陳晶，袁敏，侯志濤，2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，哈爾濱 150040；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點實驗室，北京 100700）

失眠是全球最普遍的睡眠障礙，自從2019年以來，中國失眠的發(fā)生率顯著升高[1]。而且失眠是最廣泛的精神障礙之一，影響著人們的生理心理健康，往往會導(dǎo)致肥胖和糖尿病、自殺及心血管等疾病發(fā)病率的增加[2]。失眠一般指入睡和維持睡眠障礙，最早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載為“目不瞑”“不寐”，其主要病機(jī)是衛(wèi)行于外，陽不入陰?！额愖C治裁·不寐》中論述為“不寐者，病在陽不交陰也”。心腎為水火之臟，水火者陰陽也，交通心腎，實則交通陰陽，陰陽交則寐。健忘則指較長時期內(nèi)記憶力減退、遇事容易遺忘，古籍中稱為“喜忘”或“善忘”，常伴有失眠、心悸、頭暈等不適。清代林佩琴在《類證治裁·健忘》中指出：“治健忘者，必交其心腎，使心之神明，下通于腎，腎之精華，上升于腦，精能生氣，氣能生神，神定氣清，自鮮遺忘之失。”且健忘癥可進(jìn)行性加重發(fā)展為癡呆，給患者及社會造成較重的負(fù)擔(dān)。失眠和健忘雖然屬于兩種不同的疾病，但研究發(fā)現(xiàn)[3]在所有失眠患者中，健忘的伴發(fā)率超過了53.42%，是入睡功能障礙患者最主要的伴發(fā)癥之一。可見，臨床上多表現(xiàn)為失眠-健忘共病的患病特點。研究發(fā)現(xiàn)睡眠障礙和學(xué)習(xí)記憶功能存在顯著相關(guān)性，兩者可以相互影響；睡眠障礙的反復(fù)發(fā)作會影響患者正常的生理功能，還會導(dǎo)致記憶力等認(rèn)知功能的下降；而記憶力下降等認(rèn)知功能的損傷也會引起睡眠障礙[4]。

目前，對失眠主要采用認(rèn)知行為療法、藥物干預(yù)、中醫(yī)藥干預(yù)等進(jìn)行防治；但由于認(rèn)知行為的治療費時、效果慢且無法普及，以苯二氮卓類、褪黑素受體激動劑和具有鎮(zhèn)靜抗抑郁等為主的藥物治療也存在著嚴(yán)重的不良反應(yīng)大、依賴性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高等問題[5]；而中醫(yī)藥治療效果顯著，不良反應(yīng)小，臨床應(yīng)用廣泛。有關(guān)記憶力下降的發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床上治療此類疾病的靶向藥物尚未出現(xiàn)明確療效?？资フ碇械こ鲎蕴拼鷮O思邈《備急千金要方·卷十四》，由龜板、龍骨、石菖蒲、遠(yuǎn)志組成，具有補腎寧心，安神益智的功效。有關(guān)孔圣枕中丹的方解清·汪昂在《醫(yī)方集解》中論述：治讀書善忘，久服令人聰明……遠(yuǎn)志苦泄熱而辛散郁，能通腎氣上達(dá)于心，強(qiáng)志益智；石菖蒲辛散肝而香舒脾，能開心孔而利九竅，祛濕除痰；又龜能補腎，龍能鎮(zhèn)肝使痰火散而心肝寧，則聰明開而記憶強(qiáng)矣。既往研究表明，孔圣枕中丹可用于治療失眠、癡呆、認(rèn)知障礙、健忘及多動癥等多種疾?。豢资フ碇械び锌挂钟?、鎮(zhèn)靜催眠，以及提高癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用[6-7]。目前，受到傳統(tǒng)研究方法的限制，尚未有文獻(xiàn)報道臨床上常見的失眠-健忘共病的發(fā)病機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生態(tài)學(xué)的理論基礎(chǔ)，通過對復(fù)雜生物信息系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，以及通過選擇特殊信息節(jié)點實現(xiàn)多靶點藥物分子設(shè)計的新興專業(yè)。同時，通過融合計算機(jī)技術(shù)、系統(tǒng)生物學(xué)、多方向藥理學(xué)等多種學(xué)科，構(gòu)建成分-靶標(biāo)-疾病的分子網(wǎng)絡(luò)，形成以網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)為核心的技術(shù)體系，體現(xiàn)了中醫(yī)的整體論思想和中醫(yī)“同病異治”及辨證施治的特色，并為揭示證候本質(zhì)提供了新的解決方案[8]。研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從“異病同治”角度對孔圣枕中丹治療失眠與健忘的作用機(jī)制展開了深入研究。

1 資料和方法

1.1 孔圣枕中丹活性成分及靶點的獲取 運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.cn/tcmsp.php）和中藥成分靶點平臺HIT 2.0（http：//hit2.badd-cao.net）、中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺（TCMIP，http：//www.tcmip.cn/index.jsp）、中醫(yī)綜合數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/）、有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem，http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、臺灣中醫(yī)藥資料庫（TCM Database@Taiwan，http：//tcm.cmu.edu.tw）及中國天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫（https：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc）等平臺檢索孔圣枕中丹的4味中藥：遠(yuǎn)志、石菖蒲、龜板、龍骨的活性成分?？诜o藥的生物利用度（OB）表示以口服藥物總劑量產(chǎn)生藥效的百分比，是藥物在藥代動力學(xué)中的主要參數(shù)；血腦屏障滲透性（BBB）是潛在物質(zhì)透過血腦屏障的能力，人類藥性指數(shù)（DL）指化合物與已知藥物的相似性，被廣泛應(yīng)用于評價藥物先導(dǎo)化合物能否成藥[9-12]。根據(jù)OB≥30%、BBB≥-0.3、DL≥0.1，篩選出同時滿足此條件的主要活性成分并檢索其潛在靶點。再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/），選擇物種為人（homo sapiens），獲取具有官方名稱的靶點信息。

1.2 失眠和健忘相關(guān)靶點的篩選 在治療目標(biāo)數(shù)據(jù)庫（TTD，https：//db.idrblab.net/ttd/）、人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www.genecards.org/）、毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD，http：//ctdbase.org/）、藥物和藥物靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)庫（DrugBank，https：//www.drugbank.ca/）和人類的孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，http：//https：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫獲取失眠及健忘的相關(guān)靶點，搜索關(guān)鍵詞“insomnia”“amnesia”“sleep disorder”“sleep deprivation”“cognitive impairment”“cognitive dysfunction”進(jìn)行查詢，且去掉重復(fù)基因及假陽性基因。

1.3“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將SCPE的藥物活性成分靶點與兩種疾病相關(guān)靶點取交集，以取得孔圣枕中丹治療失眠和健忘的共有靶點。以藥物、活性成分、作用靶點、疾病為節(jié)點（node），兩節(jié)點間的關(guān)系描述為邊（edge），并利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建孔圣枕中丹“異病同治”失眠及健忘的“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，度數(shù)（Degree）和介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）則用于進(jìn)行對各節(jié)點間重要性的評價。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點篩選 使用STRING數(shù)據(jù)庫解析SCPE治療失眠與健忘的潛在作用靶點，以及提取共同靶點蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)圖，并使用Cytoscape3.7.1軟件，實現(xiàn)可視化以及拓?fù)浣馕?；檢測出符合度和介數(shù)均大于各自平均水平的關(guān)鍵靶點。

1.5 生物過程分析 運用DAVID、Metascape等平臺對共有靶點進(jìn)行分析和可視化，獲取Heatmap分析、Mcode（分子復(fù)合物檢測）分析、GO功能富集分析（即生物學(xué)過程、分子生物學(xué)功能、細(xì)胞學(xué)組分）與KEGG通路富集集分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 SCPE活性成分及靶點 篩選出39個活性成分，其中遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd）10個（C1-C10），石菖蒲（Acorus tatarinowii）24 個（C11-C34），龜板（Chinemys reevesii（Gray））2 個（C35-C36），龍骨（FossiliaOssia-Mastodi）3 個（C37-C39）；鑒于龍骨的主要成分Calcium Carbonate（碳酸鈣）和Calcium phosphate（磷酸鈣）在組方中的作用，雖無法透過血腦屏障，也分析其相應(yīng)的治療靶點。經(jīng)去重后獲得化合物對應(yīng)的靶點88個，其SCPE活性成分和其對應(yīng)的靶點，見開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）。

2.2 失眠和健忘相關(guān)靶點的獲取 通過TTD、CTD、DrugBank及GeneCards（人類基因的綜合數(shù)據(jù)庫）等數(shù)據(jù)庫檢索獲得失眠特異性疾病靶點24 771個，健忘特異性疾病靶點55 876個，并進(jìn)行基因名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理。通過Venny 2．1．0獲取SCPE中各組成藥物成分靶點與兩種疾病相關(guān)靶點的交集，獲得孔圣枕中丹治療失眠和健忘的作用靶點83個。

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3．7．1軟件，建立了SCPE治療失眠及健忘的主要成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖并進(jìn)行拓?fù)浣馕?。此圖總共有135個節(jié)點、499條邊，其中與兩個或兩個以上的靶點有相互作用影響的藥物活性成分有31個。見圖1。

圖1 藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Drug-component-target-disease network diagram

圖中藥物成分所在位置對應(yīng)外弧，而其中所對應(yīng)的藥物靶點則位屬于內(nèi)弧，其靶點量的多少也將對應(yīng)于內(nèi)弧的長度。深橙色點則是在各種中藥中反復(fù)出現(xiàn)的靶點，淡橙色則為僅存在于此中藥的靶點。紫色的光線連則連起反復(fù)出現(xiàn)的靶點，由此可見，石菖蒲、遠(yuǎn)志、龜板和龍骨這幾種藥物擁有的共同靶點數(shù)量，依次是從多至少。而右圖中藍(lán)色的光線則連接反復(fù)出現(xiàn)的富集功能條目（富集條目數(shù)量＜100），各個藥物靶點的功能重疊狀況也隨之顯示。

2.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點 將83個SCPE治療眠和健忘的共有作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，并應(yīng)用Cytoscape 3．7．1對蛋白互作網(wǎng)絡(luò)實行可視化數(shù)據(jù)處理及拓?fù)浣馕?，見圖2。度的大小用節(jié)點的大小來顯示，即度越小越位于外圈；得到的SCPE治療失眠和健忘的關(guān)鍵共有靶點（Target）為符合度（Degree）和介數(shù)中心性（Betweenness Centrality）都大于平均數(shù)的18個靶點。見表1。由上可知，ESR1、CASP3、NOS3等是與SCPE治療失眠和健忘關(guān)系密切的主要蛋白。

圖2 SCPE治療失眠和健忘的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Protein interaction network diagram of SCPE for insomnia and amnesia

表1 SCPE治療失眠和健忘的關(guān)鍵共有靶點Tab.1 Key common targets of SCPE for insomnia and amnesia

2.5 生物過程富集分析 SCPE對治療失眠與健忘分子機(jī)制的深入探究，使用了DAVID、Metascape、R studio軟件等平臺，針對靶點分別做了GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析。并將所得到的前20條富集條目建立了熱圖，從而利用Metascape和R studio對藥物中相應(yīng)的靶點進(jìn)行了富集和功能模塊化解析，得出了SCPE中治療失眠和健忘的潛在功能模塊（Mode）和各個藥物在模型中發(fā)生的可能相互作用機(jī)制。

2.5.1 聚類熱圖分析 將SCPE治療失眠和健忘的靶點做聚類分析，獲得前20條條目結(jié)果：乙酰膽堿反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)控、化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、血液循環(huán)、蛋白轉(zhuǎn)運調(diào)控、溫度刺激反應(yīng)、核受體信號等，更深入的解釋了SCPE在治療失眠和健忘時的復(fù)雜機(jī)制與過程。

2.5.2 GO富集分析 將SCPE對應(yīng)的靶點導(dǎo)入R和R Studio軟件做GO富集分析，把SCPE治療失眠和健忘的前20條條目進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖3。其中，包括205個生物學(xué)過程（BP），主要有g(shù)蛋白偶聯(lián)受體信號通路、膽堿能突觸傳遞、平滑肌收縮的正向調(diào)節(jié)、胞漿鈣離子濃度的正向調(diào)節(jié)、γ-氨基丁酸信號通路、晝夜節(jié)律、脂質(zhì)代謝過程、單胺運輸、T細(xì)胞激活等；包括78個分子學(xué)生物功能（MF），主要有蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、乙酰膽堿結(jié)合、g蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性等；包括41個細(xì)胞學(xué)組分（CC），主要有核、突觸、GABA-A復(fù)雜受體、神經(jīng)肌肉接頭、依賴camp的蛋白激酶復(fù)合物等。

圖3 SCPE治療失眠和健忘的GO富集分析氣泡圖Fig.3 GO enrichment analysis bubble diagram of SCPE for insomnia and amnesia

2.5.3 KEGG富集分析 將SCPE對應(yīng)的靶點導(dǎo)入R和R Studio軟件做GO富集分析，把SCPE治療失眠和健忘的前20條條目進(jìn)行可視化，結(jié)果見圖4。在SCPE治療失眠及健忘中發(fā)揮重要意義的信號通道，主要包括受體配體作用的神經(jīng)活性、鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸等。

圖4 SCPE治療失眠和健忘的KEGG富集分析氣泡圖Fig.4 KEGG enrichment analysis bubble diagram of SCPE treatment for insomnia and amnesia

2.5.4 模塊化分析 運用R Studio軟件將聚類熱圖分析的成果進(jìn)行了生物過程的模塊化分解，確定了在各種生物過程中不同藥物的具體效果和重要程度。如圖5和表2。

圖5 SCPE治療失眠和健忘生物功能的模塊化分析Fig.5 Modular analysis of the biological functions of SCPE for insomnia and amnesia

表2 SCPE治療失眠和健忘生物功能的模塊化分析表Tab.2 Modular analysis of biological functions of SCPE for insomnia and amnesia

利用GO富集分析每個模塊（MCODE）網(wǎng)絡(luò)，同時將每個MODE模塊的前3項相關(guān)條目進(jìn)行解析。結(jié)果顯示，SCPE治療失眠和健忘主要與細(xì)胞對有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)、激素反應(yīng)及血液循環(huán)密切相關(guān)。具體到每個藥物的分析結(jié)果如下：石菖蒲靶點主要干涉了神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞對有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)和神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動過程；遠(yuǎn)志靶點主要調(diào)節(jié)對激素的反應(yīng)和細(xì)胞對氮及有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)過程；龜板靶點主要影響胺受體配體結(jié)合和G蛋白偶聯(lián)胺受體活性及管徑調(diào)節(jié)反應(yīng)過程；龍骨靶點主要介導(dǎo)凋亡和調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡過程。

3 討論

目前人們的生活和工作壓力隨著當(dāng)今社會不斷的快速發(fā)展在逐漸增大，失眠健忘的發(fā)生率也呈明顯上升的趨勢。雖然失眠和健忘發(fā)病病機(jī)各有差異，有實有虛；歷代醫(yī)家認(rèn)為心腎不交是失眠和健忘的主要發(fā)病病機(jī)之一，心主血而藏神，腎藏精而主志，心腎相交則寤寐協(xié)調(diào)，思維敏捷，若心腎不交則失眠健忘，并提出了相應(yīng)的治療方藥如生慧湯、狀元丸、定志丸、導(dǎo)痰湯等[13]?？资フ碇械な墙?jīng)典復(fù)方，主治心腎不足而致失眠健忘、心悸不安，且歷史悠久，臨床應(yīng)用廣泛，療效確切。針對心腎不交這一共同病機(jī)，孔圣枕中丹治療失眠-健忘充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨證施治、“異病同治”的特點。

清代陳士鐸《石室秘錄》第一次明確提出了“異病同治”的概念，并將其定義為：“同治者，同是一方而同治數(shù)病也?！碑惒⊥巫鳛橹嗅t(yī)最基本的治療原則之一，至今仍應(yīng)用于臨床的診斷和治療。異病同治的關(guān)鍵是抓主證，通過辨別主訴中的1組證候，認(rèn)清疾病現(xiàn)階段的病機(jī)，辨證施治，從而確定治法、方藥，如此次證則迎刃而解。由于其具體作用機(jī)制尚不明確，并且傳統(tǒng)中草藥組成成分復(fù)雜、靶點不清，使其療效和作用機(jī)制的研究存在著一定困難，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則可從中藥成分、靶點與病癥之間作用的整體與系統(tǒng)性關(guān)聯(lián)出發(fā)進(jìn)行研究，有助于進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)中藥的復(fù)雜作用機(jī)制和實現(xiàn)異病同治的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對孔圣枕中丹進(jìn)行分析，結(jié)果顯示SCPE中3個活性最強(qiáng)的物質(zhì)為2'-O-甲基異甘草素（2'-O-Methylisoliquiriti-genin，C18），異紫花前胡內(nèi)酯（Marmesin，C13），油酸（oleic acid，C35）；C18 和 C13 來源于石菖蒲，C35 則來源于龜板。動物實驗和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[14-15]，石菖蒲能提高藥物在腦組織中的功效主要與保護(hù)血腦屏障和提高其通透性密切相關(guān)；而且具有降糖、抗阿爾茨海默病、抗癲癇、神經(jīng)保護(hù)和記憶增強(qiáng)等作用。研究表明龜板能提高細(xì)胞免疫功能、調(diào)整β腎上腺素受體、清除氧自由基，以及緩解細(xì)胞凋亡[16-17]；Ye等[18]發(fā)現(xiàn)龜板提取物可通過調(diào)節(jié)DNMT1核易位和SNCA甲基化，來保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。2'-O-甲基異甘草甙元是一個單體化合物，來自于黃酮類化合物異甘草苷。異甘草苷具有抗真菌活性、抗癌、抗抑郁及神經(jīng)保護(hù)等作用[19-21]。異紫花前胡內(nèi)酯是一種天然香豆素，具有抗炎、抗肝毒性、抗癌、抗血管生成等作用[22-25]。油酸是一種非必需脂肪酸，有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血壓和免疫功能等作用[26]。

通過蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖可以觀察到排在前3位的共同靶點依次為CASP3、ESR1、PPARG，主要與細(xì)胞凋亡、雌激素反應(yīng)、脂代謝有關(guān)。CASP3即半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，參與蛋白水解、細(xì)胞凋亡以及學(xué)習(xí)和記憶過程[27-28]。研究發(fā)現(xiàn)安眠丹可通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡通路和降低Cyt-C、Caspase-3表達(dá)來改善睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶水平[29]。ESR1即雌激素受體1，存在于與記憶、睡眠和清醒節(jié)奏相關(guān)的下丘腦、嗅葉、杏仁核和海馬區(qū)。臨床研究發(fā)現(xiàn)在AG XBA I或TC PVU II ESR1基因型的圍絕經(jīng)期婦女中，失眠越嚴(yán)重，簡單注意力就越差[30]。PPARG即過氧化物酶體增殖物活化受體γ，可參與細(xì)胞分化和脂肪生成，胰島素抵抗，高血壓，以及心血管疾病和癌癥等過程[31]。另外Han等[32]發(fā)現(xiàn)母體睡眠剝奪（MSD）誘導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷可以通過小膠質(zhì)細(xì)胞表型的PPARγ依賴性調(diào)節(jié)來改善。

對靶點進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析的結(jié)果顯示，SCPE治療失眠及健忘的主要GO條目有G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、核、突觸、蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合等；參與SCPE治療失眠及健忘的主要KEGG條目為受體配體作用的神經(jīng)活性、鈣信號通路、PI3K-Akt信號通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號通路、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、膽堿能突觸等。其中，腫瘤壞死因子（TNF）可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和記憶障礙、調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動（如睡眠調(diào)節(jié)）等過程[33]；任重陽等[34]發(fā)現(xiàn)慢性失眠病人外周血中IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子水平與患者失眠程度、記憶功能呈正相關(guān)?？资フ碇械じ纳艭I小鼠的認(rèn)知功能主要通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路，減少血清中IL-6、IL-18和TNF-α等表達(dá)發(fā)揮作用[35]。細(xì)胞凋亡是體內(nèi)細(xì)胞通過激活內(nèi)部自殺程序而死亡的過程。研究表明，細(xì)胞凋亡與失眠、記憶障礙密切相關(guān)[36]。張穎等[37]發(fā)現(xiàn)左歸丸通過上調(diào)PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，減少睡眠剝奪所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善睡眠剝奪誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能損傷。加味孔圣枕中丹提高血管性癡呆模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力與對抗缺血再灌損傷后海馬區(qū)腦細(xì)胞的凋亡有關(guān)[38]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[39-40]調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、血液和血管生成，與睡眠障礙和認(rèn)知功能有關(guān)；VEGF的高表達(dá)可通過減少Aβ沉積，從而改善AD的學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能。實驗研究表明[41]加味孔圣枕中丹改善癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機(jī)制可能是通過上調(diào)VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)腦組織新生血管生成，從而使皮質(zhì)及白質(zhì)缺血區(qū)的血供得以恢復(fù)和改善。

中樞神經(jīng)遞質(zhì)，如DA、NE、5-HT和GABA等功能失調(diào)時，會破壞節(jié)律神經(jīng)，進(jìn)而影響睡眠覺醒系統(tǒng)的一般功能，從而逐漸形成了不易入睡、睡眠維持障礙等以失眠最為常見的睡眠障礙[42]。多巴胺（DA）是最常見的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要產(chǎn)生于中腦邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)元中，對維持覺醒起著重要的調(diào)節(jié)作用；去甲腎上腺素（NE）參與注意力、覺醒和認(rèn)知的調(diào)節(jié)，顯示出促進(jìn)覺醒的能力；γ-氨基丁酸（GABA）是與失眠最直接相關(guān)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，在大腦中普遍存在，且GABA濃度的增加，可增加深慢波睡眠[43-44]。Wang等[43]發(fā)現(xiàn)百樂眠通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平即 GABA，5-HT，DA，NE 含量升高，Glu含量降低來減輕氯苯丙氨酸誘導(dǎo)的失眠。另外，DA、GABA及NE參與學(xué)習(xí)和記憶過程，而且阻斷觸發(fā)DA刺激系統(tǒng)和以突觸后D-2受體為主的抑制性GABA能系統(tǒng)的激活等耦合過程是健忘癥發(fā)展的神經(jīng)化學(xué)基礎(chǔ)[45-47]。Tellez等[47]發(fā)現(xiàn)記憶形成的機(jī)制可能與與前額葉皮質(zhì)γ-氨基丁酸、紋狀體5-羥色胺、多巴胺等上調(diào)，海馬γ-氨基丁酸和5-羥色胺等下調(diào)有關(guān)；且參與抗健忘作用的主要神經(jīng)傳遞系統(tǒng)是多巴胺和5-羥色胺。Sadowski等[46]研究發(fā)現(xiàn)利多卡因通過抑制杏仁核內(nèi)去甲腎上腺素的釋放來減輕茴香霉素誘導(dǎo)的記憶障礙。

泛素化是指泛素分子在泛素激活酶（E1）、幾種泛素結(jié)合酶（E2s）和許多泛素連接酶（E3s）的協(xié)調(diào)催化下特異性修飾靶蛋白的過程。泛素連接酶E3，作為泛素化過程最后步驟中的重要酶，在與靶蛋白的特異性識別中起關(guān)鍵作用，且介導(dǎo)了癌癥、阿爾茨海默癥及帕金森病等多種疾病，目前仍是泛素化研究領(lǐng)域的熱門話題。E3泛素連接酶Cullin-3可在晝夜節(jié)律和睡眠調(diào)節(jié)中起重要作用，Li等[48]發(fā)現(xiàn)Cullin-3的適配器失眠inc家族蛋白能指導(dǎo)并影響睡眠和突觸功能的保守神經(jīng)元底物泛素化。另外研究表明E3連接酶Neuralized1依賴性泛素化通過調(diào)節(jié)CPEB3和CPEB3依賴性蛋白質(zhì)合成和突觸形成的活性來促進(jìn)海馬可塑性和海馬依賴性記憶存儲[49]。由于泛素化系統(tǒng)的復(fù)雜性，很多問題仍有待研究，如采用傳統(tǒng)方法研究E3和底物之間復(fù)雜的交叉作用等。

由于泛素化系統(tǒng)的復(fù)雜性，很多問題仍有待研究，如采用傳統(tǒng)方法研究E3和底物之間復(fù)雜的交叉作用等。

總之，研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)孔圣枕中丹“異病同治”失眠及健忘可能通過抗細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)、泛素蛋白連接酶結(jié)合等多種途徑發(fā)揮共同治療作用，與目前失眠及健忘的研究方向相同，表明了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性。但是尚不明確沒有靶點的化合物，是否發(fā)揮了同類型化合物的作用；且異病同治的機(jī)制研究由于受到復(fù)合模型穩(wěn)定性等因素的限制，雖然進(jìn)行了生物信息學(xué)的研究，但后續(xù)的動物模型及臨床研究仍需進(jìn)一步深入。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的作用機(jī)制研究可為孔圣枕中丹臨床上新的應(yīng)用提供參考，也為中藥復(fù)方“異病同治”科學(xué)內(nèi)涵的詮釋提供了科學(xué)依據(jù)。