徐巧萍 鄧魁 林青青 張珍

卵巢癌是女性生殖道最常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年中國約有52 100例新發(fā)卵巢癌病例，病死率高達(dá)50%[1-2]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）指上皮到間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，它賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，在促進(jìn)癌癥獲得轉(zhuǎn)移能力的過程中起重要作用。EMT的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor,TGF）-β/母體抗生物皮膚生長因子同源蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein,SMAD）、非受體酪氨酸激酶（Janus kinase,JAK）2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）3、Notch、Ras-促分裂素原活化蛋白激酶（Ras-mitogen-activated protein kinase,Ras-MAPK）、NF-κB和p38等多條分子信號通路均被報(bào)道參與調(diào)控卵巢癌的EMT過程[3-4]。因此，尋找阻斷EMT的信號通路對抑制卵巢癌的侵襲、轉(zhuǎn)移具有重要意義。人類slfn（Schlafen）基因家族有6個成員，其中slfn5基因在肺癌、大腸癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)升高，通過激活蛋白激酶（protein kinase,PK）B/糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase,GSK）-3β/β-鏈環(huán)蛋白（β-catenin）通路、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）14表達(dá)來抑制細(xì)胞遷移和侵襲[5-6]。Fischietti等[7]推斷人類胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）患者的預(yù)后較差與slfn5基因高表達(dá)有關(guān)，這暗示slfn5基因還參與了PDAC的病理生理，并導(dǎo)致預(yù)后不良。對人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的研究發(fā)現(xiàn)，slfn5基因過表達(dá)導(dǎo)致EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的水平升高，伴隨E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)降低，β-catenin從膜向細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核易位[8]，可見slfn5基因是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子。深入剖析slfn5基因上下游調(diào)控信號通路，探究癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制，可為抑制轉(zhuǎn)移提供新的潛在治療靶點(diǎn)。本研究以人卵巢癌細(xì)胞系為材料，通過沉默slfn5基因，研究slfn5基因在卵巢癌EMT中的作用及其對腫瘤侵襲、遷移能力的影響，探討EMT標(biāo)記蛋白和典型轉(zhuǎn)錄因子在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，以期為卵巢癌治療提供新線索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織材料 收集2019年8月至2022年4月在杭州市第一人民醫(yī)院行手術(shù)治療的21例卵巢癌患者的癌組織標(biāo)本作為卵巢癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)病理檢查確診為卵巢癌且為首次確診；術(shù)前未進(jìn)行放化療、靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、盆腔炎性疾??；合并重要臟器功能障礙；合并凝血功能障礙、傳染性疾病和感染性疾病。另收集同期行良性卵巢囊腫切除的14例患者的正常卵巢組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm，經(jīng)病理檢查確認(rèn)）作為正常組。臨床樣本正常組年齡38～76（53.22±10.11）歲，卵巢癌組年齡39～75（52.73±12.04）歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)杭州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人卵巢表面上皮細(xì)胞IOSE80和卵巢癌細(xì)胞系 A2780、SKOV3、OVCAR3、HO8910均購于浙江美森細(xì)胞科技有限公司。所有細(xì)胞均使用專用培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待培養(yǎng)瓶底部鋪滿細(xì)胞時傳代，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 主要試劑 Real-time反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，Trizol試劑、Real-time PCR檢測試劑盒購自美國Promega公司；DEPC水購自北京索萊寶公司；細(xì)胞裂解液試劑盒購自美國Thermo公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗SLFN5抗體（批號：6789P）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin，批號：14215S）、E-cadherin（批號：3195P）、波形纖維蛋白（Vimentin，批號：9585P）、Snail（批號：3879S）、微管蛋白（Tubulin，批號：sc-47778）抗體均購自美國CST公司，β-catenin抗人多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標(biāo)記的抗羊IgG、抗兔IgG購自美國CST公司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自上海賽默飛世爾科技有限公司；丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、二甲基亞砜（DMSO）和磺酰羅丹明B購自美國Sigma公司。

1.2 兩組樣本組織中slfn5 mRNA表達(dá)的檢測 將卵巢癌組織和癌旁組織經(jīng)液氮速凍后剪碎研磨成粉末，采用Trizol法抽提總RNA，采用熒光定量PCR（qRTPCR）法檢測mRNA擴(kuò)增情況。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書配置逆轉(zhuǎn)錄體系，其中RNA模板1 μl，逆轉(zhuǎn)錄試劑 14 μl，用 DEPC 水補(bǔ)齊 20 μl。反應(yīng)條件為 95 ℃預(yù)變性 15 min，94 ℃變性30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3個平行反應(yīng)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法測定slfn5 mRNA的相對表達(dá)量。slfn5引物：正向5'-CATCCGACGCATCACCGATCTG-3'，反 向 5'-CATCCG ACGCATCACCGATCTG-3'；GAPDH引物：正向5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，反向 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及指標(biāo)測定

1.3.1 5種細(xì)胞中SLFN5蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。將5組細(xì)胞分別加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，離心收集上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白水平。樣品加入上樣緩沖液，根據(jù)SDS-PAGE試劑盒方法分離樣品，將條帶轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜上，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后加入抗SLFN5一抗孵育過夜。再次洗膜后加入HRP二抗，孵育1 h。洗膜后加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，自顯影。采用圖像分析處理系統(tǒng)（Image J軟件）對蛋白條帶掃描分析，用測得的蛋白光密度值與Tubulin光密度值的比值表示5組細(xì)胞中SLFN5蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染及sfln5 mRNA表達(dá)的檢測 取上述SLFN5蛋白相對表達(dá)水平高的2個細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由上海吉凱公司設(shè)計(jì)并合成特異性沉默slfn5的RNA（si-slfn5#1、si-slfn5#2）及陰性對照（siRNANC），采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒方法依次轉(zhuǎn)染，即為si-slfn5#1組、si-slfn5#2組和si-NC組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；si-slfn5#1組、si-slfn5#2組引物序列見表1。取出細(xì)胞，采用qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞slfn5 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 slfn5引物的siRNA序列

1.3.3 細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的測定 取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞作為材料。（1）細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell小室的下室中加入500 μl含10%FBS的完全細(xì)胞培養(yǎng)基，上室接種300 μl不含F(xiàn)BS的細(xì)胞懸液（細(xì)胞密度約2×104/L）。培養(yǎng)24 h后，甲醇固定Transwell小室的下層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色、清水沖洗，用棉簽輕輕拭去上層細(xì)胞，10倍顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，觀察穿過小室濾膜的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞相對數(shù)量比越大表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。（2）細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的上室中預(yù)先均勻鋪上100 μl稀釋好的基底膠，37℃靜置約2 h，待其凝結(jié)成膠后，參照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，觀察穿過小室濾膜的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞相對數(shù)量比越大表示細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。

1.3.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移率的檢測 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞制備細(xì)胞懸液（約2×104/L），接種于6孔板。當(dāng)細(xì)胞鋪滿6孔板底部時，用滅菌的移液槍槍頭垂直于板底均勻劃痕，無菌PBS洗去脫落細(xì)胞，于顯微鏡下觀察劃痕并拍照記錄；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次取樣拍照。用Image J圖像處理軟件并測定0 h（T0h）及24 h（T24h）劃痕面積，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=（T0h-T24h）/T0h×100%。

1.3.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 采用Westetn blot法。取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白水平。樣品加入上樣緩沖液，根據(jù)SDS-PAGE試劑盒方法分離樣品，將條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜后分別加入 SLFN5、Vimentin、Snail、N-cadherin 和 E-cadherin等一抗，4℃孵育過夜，加入二抗后室溫孵育45 min，顯影并用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以Tubulin為內(nèi)參，計(jì)算細(xì)胞中Vimentin、Snail、N-cadherin 和E-cadherin等EMT相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測 采用Westetn blot法。取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，參照BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定蛋白濃度；SDS-PAGE分離條帶并轉(zhuǎn)模，加入5%牛奶室溫封閉1 h，洗膜后加入β-catenin一抗，4℃搖床孵育過夜，加入二抗室溫孵育45 min，顯影并用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以Tubulin為內(nèi)參，計(jì)算βcatenin蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組樣本組織中slfn5 mRNA表達(dá)的比較 相比正常組，卵巢癌組slfn5 mRNA相對表達(dá)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 兩組樣本組織中slfn5 mRNA表達(dá)的比較

2.2 5組細(xì)胞中SLFN5蛋白表達(dá)的比較 與IOSE80相比，HO8910、SKOV3、OVCAR3細(xì)胞系SLFN5蛋白均顯著高表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），其中SKOV3、OVCAR3相對表達(dá)水平更高，見圖2。故選取SKOV3、OVCAR3細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中slfn5 mRNA表達(dá)的比較 與si-NC組相比，si-slfn5#1組、si-slfn5#2組細(xì)胞中slfn5 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），提示穩(wěn)定沉默slfn5基因的SKOV3、OVCAR3細(xì)胞株構(gòu)建成功，見圖3。

注：Tubulin為微管蛋白；與IOSE80比較，***P＜0.001

圖3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中slfn5 mRNA表達(dá)的比較

2.4 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比si-NC組，si-slfn5#1組、si-slfn5#2組穿過基底膜的細(xì)胞相對數(shù)量比均減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），提示沉默slfn5基因抑制了SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的遷移。Transell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比si-NC組，sislfn5#1組、si-slfn5#2組穿過基底膜的細(xì)胞相對數(shù)量比均減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.01），提示沉默slfn5基因抑制了SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的侵襲，見圖4。

圖4 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響（a：遷移實(shí)驗(yàn)的3組細(xì)胞相對數(shù)量比；b：侵襲實(shí)驗(yàn)的3組細(xì)胞相對數(shù)量比）

2.5 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移率的影響 與si-NC組相比，si-slfn5#1組、si-slfn5#2組的細(xì)胞遷移率均顯著低于si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），驗(yàn)證了沉默slfn5基因能夠降低SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的遷移能力，見圖5。

圖5 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移率的影響（a：SKOV3、OVCAR3細(xì)胞遷移圖；b：沉默slfn5基因后，SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的遷移率）

2.6 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測顯示，與si-NC組相比，si-slfn5#1組、si-slfn5#2組 Vimentin、Snail、N-cadherin等的相對表達(dá)量顯著降低，E-cadherin相對表達(dá)量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。E-cadherin的增加和Vimentin、Snail、N-cadherin的減少與卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力下降直接相關(guān)，提示沉默slfn5基因能抑制卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，見圖6。

圖6 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（a：蛋白電泳圖；b-c：沉默slfn5基因的SKOV3、OVCAR3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白相對表達(dá)量）

2.7 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響 與si-NC組相比，si-slfn5#1組、si-slfn5#2組β-catenin相對表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖7。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路關(guān)鍵調(diào)控因子，其相對表達(dá)量下降提示W(wǎng)nt/βcatenin信號通路活性降低。

圖7 沉默slfn5基因?qū)KOV3、OVCAR3細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響（a：蛋白電泳圖；b：沉默slfn5基因的SKOV3、OVCAR3細(xì)胞βcatenin蛋白相對表達(dá)量）

3 討論

人類slfn（也有稱SLFN）家族基因于1998年首次被報(bào)道，在免疫系統(tǒng)和惡性腫瘤中起重要作用[1]，并被確認(rèn)在哺乳動物系統(tǒng)和器官中廣泛表達(dá)[9-10]。slfn5基因被認(rèn)為與幾種惡性腫瘤的細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如Mavrommatis等[11]發(fā)現(xiàn)slfn5基因高表達(dá)可抑制惡性黑色素瘤的錨定非依賴性生長，而敲除slfn5基因則可以增強(qiáng)惡性黑色素瘤細(xì)胞侵襲三維膠原的能力。Sassano等[5]研究發(fā)現(xiàn)，slfn5通過負(fù)調(diào)控MMP-1和MMP-13抑制腎癌細(xì)胞的遷移和侵襲。slfn5還被認(rèn)為是一種乳腺癌抑制因子，可通過直接調(diào)節(jié)乳腺癌轉(zhuǎn)錄因子——鋅指E盒結(jié)合同源框（zinc-finger E-box binding homeobox,ZEB）蛋白1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抗癌作用[12]。但slfn5基因?qū)β殉舶┌l(fā)生、發(fā)展的作用還未見報(bào)道。本研究檢測了23例患者的卵巢癌組織和癌旁組織中slfn5 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對于癌旁組織，卵巢癌組織中slfn5 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)。相比卵巢表面上皮細(xì)胞，卵巢癌HO8910、SKOV3、OVCAR3細(xì)胞系均表現(xiàn)出SLFN5蛋白的高表達(dá)，證實(shí)了卵巢癌細(xì)胞和癌組織中存在slfn5基因表達(dá)上調(diào)。

腫瘤遷移和侵襲是兩個密切相關(guān)的病理過程，與腫瘤轉(zhuǎn)移息息相關(guān)。卵巢癌轉(zhuǎn)移是影響卵巢癌治療、預(yù)后以及復(fù)發(fā)的重要因素，因此，對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制研究是卵巢癌研究的重中之重。slfn5基因被證實(shí)在控制腎細(xì)胞癌（renal cell carcinoma,RCC）細(xì)胞的運(yùn)動性和侵襲性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。slfn5基因表達(dá)促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的運(yùn)動性和侵襲性[13]。本研究表明，沉默slfn5基因可以顯著抑制卵巢癌的遷移和侵襲能力。對轉(zhuǎn)染沉默slfn5基因的卵巢癌細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)下調(diào)slfn5基因抑制了卵巢癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力。沉默slfn5基因后，SKOV3、OVCAR3細(xì)胞的遷移、侵襲能力被有效抑制，細(xì)胞遷移率顯著低于對照組，提示slfn5基因可能通過促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞系的EMT實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遷移和侵襲。

EMT最早是在胚胎發(fā)育中發(fā)現(xiàn)的一個現(xiàn)象，成體的表皮細(xì)胞受到損傷后，也會出現(xiàn)相應(yīng)的EMT。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生、發(fā)展中，常常通過EMT丟失部分上皮細(xì)胞的特性來獲得一些間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而獲得更強(qiáng)的侵襲能力[14]。EMT的主要特征包括E-cadherin等上皮標(biāo)志物表達(dá)下降甚至缺失，而間質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的增加[15]。本研究中，沉默slfn5基因后，卵巢細(xì)胞系E-cadherin蛋白水平上調(diào)，Vimentin、Snail和N-cadherin下調(diào)，提示slfn5基因在卵巢癌細(xì)胞EMT中起抑制作用。E-cadherin下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間的黏附性減弱，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的脫落，后者隨血液和淋巴轉(zhuǎn)移[3]，被認(rèn)為是上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)型的重要特征。N-cadherin是一種神經(jīng)性鈣粘附蛋白，是細(xì)胞間動態(tài)黏附的重要結(jié)構(gòu)成分，在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)比正常上皮表型細(xì)胞高[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)水平與slfn5基因和SLFN5蛋白的表達(dá)水平有關(guān)，slfn5基因是EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，這為抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移提供了新的潛在治療靶點(diǎn)。

β-catenin是一種多功能蛋白，通過與細(xì)胞骨架的相互作用，協(xié)助細(xì)胞對細(xì)胞外的信號和影響作出響應(yīng)，其典型作用是通過Wnt/β-catenin信號通路激活核內(nèi)靶基因的表達(dá)[18]。EMT過程中，β-catenin介導(dǎo)E-cadherin受體與細(xì)胞骨架的附著，該細(xì)胞骨架與膜上的E-cadherin結(jié)合，完成從膜到核的易位[19]。βcatenin定位于正常上皮細(xì)胞和非侵襲性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜中，與E-cadherin分離后在細(xì)胞質(zhì)中積累并在EMT期間轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，以激活EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，特別是促進(jìn)Snail和ZEB1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[20]。本研究構(gòu)建了沉默slfn5基因的卵巢癌細(xì)胞系，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，相比對照組，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Snail、N-cadherin、Vimentin和 β-catenin顯著下調(diào)，E-cadherin顯著上調(diào)。Snail是E-cadherin的公認(rèn)抑制劑，可直接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)EMT，Snail還可以通過誘導(dǎo)E-cadherin阻遏物（如ZEB1）的表達(dá)并上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記Vimentin，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞黏附力的喪失，誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)細(xì)胞遷移，侵襲并最終轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官[21]。本研究中轉(zhuǎn)染細(xì)胞E-cadherin顯著高表達(dá)，Snail及其他EMT蛋白表達(dá)趨勢與β-catenin一致，與SLFN5表達(dá)趨勢一致，提示slfn5可能通過β-catenin-Snail-E-cadherin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，即slfn5基因可能通過β-catenin介導(dǎo)的Snail/E-cadherin信號通路在EMT和卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起作用[6]。

作為腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，EMT在腫瘤的診斷、分期和治療中起著重要的作用。利用EMT過程中涉及的分子發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶標(biāo)以及開發(fā)新的診斷和治療藥物可能成為癌癥早期診斷和治療的新策略[21]。本研究通過沉默slfn5基因調(diào)控EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，并抑制細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能是抑制βcatenin表達(dá)，調(diào)節(jié)了β-catenin介導(dǎo)的Snail/E-cadherin信號通路，從而降低Wnt/β-catenin信號通路活性。