李乾龍，王萬(wàn)雯，吳萌華，楊應(yīng)東，萬(wàn)潔，文建國(guó)，殷蓓蓓，郝桂英

（1.西昌學(xué)院動(dòng)物科學(xué)院，四川西昌 615013；2.攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院畜牧水產(chǎn)所，四川攀枝花 617061；3.西昌華寧生物科技有限公司，四川西昌 615000）

立克次體是一類以蜱為主要傳播媒介的病原微生物，是專性寄生于真核細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性原核生物，介于細(xì)菌與病毒之間，較接近于細(xì)菌，在蜱蟲體內(nèi)可經(jīng)卵垂直傳播給下一代，通過(guò)叮咬可水平傳播給宿主，引起多種人獸共患病[1]。在遺傳進(jìn)化史上，立克次體主要分為斑疹傷寒和斑點(diǎn)熱群立克次體[2]。目前我國(guó)流行的立克次體至少有10種[3]，包括日本立克次體（Rickettsia japonica）、黑龍江立克次體（Rickettsia heilongjiangensis）、立克次體XY99（Rickettsiasp.XY99）、拉烏爾立克次體（Rickettsia raoultii）、西伯利亞立克次體BJ-90亞種（Rickettsia sibiricasubsp.BJ-90）等[4]。近幾年我國(guó)又發(fā)現(xiàn)了幾種新的蜱傳立克次體，如Candidutus Rickettsia jiaonani[5]、Rickettsia erhaii[6]等。隨著新的立克次體不斷被發(fā)現(xiàn)，該病原逐漸受到了更多學(xué)者的重視。

我國(guó)已先后從黑龍江、新疆、內(nèi)蒙古、北京、福建、海南、廣東、云南、廣西、四川等?。▍^(qū)、市）的蜱中檢測(cè)到立克次體[7-8]。Yuan等[9]在我國(guó)云南、廣西、廣東等地檢測(cè)到新型立克次體GD01 株，總陽(yáng)性率為12.5%（71/569）。Zhang等[10]報(bào)道我國(guó)四川省蒼溪縣主要流行兩種立克次體，總體陽(yáng)性率為33.5%（63/188）。隨著調(diào)查研究深入，我國(guó)多地發(fā)現(xiàn)蜱攜帶立克次體，且其流行范圍廣，潛在危害大。

攀西地區(qū)位于四川省西南部，山場(chǎng)廣闊，河谷光熱資源豐富，這為動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供了優(yōu)良環(huán)境，同時(shí)也給蜱類孳生提供了條件。本地區(qū)牛羊以放牧為主，因此增加了牛羊被蜱叮咬的概率和感染蜱傳病原的風(fēng)險(xiǎn)。目前關(guān)于攀西地區(qū)蜱的區(qū)系分布及蜱傳立克次體感染情況的調(diào)查研究報(bào)道較少。為了解攀西地區(qū)蜱傳立克次體的流行情況，對(duì)采集自攀西地區(qū)的蜱進(jìn)行種類鑒定和立克次體分子檢測(cè)，以期為攀西地區(qū)蜱傳立克次體病的綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蜱類采集與處理

2021 年6 月至2022 年3 月，在涼山彝族自治州和攀枝花市，隨機(jī)選擇牛羊，共采集其體表的蜱252 只，其中西昌市38 只（羊源10 只、牛源28 只）、鹽源縣23 只（牛源）、美姑縣30 只（羊源）、木里縣19 只（羊源）、會(huì)東縣21 只（羊源）、布拖縣7 只（羊源）、昭覺縣7 只（牛源）、普格縣7只（牛源）、米易縣40 只（羊源）、鹽邊縣60 只（羊源），編號(hào)標(biāo)記后保存于1.5 mL 離心管中待檢。

1.2 主要儀器及試劑

冷凍混合球磨儀（MM400），德國(guó)萊馳公司產(chǎn)品；電泳儀（JY600E），北京君意電泳儀科技有限公司產(chǎn)品；SDS-PAGE 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)GelDocXR+公司產(chǎn)品；銀制PCR 儀（Nexus GSX）、高速離心機(jī)（5810R）、冰箱（U725）、可調(diào)微量移液槍，均為德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；試劑主要有：2×EasyTaqPCR superMix、DL 2 000 DNA Maker、TBE（tris-硼酸電泳緩沖液）、核酸染料、生理鹽水等。

1.3 基因組DNA 提取

首先對(duì)蜱進(jìn)行觀察，根據(jù)鄧國(guó)藩等[11]主編的《中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲志.硬蜱科》進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定；然后將蜱蟲洗凈放入1.5 mL 離心管中（如為成蜱可剪取一半），用干凈的剪刀將蜱蟲剪碎后加入200 μL 滅菌生理鹽水，再向離心管中加入4 粒鋼珠，研磨8 min 及以上；取出鋼珠后，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA 并置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 蜱種類分子鑒定

根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)[12]對(duì)蜱蟲16S rRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR 擴(kuò)增體系（25.0 μL）：

2×EasyTaqPCR superMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，引物T16SP1和T16SP2各1.0 μL，模板1.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 45 s、50 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共38 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所得到的陽(yáng)性樣本進(jìn)行切膠送生物公司測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)確定蜱種類。

表1 蜱種類鑒定引物信息

1.5 立克次體基因擴(kuò)增及鑒定

采用郭利萍[13]報(bào)道的引物，擴(kuò)增外膜蛋白A編碼基因（ompA）；采用高悅等[2]報(bào)道的套式PCR引物，擴(kuò)增立克次體檸檬合成酶編碼基因（gltA）。以上引物均由上海杰李生物有限公司合成，引物序列見表2。

表2 立克次體引物名稱、序列及其目的條帶

PCR 擴(kuò)增體系（25.0 μL）：2×EasyTaqPCR superMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL。

ompA基因擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、46 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 6 min。

gltA基因第一輪擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 80 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。第二輪擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。

PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，選取陽(yáng)性產(chǎn)物送至生工生物工程（成都）有限公司雙向測(cè)序。

1.6 立克次體gltA、ompA 測(cè)序序列分析

將測(cè)序得到的立克次體gltA、ompA基因片段，經(jīng)拼接剪切后通過(guò)Blast 進(jìn)行同源性比對(duì)，下載同源性較高的序列作為參考序列，同時(shí)下載不同種立克次體的同源基因序列，利用MEGA-X 通過(guò)Maximum Likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并設(shè)置自舉值為1 000。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

立克次體感染情況用Excel 軟件分析。對(duì)不同地區(qū)、不同宿主的蜱攜帶立克次體陽(yáng)性率，利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異顯著即存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＞0.05 時(shí)，差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 蜱蟲種類鑒定

對(duì)252 只蜱蟲先進(jìn)行形態(tài)觀察鑒定，再通過(guò)PCR 擴(kuò)增16S rRNA 基因，經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)電泳條帶與目的條帶（460 bp）基本一致（圖1）。陽(yáng)性樣本測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast 比對(duì)，確定為微小扇頭蜱和褐黃血蜱。

2.2 立克次體PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后得到的目的條帶均與預(yù)期目的片段（ompA為510 bp，gltA為381 bp）大小一致（圖2），分別擴(kuò)增出74份ompA基因和11份gltA基因陽(yáng)性樣本。

圖1 蜱16S rRNA 基因片段PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果

圖2 立克次體ompA、gltA 基因PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2.1ompA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建共有29 個(gè)陽(yáng)性樣本ompA基因測(cè)序成功，進(jìn)行剪切后序列長(zhǎng)度約為486 bp。ompA基因片段序列同源性分析顯示：主要存在兩種斑點(diǎn)熱立克次體序列，樣本BTY227 序列與我國(guó)陜西省長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢測(cè)到的敬信立克次體暫定種（Candidatus R.jingxinensis，MH932061）同源性為100%（483/483 bp），XCY98 與微小扇頭蜱中檢測(cè)到的立克次體共生菌（Rickettsia endosymbiontofRhipicephalus microplus，MN537556）同源性為100%（486/486 bp）。以Rickettsia akari為外群，基于ompA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）顯示：BTY227 與敬信立克次體暫定種聚為一支，親緣關(guān)系近；XCY98 與立克次體共生菌聚為一支，親緣關(guān)系近，且與馬賽立克次體、扇頭立克次體有較近的親緣關(guān)系。

圖3 基于ompA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2gltA基因擴(kuò)增結(jié)果分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建共有11 份陽(yáng)性樣本gltA基因測(cè)序成功，序列長(zhǎng)度約為366 bp。gltA基因片段序列同源性分析顯示：主要存在兩種斑點(diǎn)熱立克次體序列，樣本BTY227與從我國(guó)南方微小扇頭蜱體內(nèi)分離的敬信立克次體暫定種（Candidatus R.jingxinensis，MW114883）同源性為100%（366/366 bp），MYY86 與從意大利血紅扇頭蜱體內(nèi)分離的馬賽立克次體（R.massiliae，KJ663741）同源性為99.73%（365/366 bp）。以Rickettsia bellii為外群，基于gltA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示：BTY227 與敬信立克次體暫定種聚為一支，親緣關(guān)系近；MYY86 與馬賽立克次體聚為一支，有較近的親緣關(guān)系。

圖4 基于gltA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 蜱傳立克次體感染率統(tǒng)計(jì)

2.3.1 不同種類 從采集的252 份蜱樣品中，共檢出立克次體74 份，總體陽(yáng)性率為29.37%（74/252）。共檢出31 份敬信立克次體暫定種（Candidatus R.jingxinensis），其中西昌牛源9 份、米易羊源5 份、普格牛源2 份、會(huì)東牛源6 份、美姑牛源5 份、木里羊源1 份、布拖羊源3 份；檢出立克次體共生菌（Rickettsia endosymbiontofRhipicephalus microplus）2 份，均為西昌羊源；檢出馬賽立克次體（R.massiliae）1 份，為米易羊源。由此推斷，敬信立克次體暫定種為攀西地區(qū)立克次體優(yōu)勢(shì)種。

2.3.2 不同采集地 本次采集的蜱來(lái)自10 個(gè)縣市，不同采集地的蜱攜帶立克次體陽(yáng)性率不同。ompA基因檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示：布拖陽(yáng)性率最高，為57.14%，其次為西昌55.26%，會(huì)東42.86%；經(jīng)卡方檢驗(yàn)，10 個(gè)縣市中，排除未檢測(cè)到立克次體的鹽源、昭覺后，剩余8 個(gè)縣市的蜱攜帶立克次體陽(yáng)性率 差異顯著（P=0.023，＜0.05）。gltA基因檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示：同樣是布拖陽(yáng)性率最高，為28.57%，其次為普格14.29%、美姑13.33%；經(jīng)卡方檢驗(yàn)，10 個(gè)縣市中，排除未檢出的縣市，不同縣市的蜱攜帶立克次體陽(yáng)性率差異不顯著（P=0.611）。單位：%

表3 不同縣市蜱攜帶立克次體檢測(cè)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)

2.3.3 不同宿主 從總體來(lái)看，不同牛羊來(lái)源蜱攜帶的立克次體陽(yáng)性率相近，其中牛源蜱攜帶的立克次體陽(yáng)性率為29.55%，羊源蜱攜帶立克次體陽(yáng)性率為29.27%（表4）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，牛、羊宿主蜱攜帶的立克次體陽(yáng)性率差異不顯著（P=1.000）。但在西昌市，蜱攜帶的立克次體情況與宿主有顯著差異（P=0.009），而在美姑縣，蜱攜帶立克次體情況與宿主無(wú)顯著差異（P=0.708）。

3 討論

因蜱的發(fā)育經(jīng)歷了卵、幼蜱、若蜱、成蜱，因此通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察需要鑒定人員具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，因此分子學(xué)鑒定更受廣大學(xué)者青睞。用于蜱分子生物學(xué)鑒定的基因主要有16S rRNA、COI、COII、ITS-1、ITS-2[12，14-15]。16S rRNA 基因序列高度保守，因此常作為蜱種類鑒定靶基因。攀西地區(qū)幅員遼闊，地理、氣候等特點(diǎn)適合蜱生活繁衍。而該地區(qū)蜱的區(qū)系分布調(diào)查仍處于空白。本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，微小扇頭蜱為攀西地區(qū)的優(yōu)勢(shì)蜱種，并分布有褐黃血蜱。該結(jié)果與姚曉燕等[16]對(duì)我國(guó)微小扇頭蜱分布情況的總結(jié)相符。攀西地區(qū)位于川南，與云南省接壤且與其氣候特點(diǎn)類似，也屬于微小扇頭蜱生長(zhǎng)的中高適生區(qū)。

表4 不同宿主來(lái)源蜱攜帶的立克次體檢測(cè)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)單位：%

目前針對(duì)蜱攜帶立克次體的檢測(cè)方法多樣，但用于流行病學(xué)調(diào)查的仍以分子生物學(xué)檢測(cè)方法為主，包括普通PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及自殺式PCR（suicide PCR）[17]。主要的靶基因有16S rRNA、檸檬合成酶基因（gltA）、外膜蛋白A 基因（ompA）、外膜蛋白B 基因（ompB）以及細(xì)胞表面抗原1（sca1）、細(xì)胞表面抗原4（sca4）、17 kDa 蛋白抗原等編碼基因。其中ompA與ompB對(duì)斑點(diǎn)熱群立克次體有較好的特異性及鑒別性，即不同斑點(diǎn)熱群立克次體，其ompA表現(xiàn)出種的特異性，對(duì)斑點(diǎn)熱群立克次體的基因型、亞型鑒定及分類具有重要意義，此外ompA基因還可以準(zhǔn)確把握斑點(diǎn)熱群立克次體的遺傳變異特征[18]。

唐天才[19]報(bào)道四川省石渠縣斑點(diǎn)熱立克次體總陽(yáng)性率為49.48%，盛悅[20]報(bào)道內(nèi)蒙古斑點(diǎn)熱群立克次體總陽(yáng)性率為37.7%。而本研究發(fā)現(xiàn)，攀西地區(qū)蜱攜帶立克次體陽(yáng)性率為29.37%，低于上述兩個(gè)地區(qū)。攀西地區(qū)作為四川省的西部城市群，有發(fā)展農(nóng)牧業(yè)得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，屬于典型的半農(nóng)牧地區(qū)，相比純牧區(qū)的內(nèi)蒙古及石渠縣，其立克次體陽(yáng)性率的差異可能與蜱種類分布及氣候、海拔等自然條件不同有關(guān)。蜱蟲傳播需要借助宿主來(lái)完成，例如依靠鳥類遷徙、牲畜貿(mào)易等。攀西地區(qū)各地交通不便，蜱蟲傳播途徑受限，導(dǎo)致各地區(qū)蜱種類及數(shù)量有差異，進(jìn)而導(dǎo)致其攜帶的立克次體陽(yáng)性率不同。此外，采樣過(guò)程中經(jīng)咨詢牧民與養(yǎng)殖戶得知，不同地區(qū)不同養(yǎng)殖戶的驅(qū)蟲意識(shí)參差不齊，導(dǎo)致個(gè)別地區(qū)蜱蟲孳生，蜱攜帶的立克次體陽(yáng)性率較高。不同宿主蜱攜帶的立克次體陽(yáng)性率差異不顯著，這與該地區(qū)蜱蟲無(wú)差別叮咬有關(guān)，而個(gè)別地區(qū)陽(yáng)性率差異顯著可能與牛羊養(yǎng)殖模式不同等因素有關(guān)。

本研究證實(shí)，攀西地區(qū)存在3 種立克次體，其中敬信立克次體暫定種為優(yōu)勢(shì)種，其與Guo等[21]報(bào)道的陜西省長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)敬信立克次體暫定種序列（MH932061）同源性高達(dá)100%；且系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，兩個(gè)地區(qū)的立克次體處于同一分支。以上表明，敬信立克次體暫定種可能是國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)的立克次體優(yōu)勢(shì)種，需要重點(diǎn)加強(qiáng)對(duì)其流行的控制。馬賽立克次體與斑點(diǎn)熱感染有關(guān)，首次于法國(guó)扇頭蜱屬體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)[22]。Wei等[23]首次在國(guó)內(nèi)西北部的新疆伊犁縣圖蘭扇頭蜱體內(nèi)檢測(cè)到馬賽立克次體，其蜱攜帶率為3.50%（4/114）；Guo等[24]在西北部塔克拉瑪干沙漠圖蘭扇頭蜱體內(nèi)檢測(cè)到馬賽立克次體，蜱攜帶率為1.71%（2/117）。本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，微小扇頭蜱的立克次體攜帶率為0.40%（1/252），與上述結(jié)果基本相符，存在低攜帶率現(xiàn)象且都發(fā)現(xiàn)于扇頭蜱屬。綜上，攀西地區(qū)存在發(fā)生立克次體病的潛在威脅，應(yīng)重視蜱傳立克次體病預(yù)防。

目前攀西地區(qū)乃至涼山彝族自治州均缺乏系統(tǒng)的蜱種檢測(cè)及蜱傳立克次體的分析與研究。涼山州及周邊多為少數(shù)民族群居，天然放牧為主的飼養(yǎng)方式使得人們與自然及牲畜接觸增多，被蜱叮咬的概率較大，蜱傳立克次體病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較高。因此，當(dāng)?shù)貞?yīng)做好對(duì)牛、羊等家畜的驅(qū)蟲工作，避免在蜱蟲活動(dòng)高峰期放牧，采取相應(yīng)防護(hù)措施，防止被蜱蟲叮咬。各縣市應(yīng)設(shè)立哨點(diǎn)醫(yī)院，重點(diǎn)監(jiān)測(cè)、控制和治療蜱傳立克次體病，做好宣傳，提高群眾防范意識(shí)，以保證公共衛(wèi)生安全及畜牧業(yè)有序發(fā)展。