詹東昂 柯峰 楊超 劉華

肝纖維化是對(duì)一系列慢性肝損傷的愈合反應(yīng)，主要特征為細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）過(guò)度沉積并最后發(fā)展為肝硬化[1]。肝星狀細(xì)胞被激活后增殖，大量分泌ECM導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生[2]。miRNA為小分子非編碼RNA，長(zhǎng)度約21～25個(gè)堿基，廣泛參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡及機(jī)體炎癥反應(yīng)等多種生命活動(dòng)[3-5]。相關(guān)研究報(bào)道m(xù)iRNA參與調(diào)節(jié)肝纖維化的發(fā)生，如馬艷華等[6]研究表明健康人與肝纖維化患者的血漿樣本中存在104個(gè)差異miRNA，其中72個(gè)表達(dá)下調(diào)，包括miR-450b-5p、miR-455-5p等，32個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，包括miR-16-5p、miR-182-5p等；冉龍嬌等[7]也發(fā)現(xiàn)在肝星狀細(xì)胞的活化及肝纖維化過(guò)程中，均有多種miRNA出現(xiàn)差異表達(dá)，或上調(diào)或下調(diào)。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)在線分析發(fā)現(xiàn)，miR-16-5p可能與程序性死亡受體-1（programmed cell death-1,PD-1）存在結(jié)合位點(diǎn)，PD-1及其配體PD-L1（CD274）屬于負(fù)共刺激分子，主要參與調(diào)控多種腫瘤及自身免疫性疾病的免疫逃逸過(guò)程，抑制免疫應(yīng)答的激活，目前作為腫瘤等治療的重要免疫檢查點(diǎn)[8]。相關(guān)研究表明，抑制PD-1/PD-L1表達(dá)與治療自身免疫性肝炎密切相關(guān)[9]。因此推測(cè)miR-16-5p可能介導(dǎo)PD-L1表達(dá)參與調(diào)控活化的肝星狀細(xì)胞及炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)以大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6為研究對(duì)象，探討miR-16-5p是否參與調(diào)控PD-L1表達(dá)而影響肝星狀細(xì)胞生理形態(tài)及炎癥水平，以期為臨床上治療肝纖維化及炎癥提供可能的治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要材料 肝星狀細(xì)胞HSC-T6（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH30022.01B）；FBS（美國(guó) Gibco公司，批號(hào)：10270-106）；PBS（批號(hào)：P1010）、胰蛋白酶（批號(hào)：T1350）和濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)：PC0020）均來(lái)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑（美國(guó)Ambion公司，批 號(hào) ：15596026）；轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子 β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1，英國(guó)Abcam公司）；CCK-8試劑盒（中國(guó)Solarbio公司，批號(hào)：CA1210）；蛋白質(zhì)Marker（美國(guó)Helix公司，批號(hào)：P12103）；PVDF轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑（中國(guó)Millipore公司，批號(hào)：IPVH00010）；鼠抗細(xì)胞PD-L1抗體、兔抗NF-κB抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體 、羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG（中國(guó)Bioswamp公司）；兔抗磷酸化的NF-κB（nuclear factor kappa B,p-NF-κB）抗體（中國(guó)CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，均按照1∶2～1∶4進(jìn)行傳代。將細(xì)胞分為6組并分別處理：對(duì)照組、模型組（5 ng/ml TGF-β1處理48 h）、miR-16-5p超表達(dá)組（轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimics 24 h后，再用 5 ng/ml TGF-β1處理48 h）、miR-16-5p抑制組（轉(zhuǎn)染miR-16-5p inhibitor 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1處理48 h）、超表達(dá)-空載組（轉(zhuǎn)染mimics-NC 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1處理48 h）和抑制-空載組（轉(zhuǎn)染inhibitor-NC 24 h后，再用5 ng/ml TGF-β1處理48 h）。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將 100 pmol miRNA、5 μl Lipofectamine 2000分別稀釋于250 μl Opti-MEM中，混勻后，將兩者混合液室溫孵育20 min，然后將其加入到融合度為90%的細(xì)胞中，37℃、5%CO2轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，測(cè)定miR-16-5p的表達(dá)水平以觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 各組細(xì)胞 TNF-α、IFN-γ、miR-16-5p、PD-L1、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-qPCR法。加入TGF-β1處理48 h收集細(xì)胞，用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)，其中GAPDH和U6作為內(nèi)參進(jìn)行樣品間的校正，使用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.4 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 收集各組細(xì)胞，稀釋細(xì)胞懸液濃度至1×105個(gè)細(xì)胞/孔，每孔2 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。對(duì)照組于正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，模型組、miR-16-5p超表達(dá)組、miR-16-5p抑制組、超表達(dá)-空載組和抑制-空載組的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為5 ng/ml的TGF-β1，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72或48 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，光鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)，拍照、收樣。

1.2.5 各組細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將細(xì)胞濃度稀釋為3×103個(gè)細(xì)胞/孔，取100 μl細(xì)胞液接種到96孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。對(duì)照組于正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，另外5組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為5 ng/ml的TGF-β1刺激48 h，然后均加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔450 nm處的吸光值，以吸光值表示細(xì)胞增殖能力。同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、CCK-8溶液），每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 各組細(xì)胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。收集各組細(xì)胞，加入適量預(yù)冷的1×PBS洗滌后，按照每1×106個(gè)細(xì)胞加入裂解液200 μl，充分裂解后，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。SDS-PAGE電泳后，選用90 V轉(zhuǎn)膜50 min，5%脫脂奶粉4℃封閉過(guò)夜，加一抗，PD-L1抗體（1∶2 000）、NF-κB抗體（1∶1 000）、p-NF-κB抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜，按照1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。洗膜，選用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，通過(guò)TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和模型組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較 光鏡下觀察可見(jiàn)，對(duì)照組和模型組細(xì)胞在開(kāi)始培養(yǎng)時(shí)（0 h），細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量無(wú)明顯差異。與對(duì)照組同期培養(yǎng)時(shí)間相比（24、48、72 h），模型組細(xì)胞數(shù)量明顯增多，延展性更好，并且5 ng/ml TGF-β1刺激后，細(xì)胞表現(xiàn)為肌纖維細(xì)胞形態(tài)的特征。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，細(xì)胞密度增大，形態(tài)變小，呈現(xiàn)出多邊形的梭形，且相鄰細(xì)胞有偽足相連，在培養(yǎng)板表面整齊均勻分布。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和模型組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較（a、b、c、d：分別為對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72 h；e、f、g、h：分別為模型組細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48、72 h；×200）

2.2 TGF-β1不同作用時(shí)間的模型組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較 與TGF-β1作用0 h相比，TGF-β1作用24 h時(shí)的模型組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；TGF-β1作用48、72 h時(shí)的模型組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較顯著增高（均P＜0.05），且以48 h時(shí)最高（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 TGF-β1不同作用時(shí)間的模型組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)水平比較

2.3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果比較 與對(duì)照組相比，超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞中miR-16-5p表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；與超表達(dá)-空載組相比，miR-16-5p超表達(dá)組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與抑制-空載組相比，miR-16-5p抑制組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-16-5p表達(dá)水平比較

2.4 模型組、miR-16-5p超表達(dá)組、miR-16-5p抑制組、超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較與模型組相比，miR-16-5p超表達(dá)組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，肌纖維細(xì)胞形態(tài)減少；miR-16-5p抑制組細(xì)胞數(shù)量明顯增多，形態(tài)無(wú)明顯變化；超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量無(wú)明顯差異。見(jiàn)圖4。

圖4 模型組、miR-16-5p超表達(dá)組、miR-16-5p抑制組、超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較（a：模型組；b：miR-16-5p超表達(dá)組；c：miR-16-5p抑制組；d：超表達(dá)-空載組；e：抑制-空載組；×200）

2.5 各組細(xì)胞增殖能力比較 與模型組相比，miR-16-5p-超表達(dá)組A值明顯降低（P＜0.05），細(xì)胞增殖能力下降；miR-16-5p抑制組A值明顯升高，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（P＜0.05）；超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞增殖能力均無(wú)明顯變化（均P＞0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞增殖能力比較

2.6 各組細(xì)胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平比較 與模型組相比，超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞中PD-L1、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）；miR-16-5p超表達(dá)組PD-L1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；miR-16-5p抑制組PD-L1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 各組細(xì)胞PD-L1、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)水平比較（a：蛋白表達(dá)電泳圖比較；b：PD-L1蛋白表達(dá)水平比較；c：p-NF-κB/NF-κB蛋白表達(dá)水平比較）

2.7 各組細(xì)胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)水平比較 與模型組相比，超表達(dá)-空載組和抑制-空載組細(xì)胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA 表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；miR-16-5p超表達(dá)組miR-16-5p、PD-L1、IL-10 mRNA表達(dá)水平均升高（均 P＞0.05），TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA 表達(dá)水平均降低（均P＞0.05）；miR-16-5p抑制組miR-16-5p、PD-L1、IL-10表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），TNF-α、IFN-γ、IL-6 mRNA表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 各組細(xì)胞miR-16-5p、PD-L1、TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10 mRNA表達(dá)水平比較

3 討論

肝星狀細(xì)胞分為靜息和激活兩種狀態(tài)，在某些介質(zhì)因素如活性氧物質(zhì)、纖維化細(xì)胞因子如TGF-β、血小板源生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）[10]等的刺激下，肝星狀細(xì)胞被激活，增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞（myofibroblast like cells,MFB）[2]。肝星狀細(xì)胞的活化屬于級(jí)聯(lián)活化模式，肝細(xì)胞受損后分泌有絲分裂的作用因子刺激自身細(xì)胞增殖，喪失接觸抑制能力，同時(shí)與其毗鄰細(xì)胞共同作用釋放大量TNF-α、TNF-β、IFN-γ等細(xì)胞因子促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化、增殖，另外MFB樣細(xì)胞也會(huì)自分泌TGF、PDGF等細(xì)胞因子促進(jìn)自身的活化及增殖等[11]。本研究選用TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞0、24、48、72 h，TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β/Smad信號(hào)通路是肝星狀細(xì)胞活化及增生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖具有時(shí)間誘導(dǎo)依賴(lài)性，細(xì)胞數(shù)量隨藥物處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增多，另外發(fā)現(xiàn)TGF-β1刺激HSC-T6細(xì)胞48 h，細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IFN-γ表達(dá)含量顯著升高，這表明TGF-β1處理48 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)最強(qiáng)，HSC活化正處于最繁盛時(shí)期。因此篩選此時(shí)間點(diǎn)為T(mén)GF-β1的最佳作用時(shí)間。

我國(guó)有大量的急性肝炎發(fā)展為慢性炎癥，最終形成肝硬化的病例。肝纖維化的發(fā)展速度受發(fā)病病因、環(huán)境和遺傳因素等的影響[12]。近年來(lái)大量文獻(xiàn)表明多種miRNA與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，miRNA的異常表達(dá)參與調(diào)控HSC的活化及肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路[13]。如Lakner等[14]通過(guò)miRNA微陣列分析靜息態(tài)HSC被激活后miRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)3種miRNA表達(dá)上調(diào)（miR-34c、miR-184和miR-221），8種miRNA表達(dá)下調(diào)（miR-16、miR-19a、miR-19b、miR-29a、miR-29c、miR-92a、miR150、miR-194）。本研究發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞被TGF-β1刺激活化后，胞內(nèi)miR-16-5p的表達(dá)水平也出現(xiàn)下調(diào)，并且預(yù)測(cè)的目的靶蛋白PD-1表達(dá)水平也明顯下降，與miR-16-5p的表達(dá)呈正相關(guān)。PD-1是一種免疫共抑制分子，通過(guò)負(fù)調(diào)控T、B細(xì)胞激活而抑制免疫應(yīng)答，張宏宇等[15]研究表明PD-1通過(guò)抑制其表達(dá)降低肝細(xì)胞損傷，減少炎癥反應(yīng)，抑制肝炎向肝纖維化的發(fā)展。本研究檢測(cè)肝星狀細(xì)胞活化后相關(guān)炎癥細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)促炎癥因子p-NF-κB/NF-κB、TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)水平顯著升高，而抗炎因子IL-10表達(dá)水平明顯降低。NF-κB可調(diào)控多種炎癥和抗炎因子的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化、增殖從而影響肝纖維化的發(fā)展[16-17]；IFN-γ和TNF-α在人表皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中具有協(xié)同促進(jìn)PD-L1表達(dá)的作用[11]。與之相同，對(duì)比模型組，miR-16-5p超表達(dá)組細(xì)胞內(nèi)miR-16-5p、PD-L1表達(dá)上調(diào)，炎癥反應(yīng)降低，抑制細(xì)胞增殖；miR-16-5p抑制組miR-16-5p、PD-L1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活化增殖，炎癥反應(yīng)加劇。

綜上所述，miR-16-5p在激活的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)水平低于靜息態(tài)細(xì)胞，高表達(dá)miR-16-5p可促進(jìn)PD-L1表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能參與治療肝纖維化的發(fā)展。