楊曉曉，柳毅浩，王成偉，牛浩一，王金武,2

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011；2.上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200030）

皮膚覆蓋全身，是保護(hù)各種組織和器官免受物理、機(jī)械、化學(xué)和病原微生物侵害的天然屏障[1-2]。正常情況下，皮膚表面呈酸性，pH值約為4～6。傷口微環(huán)境的pH值反映和影響了傷口愈合過程中許多基本的生理和生化過程，是傷口護(hù)理中治療干預(yù)的一個(gè)重要參數(shù)[3]。慢性、感染性傷口微環(huán)境pH值呈堿性，pH值高于7.3[4]。已有研究利用慢性傷口pH值變化的特點(diǎn)制備pH值響應(yīng)性藥物釋放敷料[5-6]。軍事沖突導(dǎo)致的創(chuàng)傷感染率高達(dá)27%[7]，包括皮膚及深部組織的感染；其中開放型骨折的并發(fā)感染率約為7.6%[8]。傷口感染常導(dǎo)致膿毒血癥、傷口慢性愈合等并發(fā)癥，加重患者的痛苦，降低患者的生活質(zhì)量，且增加其他并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，給患者和醫(yī)療系統(tǒng)帶來極大的衛(wèi)生與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。同時(shí)，人口老齡化的加劇及糖尿病等慢性疾病的增多使醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)面臨著巨大的考驗(yàn)，急劇增加治療負(fù)擔(dān)，對(duì)公共衛(wèi)生持續(xù)造成重大威脅。筆者采用抗菌肽ε-L-聚賴氨酸（ε-L-polylysine，PLL）與聚乙二醇二縮水甘油醚（polyethylene glycol diglycidyl ether，PEGDGE）通過共價(jià)鍵交聯(lián)制成PEGDGE/PLL復(fù)合物（PP）的凝膠顆粒，再根據(jù)酚紅（phenol red，PR）酸堿指示劑的特點(diǎn)，通過靜電吸附，與正電性PP形成PRPP復(fù)合物凝膠顆粒，通過PRPP復(fù)合物的顏色變化直觀地監(jiān)測(cè)傷口愈合過程。同時(shí)，PRPP復(fù)合物與中藥活性成分配伍組方，協(xié)同發(fā)揮抗菌抗炎活性。本研究為感染傷口的治療及傷口愈合過程監(jiān)測(cè)的醫(yī)產(chǎn)品的開發(fā)提供了新思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物與試劑ε-L-聚賴氨酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分子量5 000，純度95%）；聚乙二醇二縮水甘油醚（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分子量6 000，純度99%）；綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201415，含量≥98%）；黃連堿（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201206，含量≥98%）；黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-200514，含量≥98%）；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 主要儀器SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)（蘇州艾克林凈化設(shè)備有限公司）；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；TS2型倒置顯微鏡（上海衡浩儀器有限公司）；AG135型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）公司]；XKA-2200型低度冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；HH-600型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；800TS型酶標(biāo)儀（Bio Tek公司）；S400-B型pH計(jì)（梅特勒-托利多公司）；Scientz-10ND型冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Tensor 27和MIRacle ATR FT-IR型光譜儀（Bruker Optics公司）；Cary100紫外-可見分光光度計(jì)（美國VARIAN公司）。

1.3 菌種及細(xì)胞株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aurues，ATCC 25923，南京便診生物科技有限公司）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC-CS，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所）；小鼠成纖維細(xì)胞（L929，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

2 方 法

2.1 PRPP復(fù)合物凝膠顆粒的制備本實(shí)驗(yàn)通過溫和的開環(huán)反應(yīng)制備PP高吸水性樹脂。首先將分子量〈5 000的PLL透析去除雜質(zhì)和分子量小于3 500的短鏈分子，然后凍干、收集透析后的PLL，使其溶于去離子水配制50%（m/V）PLL溶液，調(diào)節(jié)pH值至10.0。分別將0.4、0.6 mL PEGDGE加入2 mL上述PLL溶液中，振蕩器震蕩10 s確保均勻混合后在靜置于60℃水浴鍋中。反應(yīng)2 h后，收集PP，在大量去離子水中浸泡24 h，且每8 h更換一次去離子水，以去除未交聯(lián)的PLL和PEGDGE，將上述制備的樣品冷凍干燥，備用，計(jì)算凝膠分?jǐn)?shù)（Gelcontent，G），公式如下：

其中，m1為PLL質(zhì)量（g），m2為PEGDGE質(zhì)量（g），m3為PP質(zhì)量（g）。

隨后于室溫下分別浸泡于質(zhì)量濃度為1 mg/mL的PR溶液中靜置2 h以制備PRPP。大量去離子水洗滌PRPP樣品5次后，繼續(xù)浸泡于去離子水中24 h，冷凍干燥并收集樣品備用。

2.2 PRPP復(fù)合物凝膠顆粒的性能評(píng)估

2.2.1 紅外光譜檢測(cè) 采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）檢測(cè)，通過特征峰觀察，分析PRPP樣品中無PEGDGE殘留，評(píng)價(jià)檢測(cè)PLL和PEGDGE的交聯(lián)情況。

2.2.2 溶脹率測(cè)定 參考YUAN H C等[9]所報(bào)道的方法對(duì)常溫下PRPP在去離子水和PBS中的溶脹性能進(jìn)行了評(píng)估。在微量離心管中預(yù)先稱重約10 mg樣品，空離心管質(zhì)量記為m0，加入樣品后離心管總質(zhì)量記為md，加入足量去離子水和pH值為7.4的PBS，并于室溫靜置1 h。隨后，小心吸出殘留的去離子水或PBS。最后，測(cè)量溶脹樣品與離心管的總質(zhì)量并記錄為mw。計(jì)算溶脹率（Sw），公式如下：

其中，m0為離心管質(zhì)量（g），md為離心管與初始樣品總質(zhì)量（g），mw為離心管與溶脹樣品總質(zhì)量（g）。

2.2.3 PRPP顯色反應(yīng) 依次配制pH值分別5、6、7、8和9的PBS緩沖液1 mL，分別稱取1 mg PRPP放入緩沖液中，觀察不同pH值下PRPP顏色變化情況。

2.2.4 生物相容性 為了評(píng)估PRPP對(duì)細(xì)胞活力的影響，本研究使用HUVEC-CS和L929細(xì)胞作為模型細(xì)胞進(jìn)行CCK-8測(cè)試。該實(shí)驗(yàn)通過使用材料浸提液與未接觸材料的DMEM完全培養(yǎng)基分別培養(yǎng)細(xì)胞，比較各組材料是否具有細(xì)胞毒性。首先，將2 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基與10 mg樣品混合，37℃靜置24 h獲得浸提液。在96孔板每孔中加入含8 000個(gè)HUVEC或L929的細(xì)胞懸液100 μL，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。隨后，將普通DMEM培養(yǎng)基替換為浸提液，對(duì)照組僅用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)12、24和48 h通過CCK-8測(cè)試評(píng)估細(xì)胞活力，每組重復(fù)測(cè)試4次。

2.3 綠原酸與PRPP配伍體外抗菌活性考察體外抗菌性能試驗(yàn)以S.aurues作為模型細(xì)菌。將S.aurues接種到新鮮的MH肉湯中，37℃恒溫?fù)u床孵育6～8 h后，使用分光光度計(jì)在625 nm處計(jì)數(shù)細(xì)菌懸液，并稀釋至最終濃度約為1×107CUF/mL。隨后，將50 μL PBS或質(zhì)量濃度為2、4和8 mg/mL的綠原酸PBS溶液與50 μL菌液混合后，滴加在48孔板中或預(yù)先紫外滅菌的各組樣品表面，每組樣品10 mg。于37℃，濕度90%的培養(yǎng)箱中共同孵育2 h后每組加入0.9 mL無菌PBS，在超聲清洗儀中震蕩10 min使細(xì)菌重懸于PBS中，并以無菌PBS梯度稀釋上述重懸菌液，取100 μL涂布于MH瓊脂平板上培養(yǎng)8～24 h后計(jì)數(shù)細(xì)菌菌落。每組重復(fù)3次，計(jì)算抗菌率（antibacterial rate,AR）。

其中，Cr、Cs分別代表空白對(duì)照組菌落計(jì)數(shù)和樣品組菌落計(jì)數(shù)。

3 結(jié) 果

3.1 PRPP復(fù)合物凝膠顆粒的制備PRPP復(fù)合物凝膠顆粒制備結(jié)果見表1。隨著PEGDGE的增加，PRPP復(fù)合物凝膠顆粒的凝膠分?jǐn)?shù)增加，說明隨著PEGDGE的增加，其交聯(lián)程度同樣增加，故得到的PRPP復(fù)合物凝膠重量也上升；同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)不同比例PEGDGE所制備的PRPP復(fù)合物凝膠均能很好的吸附PR。

表1 PRPP樣品制備

3.2 PRPP復(fù)合物凝膠顆粒的性能評(píng)估結(jié)果

3.2.1 紅外光譜分析PRPP凝膠的FT-IR譜圖見圖1。在C-O特征峰1100 cm-1處，PRPP1-3透過率依次減小，提示隨著PEGDGE比例增加，來源于PEG的醚基團(tuán)增加，說明其交聯(lián)程度隨PEGDGE的增加而增加。1 540 cm-1與1 650 cm-1處為PPL的特征峰，此外，未觀察到環(huán)氧環(huán)峰，反映PRPP樣品中無PEGDGE殘留[10]。

圖1 PRPP水凝膠的FT-IR譜圖

3.2.2 溶脹率水凝膠作為一種理想的創(chuàng)面敷料材料，其吸收和保存液體的能力是評(píng)價(jià)其效果的一個(gè)重要方面，凝膠的溶脹率是評(píng)價(jià)凝膠吸收液體能力的重要指標(biāo)。PRPP在PBS與去離子水中的溶脹率見表2。結(jié)果顯示，PRPP在PBS緩沖溶液的溶脹率為（1 224.6±74.0）%～（1 900.7±145.3）%，在去離子水中的溶脹率為（2 495.4±423.0）%～（4 597.0±278.1）%，說明PRPP凝膠具有很好的吸水性；PRPP凝膠在PBS緩沖溶液中的溶脹率小于在去離子水中的溶脹率，這是PBS緩沖溶液中多種離子對(duì)其造成的影響；此外，隨著PEGDGE的增加，PRPP凝膠的溶脹率逐步減小，這是因?yàn)镻EGDGE與PPL形成的氫鍵增加，導(dǎo)致其交聯(lián)程度升高，從而使溶脹率下降。

表2 PRPP在PBS與去離子水中的溶脹率（±s，n=3）

表2 PRPP在PBS與去離子水中的溶脹率（±s，n=3）

溶劑 PRPP1 PRPP2 PBS 1 900.7±145.3 1 224.6±74.0去離子水 4 597.0±278.1 2 495.4±423.0

3.2.3 PRPP顯色反應(yīng)2種PRPP凝膠在不同pH值下的顏色變化如圖2所示。不同pH值下PRPP凝膠顏色發(fā)生顯著變化，當(dāng)pH值=5或6時(shí)，PRPP凝膠顯示黃色，當(dāng)pH值=7時(shí)，PRPP凝膠顯示橙色，當(dāng)pH值=8或9時(shí)，PRPP凝膠顯示紫紅色。正常人體皮膚呈酸性（pH值=4～6），慢性、感染性傷口微環(huán)境pH值呈堿性（pH值〉7.3），PRPP凝膠的變色范圍涵蓋人體皮膚受傷前后的pH值變化，提示PRPP凝膠能很好地反映傷口的愈合情況。

圖2 PRPP顯色反應(yīng)

3.2.4 生物相容性2種PRPP凝膠的浸提液對(duì)HUVEC-CS和L929的細(xì)胞毒性見圖3。結(jié)果顯示，2種PRPP凝膠的浸提液在12、24和48 h內(nèi)對(duì)HUVEC-CS和L929基本無細(xì)胞毒性，除PRPP1外，PRPP2對(duì)兩種細(xì)胞的增殖還具有很好的促進(jìn)作用，提示PRPP凝膠能促進(jìn)傷口愈合，加速患者傷口恢復(fù)。

圖3 PRPP浸提液對(duì)HUVEC-CS和L929的細(xì)胞毒性

3.3 中藥活性成分配伍PRPP凝膠劑性狀中藥活性成分中，黃連堿和黃芩苷均具有一定的顏色，在不同pH值條件下，對(duì)PRPP凝膠的顏色變化有一定的干擾，使其顏色變化不顯著，容易影響對(duì)傷口愈合程度的判斷；此外，黃連堿和黃芩苷在水中的溶解度極低，在PRPP凝膠中有部分析出，導(dǎo)致凝膠整體渾濁，影響其外觀和使用；而綠原酸本身無色，同時(shí)溶解度較好，對(duì)PRPP的性質(zhì)并無影響，能很好地協(xié)調(diào)起效，故中藥活性成分選取綠原酸。

表3 中藥活性成分配伍PRPP制得凝膠敷料的基本信息

3.4 體外抗菌活性綠原酸、PRPP1及PRPP2對(duì)S.aurues的抑菌率如圖4所示。未聯(lián)用PRPP時(shí)，1、2、4 mg/mL綠原酸溶液抗菌率分別為（88.7±4.0）%、（90.4±2.5）%、（93.6±1.4）%。PRPP的抗菌率均在99%以上，說明PRPP凝膠具有較好的抑菌效果。當(dāng)PRPP2配伍2、4 mg/mL綠原酸時(shí)，抗菌率較單用PRPP2顯著提高（P〈0.01）。說明中藥活性成分配伍PRPP凝膠能更好地抑制傷口細(xì)菌生長，對(duì)傷口愈合有重要作用。

圖4 PRPP聯(lián)合綠原酸抗菌率（aP〈0.01，bP〈0.001，cP〈0.001）

4 討 論

本研究合成了pH值指示比色PLL/PEGDGE水凝膠復(fù)合物，在此基礎(chǔ)上，與中藥活性物質(zhì)配伍，開發(fā)一款用于創(chuàng)面抗菌消炎和監(jiān)控傷口微環(huán)境pH值變化的凝膠敷料。其中，PLL是一種鏈霉菌合成的抗菌肽，可通過發(fā)酵工程大量制備，其抗菌譜廣，對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有殺傷作用[11]。同時(shí)，作為陽離子殺菌劑，PLL對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜和動(dòng)物細(xì)胞膜具有高度的選擇性，在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞無毒性[12]，生物相容性佳。在2003年和2014年，國家食品藥品監(jiān)督管理局和國家衛(wèi)生健康委員會(huì)已經(jīng)批準(zhǔn)使用PLL作為食品添加劑[13]。研究發(fā)現(xiàn)具有雙環(huán)氧功能團(tuán)的甘油醚類具有促進(jìn)蛋白質(zhì)交聯(lián)的作用效果，雙環(huán)氧交聯(lián)劑能夠通過與酶和載體的氨基等反應(yīng)形成共價(jià)鍵，輔助酶固定化[14]。徐珊等[15]利用乙二醇縮水甘油醚進(jìn)行包埋固定化脂肪酶，得到的固定化酶最適反應(yīng)溫度和最適pH值均有提高；錢明華等[16]利用PEGDGE交聯(lián)大孔樹脂HPD750固定化脂肪酶，在60℃保溫7 h，固定化酶活力保留約72%，保存穩(wěn)定性也表現(xiàn)優(yōu)異。本實(shí)驗(yàn)利用PEGDGE通過共價(jià)鍵交聯(lián)具有氨基的PLL，制成PEGDGE交聯(lián)PLL的復(fù)合物PP凝膠顆粒，提高PLL的穩(wěn)定性和療效的發(fā)揮。PR是一種常用的酸堿指示劑，在臨床上，常用于尿路感染、胃黏膜幽門螺桿菌感染、淚液分泌等相關(guān)檢測(cè)[17-20]，根據(jù)酚紅在不同pH值條件下，顏色發(fā)生變化（pH值〈6.6顯黃色，pH值為6.6～8.0顯橙色，pH值為8.4顯紅色），在一定生理pH值條件下呈負(fù)電性等性質(zhì)，通過靜電吸附，將PR加入帶正電荷的PP中，制成PRPP復(fù)合物，不僅可以發(fā)揮PLL的抗菌活性，也可有效固定PR。同時(shí)，酚紅顏色變化與慢性或感染傷口的pH值范圍相匹配，通過PRPP復(fù)合物的顏色變化可直觀地監(jiān)測(cè)傷口愈合過程，以及細(xì)菌感染程度和治療效果。

本實(shí)驗(yàn)在制得PRPP復(fù)合物凝膠的基礎(chǔ)上，優(yōu)選廣譜抗菌中藥金銀花、黃連和黃芩，以各味藥材中主要活性成分綠原酸、黃連堿和黃芩苷為研究對(duì)象，與PRPP復(fù)合物制成凝膠敷料，最終確定無顏色、水溶性較好的綠原酸為中藥活性成分添加。與陽離子殺菌劑的抗菌原理不同，綠原酸通過改變膜電位從而影響細(xì)菌能量代謝并使其累積大量活性氧[21-22]，因此綠原酸有望協(xié)同陽離子殺菌劑提高抗菌效果。體外抑菌實(shí)驗(yàn)顯示，加入綠原酸可顯著提高PRPP復(fù)合物的抗菌活性，能更好地抑制傷口細(xì)菌感染，促進(jìn)傷口愈合。本實(shí)驗(yàn)制備的PRPP復(fù)合物凝膠具有結(jié)構(gòu)多孔，力學(xué)性能優(yōu)良，溶脹率高、保濕性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。此外，中藥活性成分的添加，提高了凝膠的抑菌能力，有利于傷口恢復(fù)，該中藥活性成分協(xié)同PRPP復(fù)合物制備的抗菌凝膠有望作為一種理想的醫(yī)用水凝膠敷料，用于慢性傷口的護(hù)理，同時(shí)為感染傷口的治療和傷口愈合過程監(jiān)測(cè)醫(yī)用產(chǎn)品的開發(fā)提供了新思路。