藥物組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.5 細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。提取各組細(xì)胞總蛋白后，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)量樣品中的蛋白質(zhì)濃度，用8%～15%SDS-PAGE（美國(guó)Millipore公司）分離等量的蛋白質(zhì)（520 μg），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（美國(guó)Millipore公司），用5%BSA（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）封閉膜，用抗 p-Akt、抗 Akt、抗 p-PI3K、抗 PI3K、抗裂解的 Caspase-3、抗P-gp或抗GAPDH室溫孵育過(guò)夜，稀釋度為1∶500，然后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)試劑盒（英國(guó)GE Healthcare公司）檢測(cè)蛋白印跡反映p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt表達(dá)水平。

1.3.6 小鼠異種移植腫瘤模型建立 30只4～6周齡的雄性SD小鼠購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)實(shí)驗(yàn)室，自由飲食、飲水。將耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞）懸浮在100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，并注射到小鼠左側(cè)腹壁皮下，繼續(xù)飼養(yǎng)2周；當(dāng)腫瘤體積達(dá)到30 mm3時(shí)，將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只。對(duì)照組小鼠腹腔注射紫杉醇（10 mg/kg，溶于PBS），氯硝柳胺組小鼠腹腔注射氯硝柳胺（1.5 mg/kg，溶于PBS），聯(lián)合用藥組腹腔注射氯硝柳胺（1.5 mg/kg，溶于PBS）+LY294002（10 mg/kg，溶于 PBS），均 1次/d，共 35 d。然后每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，并計(jì)算腫瘤體積。5周后采用頸椎脫臼法處死小鼠，分離出腫瘤，稱重后以10%甲醛溶液固定。

1.3.7 小鼠腫瘤組織Ki-67表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化染色法。各組小鼠腫瘤組織固定48 h后使用石蠟包埋，切成2 μm切片后固定在載玻片上，與Ki-67抗體一起在含5%FBS的PBS中4℃孵育過(guò)夜。然后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，在室溫下用稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）偶聯(lián)物孵育切片，然后使用蘇木精復(fù)染5 min，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，使用圖像分析軟件Olympus cellSens Dimension計(jì)算表達(dá)陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力、遷移能力和凋亡情況比較 與對(duì)照組相比，氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力、遷移能力均明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增多，且聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖、遷移能力又較氯硝柳胺組明顯下降，細(xì)胞凋亡明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2、3。即氯硝柳胺抑制耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞的體外增殖和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖1 氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組、對(duì)照組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力比較

圖2 氯硝柳胺組與對(duì)照組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力比較（a：遷移實(shí)驗(yàn)鏡下所見(jiàn)比較，結(jié)晶紫染色，×400；b：細(xì)胞遷移能力比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

圖3 氯硝柳胺組與對(duì)照組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況比較（a：流式細(xì)胞圖比較；b：細(xì)胞凋亡情況比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.2 3組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平均下降，裂解的Caspase-3蛋白表達(dá)水平均上升，P-gp蛋白表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖4、5。即氯硝柳胺處理細(xì)胞后，細(xì)胞中PI3K/Akt通路的磷酸化水平被明顯抑制，和LY294002聯(lián)合用藥可以進(jìn)一步抑制PI3K/Akt通路的激活，并導(dǎo)致細(xì)胞中耐藥標(biāo)志物水平降低與細(xì)胞凋亡標(biāo)志物水平上升。

圖4 氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組、對(duì)照組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達(dá)水平比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b：蛋白磷酸化表達(dá)水平比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

圖5 氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組、對(duì)照組耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞裂解的Caspase-3、P-gp蛋白表達(dá)水平比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖；b：蛋白磷酸化表達(dá)水平比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.3 3組小鼠移植腫瘤體積比較 5周后，與對(duì)照組比較，氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組小鼠移植腫瘤體積均縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖6（插頁(yè)）。

圖6 氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組、對(duì)照組小鼠移植腫瘤體積比較（a：腫瘤生長(zhǎng)曲線比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05；b：腫瘤肉眼所見(jiàn)比較）

2.4 3組小鼠移植腫瘤組織Ki-67表達(dá)情況比較 與對(duì)照組比較，氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組小鼠移植腫瘤組織Ki-67表達(dá)均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖7。

圖7 氯硝柳胺組、聯(lián)合用藥組、對(duì)照組小鼠移植腫瘤組織Ki-67表達(dá)情況比較（a：Ki-67表達(dá)情況鏡下所見(jiàn)，×400；b：Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率比較，與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

3 討論

TNBC是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率不斷上升，每年新發(fā)患者約36.9萬(wàn)例，其發(fā)病逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。由于TNBC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等特性，以及獲得性耐藥、多重耐藥性等問(wèn)題，TNBC的臨床治療手段例如手術(shù)切除、化療、放療等效果欠佳[14]。因此，闡明其耐藥機(jī)制并尋找有效的化療藥物具有重要的臨床意義。本研究結(jié)果顯示，在體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)動(dòng)物模型中，氯硝柳胺均具有良好的抗腫瘤活性，可以有效的抑制耐藥性TNBC的體內(nèi)外進(jìn)展。耐藥性乳腺癌具有高度耐藥以及向身體其他器官轉(zhuǎn)移的潛力，是引起女性癌癥死亡的重要因素[15]。研究表明，乳腺癌的侵襲性和高度轉(zhuǎn)移性特征與PI3K/Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活有關(guān)[16]。氯硝柳胺也稱滅絳靈、貝螺殺，是一種水楊酰胺類衍生物，其作用機(jī)制為抑制蟲(chóng)體細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化磷酸化過(guò)程，能量物質(zhì)ATP生成減少。近年來(lái)的研究表明氯硝柳胺具有廣泛的藥理活性，包括抗癌、抗菌及抗纖維化等作用[17-18]，可通過(guò)激活Caspase-8/t-Bid線粒體途徑誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抗乳腺癌作用，并通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路的調(diào)節(jié)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬，發(fā)揮化療增敏作用。本研究使用氯硝柳胺對(duì)耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，耐藥性MDA-MB-231細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被明顯抑制，耐藥蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞增殖與侵襲能力被顯著抑制，且細(xì)胞凋亡明顯增加，并表現(xiàn)為凋亡相關(guān)蛋白的明顯上調(diào)。PI3K/Akt通路廣泛參與各種細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡，在血管生成和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，與乳腺癌的發(fā)展、侵襲以及化療耐藥密切相關(guān)[19]。而在聯(lián)合使用PI3K抑制劑之后，氯硝柳胺誘導(dǎo)的信號(hào)通路抑制和抗癌活性被進(jìn)一步增加，提示氯硝柳胺可以部分地通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)抑制而發(fā)揮抗癌活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)，氯硝柳胺可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)抑制耐藥性腫瘤的體內(nèi)進(jìn)展。

總之，本研究結(jié)果表明，氯硝柳胺通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制耐藥性TNBC細(xì)胞的侵襲和增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤的體內(nèi)進(jìn)展。