趙婷，付君沐，尹懷寧，方尚玲，李小強*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2.湖北將軍紅健康產(chǎn)業(yè)股份有限公司，湖北 麻城 438399)

大蒜是百合科多年生草本植物的鱗莖[1-2]，富含功能性成分及營養(yǎng)價值[3]，被作為一種藥食兩用的植株[4]。大蒜在日常生活中通常被用于調(diào)味料，因其含有鉀、鈣、磷等微量元素以及多種人體必需氨基酸，被人們稱為“天然抗生素”[5]，已普遍在食品、藥品、養(yǎng)生等方面使用[6-7]。大蒜素是一種天然的活性物質(zhì)[8]，其具有抑菌、防氧化、減少膽固醇等功能[9-10]，可以作為制作安全有益產(chǎn)品的最佳添加劑，代替抗生素；其次是用于腫瘤治療的一種藥物[11-14]。相關(guān)研究表明，新鮮的大蒜中并不直接含有大蒜素，而是含有蒜氨酸。蒜氨酸是一種在大蒜中并不穩(wěn)定存在的大蒜素的前體物質(zhì)[15-16]，其在大蒜細胞破裂時被釋放并活化，催化蒜氨酸形成大蒜素。

綜合國內(nèi)外關(guān)于大蒜素提取的方法主要有3種：有機溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取法。其中，有機溶劑提取法具有成本低、設(shè)備簡單、操作簡便、提取率高等特點，作為人們常用的提取方法，被用于食品、藥品等領(lǐng)域[17]。水蒸氣蒸餾法，雖然設(shè)備簡易且使用方便，但在高溫的蒸餾條件下會導(dǎo)致蒜氨酸酶失活，大蒜素提取效率較低。超臨界CO2萃取法，具有高提取率、高質(zhì)量的特點，但工藝成本高，不易作為制備高附加值食品的方法大規(guī)模投入工業(yè)化生產(chǎn)[18]。用于衡量大蒜及其加工產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)是大蒜素的含量。目前以大蒜為原料制作的深加工產(chǎn)品有很多，其中大蒜酒是利用酒精浸提半發(fā)酵法釀造的，其特點是無大蒜異臭味，能保持大蒜的清香，有抑菌的作用[19-20]。綜合考慮，本實驗采用乙醇作為有機溶劑提取大蒜素，可為后續(xù)開發(fā)大蒜酒、大蒜醋及大蒜膏等高附加值產(chǎn)品作準(zhǔn)備。

續(xù) 表

從大蒜中提取大蒜素，需先破碎大蒜，經(jīng)自然酶解，釋放蒜氨酸酶并催化形成大蒜素。大蒜素的性質(zhì)不穩(wěn)定，易揮發(fā)，因此在提取工藝中料液比、酶解條件、提取時間等因素都會影響大蒜素的提取率[21]。利用大蒜素可與半胱氨酸反應(yīng)的原理，通過DTNB法測定半胱氨酸前后的減少量，間接得出大蒜素的含量。在3種干、濕大蒜中選取大蒜素含量最高的一種大蒜為原料，通過對大蒜素提取率有影響的5個因素進行單因素實驗，選取3個影響較大的因素結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化大蒜素的提取工藝條件，以確定最佳工藝。本研究為大蒜深加工產(chǎn)品的開發(fā)和大蒜素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

干、濕蒜(河北永年、山東金鄉(xiāng)和四川彭州)：市售；食用酒精(95%)：武漢某酒廠提供。

1.2 試劑

半胱氨酸(C3H7NO2S)、Tris試劑：廣州賽國生物科技有限公司；DTNB(5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))：美國Sigma公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

AR3130電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；恒溫搖床 上海智誠實驗設(shè)備有限公司；5424R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 浙江金壇市富華儀器有限公司；UV-2102型紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 大蒜素的提取

將大蒜去表皮洗凈，搗成泥狀。取20 g蒜泥在一定溫度下自然酶解一段時間，加入一定體積、濃度的乙醇溶液，放置于恒溫搖床40 ℃、150 r/min振蕩浸提蒜泥2 h，離心分離后取上清液，備用。

大蒜→去皮→搗碎→自然酶解→乙醇浸提→離心→上清液。

1.4.2 大蒜素的測定

根據(jù)DTNB法測定半胱氨酸含量原理[22]：

A0：0.5 mL V1+1 mL V2+3.5 mL V3→26 ℃保溫15 min→于412 nm處測定吸光值。

A：0.5 mL V1+0.5 mL V4→26 ℃保溫15 min→1 mL V2+3.0 mL V3→26 ℃保溫15 min→于412 nm處測定吸光值。

其中，V1為半胱氨酸溶液(1.0 mmol/L)；V2為DTNB溶液(1.0 mmol/L)；V3為Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.5)；V4為適量稀釋的待測液。

根據(jù)半胱氨酸減少量計算出大蒜素含量，計算公式如下：

式中：△A412=A0-A；d為總稀釋倍數(shù)；14150為NTB(2-硝基-5-硫代苯甲酸)在412 nm，1 cm光徑摩爾消光系數(shù)。

1.4.3 不同品種大蒜的大蒜素測定

采用河北永年(濕蒜和干蒜)、山東金鄉(xiāng)(濕蒜和干蒜)和四川彭州(干蒜)的大蒜為原料，測定其中大蒜素的含量，選取實驗最佳品種。

1.4.4 單因素實驗

分別確定料液比、酶解溫度、酶解時間、乙醇濃度和浸提時間這5個單因素對大蒜素提取的影響，見表1。設(shè)計五因素五水平的單因素實驗，測其大蒜素含量[23-24]。每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

表1 大蒜素提取工藝單因素實驗

1.4.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對大蒜素提取效果影響顯著的3個因素為自變量，以大蒜素為響應(yīng)值(Y)進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計Box Behnken實驗，確定最優(yōu)的提取條件并進行實驗驗證[25]。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8.2.1軟件對數(shù)據(jù)進行處理和作圖，采用Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種大蒜的大蒜素測定

由表2可知，比較3個不同品種的干、濕蒜的大蒜素含量，發(fā)現(xiàn)彭州干蒜的大蒜素含量最高，達到0.138 mmol/100 g。

表2 不同品種干、濕蒜的大蒜素含量

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 料液比對大蒜素提取的影響

料液比對大蒜素含量的影響見圖1。

圖1 料液比對大蒜素含量的影響

由圖1可知，大蒜素含量隨著料液比從1∶4～1∶6的增加而上升，當(dāng)料液比為1∶6后大蒜素含量開始下降。原因是乙醇用量越多，大蒜素提取率越高，當(dāng)料液比增加至一定比例時，大蒜素基本溶出，料液比再增加大蒜素含量有所降低可能是因為大蒜素是不穩(wěn)定的硫化物，會有副產(chǎn)物溶出。所以，料液比在1∶6后大蒜素含量下降。因此，選擇最佳料液比為1∶6。

2.2.2 乙醇濃度對大蒜素提取的影響

乙醇濃度對大蒜素含量的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對大蒜素含量的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的升高，大蒜素含量緩慢上升，當(dāng)乙醇濃度為85%時，大蒜素含量最高，為0.172 mmol/100 g。隨后大蒜素含量下降，可能是因為乙醇濃度過高會導(dǎo)致蒜氨酸酶失活，生成的大蒜素減少。因此，選擇最佳乙醇濃度為85%。

2.2.3 酶解溫度對大蒜素提取的影響

酶解溫度對大蒜素含量的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對大蒜素含量的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，大蒜素的含量呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢。大蒜素的提取含量在35 ℃酶解時最高，可達到0.160 mmol/100 g。蒜氨酸酶在低溫條件下酶活性較低，催化大蒜素的形成不完全；但大蒜素在較高的溫度下不穩(wěn)定，易分解。因此，最佳的酶解溫度為35 ℃。

2.2.4 酶解時間對大蒜素提取的影響

酶解時間對大蒜素含量的影響見圖4。

圖4 酶解時間對大蒜素含量的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的延長，大蒜素的提取含量先增加，酶解30 min時大蒜素含量為0.162 mmol/100 g，達到最高，隨后呈現(xiàn)減少的趨勢。蒜氨酸在較短時間內(nèi)并不能夠充分轉(zhuǎn)換成大蒜素，提取含量低。酶解時間過長，大蒜素不再生成，且大蒜素易揮發(fā)，整體含量下降。因此，選擇最佳酶解時間為30 min。

2.2.5 浸提時間對大蒜素提取的影響

浸提時間對大蒜素含量的影響見圖5。

圖5 浸提時間對大蒜素含量的影響

由圖5可知，隨著浸提時間的延長，大蒜素的含量呈先增加后逐漸減少的趨勢。大蒜素的含量在浸提時間為2 h時最高，為0.164 mmol/100 g。分析可能是前期浸提時間較短對大蒜素向乙醇相的轉(zhuǎn)移有影響；而浸提時間過長時，已生成的大蒜素因其不穩(wěn)定會揮發(fā)或分解成其他物質(zhì)。因此，選擇最佳浸提時間為2 h。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定料液比(A)、浸提時間(B)、乙醇濃度(C)對大蒜素提取影響較大的3個因素為自變量，以大蒜素的含量(Y)為因變量。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計的實驗因素與水平見表3；響應(yīng)面分析設(shè)計17個實驗點，實驗設(shè)計與結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken實驗因素與水平

表4 Box-Behnken實驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0.6軟件對表4的實驗結(jié)果進行多元二次回歸擬合，回歸方程的方差分析結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面回歸方程的方差分析

由表5可知，回歸模型的F值為93.82，且顯著性檢驗(P<0.0001)為極顯著，失擬項(P=0.6781>0.05)為不顯著，說明該模型具有可靠性。

利用響應(yīng)面分析軟件對表5中的數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到大蒜素含量對自變量料液比、乙醇濃度、浸提時間的多元回歸方程為：大蒜素=0.16+1.250E-004A-1.750E-003B+2.625E-003C+1.000E-003AB-4.250E-003AC+0.000BC-0.016A2-7.425E-003B2-3.175E-003C2，回歸方程決定系數(shù)R2=99.18%，RAdj2=98.12%，表明該模型的預(yù)測值與實際值之間存在良好的可信度和擬合度，該方案結(jié)果可靠。

2.3.3 各因素響應(yīng)面交互作用分析

利用響應(yīng)面分析軟件對二次響應(yīng)面回歸模型作出對應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，見圖6。

a

由響應(yīng)曲面圖可以清楚地看出各因素之間存在交互作用。由圖6可知，AB、BC和AC兩者間均有顯著的交互作用，因此響應(yīng)面曲線的分析結(jié)果是準(zhǔn)確的。

2.4 最佳提取條件的確定及驗證

從上述回歸模型中求得大蒜素的最佳提取條件：料液比為1∶5.94，浸提時間為1.88 h，乙醇濃度為87.28%。此條件下，模型預(yù)測值大蒜素含量為0.163 mmol/100 g。考慮到實際情況，調(diào)整條件為料液比1∶6、浸提時間2 h、乙醇濃度87%進行驗證實驗。結(jié)果表明，在最佳提取條件下大蒜素含量達到0.162 mmol/100 g，與預(yù)測值基本接近，說明所建模型擬合良好且可靠。

3 結(jié)論

本文以四川彭州大蒜為原料，選擇乙醇有機溶劑提取大蒜素的工藝條件。通過料液比、酶解溫度、酶解時間、乙醇濃度、浸提時間5個提取條件進行單因素實驗，利用響應(yīng)面實驗對影響較大的3個因素進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為：料液比1∶5.94、浸提時間1.88 h、乙醇濃度87.28%。考慮實際情況調(diào)整為料液比1∶6、浸提時間2 h、乙醇濃度87%，在此條件下進行驗證，模型預(yù)測值大蒜素含量為0.162 mmol/100 g，比前期報道的提取大蒜素效果較好。該研究對大蒜素提取條件進行初探，后續(xù)可進行濃縮用于開發(fā)大蒜酒、大蒜醋、大蒜浸膏等功能性食品，為大蒜深加工產(chǎn)品的開發(fā)和大蒜素工業(yè)化的生產(chǎn)提供了一定的理論依據(jù)。