王利兵，李 雯，李木松

（1.唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000；2.保定市人民醫(yī)院，河北 保定 071000）

肝纖維化是由各種致病因素導(dǎo)致肝臟中大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，纖維性瘢痕組織形成的一個(gè)病理過(guò)程，其長(zhǎng)期惡化會(huì)發(fā)展成肝硬化、肝癌等。肝纖維化早期是一個(gè)可逆的過(guò)程，因此早期治療對(duì)于預(yù)防肝硬化和肝癌至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，藤茶總黃酮（Tengcha flavonoids，TF）具有多種藥理學(xué)作用，可通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，達(dá)到抗肝癌作用[1]，而且TF能干預(yù)糖尿病大鼠糖脂代謝及氧化應(yīng)激損傷，改善胰腺和肝臟的病理學(xué)變化[2]。此外，TF可改善四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）造成的肝損傷[3]。已有多項(xiàng)研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）/Smad信號(hào)通路在調(diào)節(jié)組織纖維化中具有重要作用[4-5]，本研究旨在探討TF是否能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路減輕CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康8周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠50只，體質(zhì)量（35±3）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對(duì)濕度45～55℃，光照12 h明暗交替，自由飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d用于實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)唐山市工人醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：TSGRYY20190421。

1.2 藥物與試劑藤茶總黃酮（寶雞晨光生物科技有限公司，批號(hào)：20190503）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）（批號(hào)：ab215715）、p-Smad2（批號(hào)：ab188334）、Smad7（批號(hào)：ab216428）、膠原Ⅰ（CollagenⅠ，ColⅠ）（批號(hào)：ab34710）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號(hào)：010-2-1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號(hào)：C009-2-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器CKX53型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；164-5052型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ASP200S型脫水機(jī)和EG1150型自動(dòng)包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

1.4 分組與造模50只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組、藤茶總黃酮組、激動(dòng)劑組和藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組，每組10只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠背部皮下注射25%四氯化碳（CCl4）花生油溶液，2 mL/kg，每3 d注射1次，連續(xù)10周，制備小鼠肝纖維化模型[6]。對(duì)照組小鼠背部皮下注射等量100%花生油溶液，每3 d注射1次，連續(xù)10周。小鼠若出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍，毛色干燥粗糙，血清AST和ALT水平明顯升高，病理結(jié)果顯示肝組織損傷，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)并有大量膠原沉積則說(shuō)明模型制備成功[7]。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥造模同時(shí)給藥，藤茶總黃酮組和藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠灌胃藤茶總黃酮溶液，100 mg/kg，1次/d，連續(xù)10周[8]；對(duì)照組、模型組和激動(dòng)劑組小鼠灌胃等體積蒸餾水；激動(dòng)劑組和藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠同時(shí)腹腔注射rhTGF-β1，1 μg/kg，1次/d，連續(xù)10周；對(duì)照組、模型組和藤茶總黃酮組小鼠同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清ALT、AST活性測(cè)定 第10周末，給藥結(jié)束后2 h，稱取各組小鼠體質(zhì)量。戊巴比妥鈉麻醉小鼠，收集腹主動(dòng)脈血液于EP管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心15 min，離心半徑8 cm，收集上清液，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中ALT和AST活性。

1.6.2 肝指數(shù)測(cè)定 腹主動(dòng)脈采血完成后，頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剝離肝臟，置于冰PBS中清洗，吸水紙吸干多余水分，稱取肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%。

1.6.3 HE染色觀察肝臟病理學(xué)變化 取部分肝臟，置于10%甲醛溶液中固定24 h，脫水、透明、石蠟包埋切片，切片厚度為4 μm，經(jīng)二甲苯透明，梯度乙醇脫水后，進(jìn)行蘇木精和伊紅染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.6.4 Masson染色觀察肝臟纖維化 取“1.6.3”項(xiàng)下病理切片，二甲苯透明、梯度乙醇脫水、蘇木精染色5 min，酸性乙醇分化，品紅染液染色5 min，磷鉬酸溶液孵育15 min，苯胺藍(lán)染液染色10 min，酸性乙醇分化。常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟纖維化情況。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，并計(jì)算每個(gè)視野藍(lán)染面積。膠原面積百分比（%）=藍(lán)染面積/肝臟組織總面積×100%。

1.6.5 蛋白印跡法檢測(cè)肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2、Smad7蛋白表達(dá) 取部分肝臟組織，液氮研磨，加入RIPA裂解液室溫靜置30 min，4℃12 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，收集上清液于EP管中，參照BCA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度，制備蛋白樣品。配制凝膠，每孔20 μL蛋白樣品，恒壓120 V電泳1.5 h，停止電泳。恒流0.3 A濕轉(zhuǎn)2 h，室溫封閉1 h，4℃ColⅠ、α-SMA、TGF-β1、p-Smad2、Smad7一抗（1∶1 000）孵育過(guò)夜，二抗（1∶5 000）孵育2 h，ECL法顯色。Image J軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST活性比較模型組小鼠血清ALT、AST活性均明顯高于對(duì)照組（P〈0.05）；藤茶總黃酮組小鼠血清ALT、AST活性均明顯低于模型組（P〈0.05），而激動(dòng)劑組小鼠血清ALT、AST活性均明顯高于模型組（P〈0.05）；藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠血清ALT、AST活性均明顯高于藤茶總黃酮組，而低于激動(dòng)劑組（P〈0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠血清ALT、AST活性比較（±s）

表1 各組小鼠血清ALT、AST活性比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與藤茶總黃酮組比較，cP〈0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP〈0.05

給藥劑量藤茶總黃酮（mg/kg）rhTGF-β1（μg/kg）對(duì)照組 10 - - 45.10±15.25 57.38±18.73模型組 10 - - 374.82±22.58a 410.64±26.64a藤茶總黃酮組 10 100 - 135.66±23.37a b 102.83±24.58a b激動(dòng)劑組 10 - 1 583.17±24.54a b c 644.82±25.30a b c藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組 10 100 1 227.35±24.08a b c d 289.54±24.26a b c d F 907.951 989.291 P 0.000 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只） ALT（U/L） AST（U/L）

2.2 各組小鼠肝指數(shù)比較模型組小鼠肝指數(shù)明顯高于對(duì)照組（P〈0.05）；藤茶總黃酮組小鼠肝指數(shù)明顯低于模型組（P〈0.05），而激動(dòng)劑組小鼠肝指數(shù)明顯高于模型組（P〈0.05）；藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠肝指數(shù)明顯高于藤茶總黃酮組，而低于激動(dòng)劑組（P〈0.05）。（見表2）

表2 各組小鼠肝指數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠肝指數(shù)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與藤茶總黃酮組比較，cP〈0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP〈0.05

給藥劑量藤茶總黃酮（mg/kg）rhTGF-β1（μg/kg）對(duì)照組 10 - - 2.23±0.21模型組 10 - - 3.55±0.16a藤茶總黃酮組 10 100 - 2.79±0.23a b激動(dòng)劑組 10 - 1 3.86±0.18a b c藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組10 100 1 3.18±0.20a b c d F 104.941 P 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只）肝臟指數(shù)（%）

2.3 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，肝索排列整齊，肝細(xì)胞大小均勻，未見變性壞死；模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受損，模糊不清，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性水腫，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；藤茶總黃酮組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性和壞死減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕；激動(dòng)劑組小鼠肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性，可見肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)稍正常，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。（見圖1）

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)變化情況（HE，×200）

2.4 各組小鼠肝臟組織膠原面積百分比比較對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，僅有少量膠原沉積；模型組小鼠肝臟組織膠原纖維增生，成條索狀，導(dǎo)致肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞；藤茶總黃酮組小鼠肝細(xì)胞排列稍整齊，膠原沉積減輕；激動(dòng)劑組小鼠肝臟組織膠原沉積增多，形成纖維間隔，肝小葉遭到破壞；藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠肝臟組織膠原沉積減少，病理?yè)p傷減輕。（見圖2）

模型組小鼠肝臟組織膠原面積百分比明顯高于對(duì)照組（P〈0.05）；藤茶總黃酮組小鼠肝臟組織膠原面積百分比明顯低于模型組（P〈0.05），激動(dòng)劑組小鼠肝臟組織膠原面積百分比明顯高于模型組（P〈0.05）；藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠肝臟組織膠原面積百分比明顯高于藤茶總黃酮組，而低于激動(dòng)劑組（P〈0.05）。（見表3、圖2）。

圖2 各組小鼠肝臟組織Masson染色圖（×200）

表3 各組小鼠肝臟組織膠原面積百分比比較（±s）

表3 各組小鼠肝臟組織膠原面積百分比比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與藤茶總黃酮組比較，cP〈0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP〈0.05

給藥劑量 膠原面積藤茶總黃酮（mg/kg）rhTGF-β1（μg/kg）百分比（%）對(duì)照組 10 - - 2.14±0.87模型組 10 - - 21.18±1.05a藤茶總黃酮組 10 100 - 11.62±1.22a b激動(dòng)劑組 10 - 1 25.83±1.08a b c藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組10 100 1 15.22±1.19a b c d F 700.086 P 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只）

2.5 各組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量比較模型組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1和p-Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P〈0.05），Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（P〈0.05）；藤茶總黃酮組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1和p-Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組（P〈0.05），Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組（P〈0.05）；激動(dòng)劑組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1和p-Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于模型組（P〈0.05），Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組（P〈0.05）；藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1和p-Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于藤茶總黃酮組（P〈0.05），而低于激動(dòng)劑組（P〈0.05），藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于藤茶總黃酮組（P〈0.05），而高于激動(dòng)劑組（P〈0.05）。（見表4、圖3）

表4 各組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2、Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP〈0.05；與模型組比較，bP〈0.05；與藤茶總黃酮組比較，cP〈0.05；與激動(dòng)劑組比較，dP〈0.05

給藥劑量藤茶總黃酮（mg/kg）rhTGF-β1（μg/kg）對(duì)照組 10 - - 0.18±0.05 0.39±0.03 0.34±0.03 1.14±0.25 0.97±0.04模型組 10 - - 0.84±0.04a 0.92±0.04a 0.75±0.05a 1.09±0.22 0.33±0.04a藤茶總黃酮組 10 100 - 0.36±0.04ab 0.54±0.04ab 0.41±0.03ab 1.16±0.23 0.75±0.03ab激動(dòng)劑組 10 - 1 1.04±0.05abc 1.03±0.05abc 0.97±0.04abc 1.11±0.22 0.24±0.05abc藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組10 100 1 0.55±0.03abcd 0.74±0.03abcd 0.66±0.03abcd 1.10±0.24 0.52±0.03abcd F 669.670 462.867 484.044 0.158 601.800 P 0.000 0.000 0.000 0.959 0.000組別 動(dòng)物數(shù)（只）ColⅠ TGF-β1 p-Smad2 Smad2 Smad7

圖3 各組小鼠肝臟組織中ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2、Smad7蛋白表達(dá)Western blotting圖

3 討 論

肝纖維化是由各種慢性肝臟疾病導(dǎo)致的肝損傷病理修復(fù)過(guò)程，主要病理學(xué)變化為細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。肝纖維化時(shí)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、過(guò)度增生等病理改變可導(dǎo)致肝功能紊亂。藤茶總黃酮的主要活性成分二氫楊梅素已被報(bào)道具有多種藥理學(xué)活性。如二氫楊梅素能抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜上皮色素細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，降低氧化應(yīng)激損傷改善糖尿病小鼠內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，抑制膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡[9-11]。藤茶總黃酮提取物可通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝及腸道菌群等方式，干預(yù)糖尿病的發(fā)生發(fā)展[12]。但是，藤茶總黃酮是否能夠改善肝纖維化須進(jìn)一步探討。

本研究通過(guò)皮下注射CCl4建立肝纖維化小鼠模型，探討藤茶總黃酮對(duì)肝纖維化的影響。二氫楊梅素能夠促進(jìn)細(xì)胞自噬、減輕腎臟纖維化，從而有效改善糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[13]；二氫楊梅素還能改善非酒精性脂肪性肝炎的脂肪變性、炎癥和纖維化[14]；此外，二氫楊梅素能通過(guò)改變脂質(zhì)代謝、促進(jìn)乙醇代謝發(fā)揮肝臟保護(hù)作用[15]。本實(shí)驗(yàn)HE和Masson染色結(jié)果顯示，藤茶總黃酮可改善肝纖維化小鼠肝臟病理學(xué)變化，減輕纖維化程度，rhTGF-β1能加重肝臟病理學(xué)變化和纖維化程度；肝臟指數(shù)結(jié)果表明，藤茶總黃酮可降低肝纖維化小鼠肝指數(shù)，而rhTGF-β1可增加肝指數(shù)。ALT和AST是臨床上用于評(píng)估肝臟損傷的常用指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST活性均明顯高于對(duì)照組，藤茶總黃酮治療后ALT、AST活性均明顯降低，rhTGF-β1激活TGF-β/Smad信號(hào)通路后，ALT、AST活性高于模型組，藤茶總黃酮+激動(dòng)劑組小鼠血清ALT、AST活性均低于激動(dòng)劑組，提示藤茶總黃酮具有改善肝纖維化小鼠肝臟病理學(xué)變化、減輕纖維化程度、改善肝損傷的作用。

TGF-β1是一種重要的促纖維化因子，是TGF-β家族中的一員，廣泛存在于肝臟組織。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可抑制TGF-β1信號(hào)通路減輕腺嘌呤誘導(dǎo)的腎臟纖維化，TGF-β1可上調(diào)血管生成素樣蛋白2，加重退行性髓核細(xì)胞的炎癥和纖維化[17-18]。當(dāng)細(xì)胞處于某種外界刺激時(shí)，TGF-β1被激活，具有活性的TGF-β1與Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β1受體結(jié)合，從而激活TGF-β/Smad信號(hào)通路。Smad2和Smad3作為該信號(hào)通路的下游受體蛋白被激活而發(fā)生磷酸化，磷酸化后的Smad2和Smad3蛋白與Smad4蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。該復(fù)合物轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，與特異性DNA連接蛋白結(jié)合，從而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄。Smad7是一種纖維化抑制因子，可通過(guò)結(jié)合活化的TGF-β1阻斷TGF-β1與其受體結(jié)合，從而阻斷該過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。研究表明，褪黑素可通過(guò)抑制TGF-β/Smad3信號(hào)通路減輕糖尿病小鼠腎臟纖維化[20]。酸漿苷D可通過(guò)阻斷TGF-β/Smad信號(hào)通路降低肝星狀細(xì)胞激活和肝纖維化[21]。本研究為了進(jìn)一步探討藤茶總黃酮發(fā)揮肝臟保護(hù)作用是否是通過(guò)調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路，采用rhTGF-β1激活TGF-β/Smad信號(hào)通路，并采用Western blotting法檢測(cè)ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2、Smad7蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示TGF-β/Smad信號(hào)通路被激活后，ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，而Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低；TGF-β治療后，ColⅠ、TGF-β1、p-Smad2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，而Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，表明藤茶總黃酮能抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路。

綜上所述，藤茶總黃酮能減輕肝纖維化小鼠肝臟損傷、改善肝功能，可能作用機(jī)制為抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路。本研究結(jié)果為臨床藤茶總黃酮相關(guān)藥物的研發(fā)及應(yīng)用于肝纖維化早期治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。