王艷萍，李 宏，李 鵬

（商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000）

血脂靈片是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，由澤瀉、決明子、山楂、制何首烏4味中藥飲片按照中藥劑型工藝制備而成的中藥復(fù)方制劑。該制劑具有化濁降脂、潤(rùn)腸通便的功效，用于臨床上的痰濁阻滯型高脂血癥，如頭暈胸悶、大便干燥等癥。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）中收載了該處方中決明子和制何首烏的定量方法；鄭艷超等[1]和張華等[2]曾對(duì)該制劑中決明子藥材中的蒽醌類(lèi)成分進(jìn)行了定量分析。中藥發(fā)揮療效的固有特性是多組分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用，而僅控制單一中藥有效成分群的含量，難以客觀、全面地評(píng)價(jià)產(chǎn)品的質(zhì)量。

處方中的君藥澤瀉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，其味甘性寒，主入腎、膀胱經(jīng)，具有利水、滲濕、瀉熱、化濁降脂的功效，主治高血脂、小便不利、水腫脹滿、瀉痢、痰飲、嘔吐等病癥[3]。澤瀉的主要化學(xué)成分有三萜、倍半萜、糖類(lèi)、黃酮、甾體、苯丙素等，其中三萜類(lèi)成分（23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C等）具有降血脂、保肝、降血糖、抗結(jié)石、保護(hù)腎臟、抗癌、利尿、抗炎、抗氧化等藥理作用[4-12]。臣藥決明子性微寒，味苦甘咸，主入肝、腎、大腸經(jīng)，有潤(rùn)腸通便、降脂明目的功效，在治療高血壓、頭痛、眩暈、急性結(jié)膜炎、角膜潰瘍、青光眼、癰癤瘡瘍等病癥中有一定的療效。決明子主要化學(xué)成分為蒽醌類(lèi)、吡酮類(lèi)和脂肪酸類(lèi)等成分，其中蒽醌類(lèi)成分（橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等）具有降壓、清肝明目、瀉下、抑菌等藥理作用[13-18]。目前對(duì)血脂靈片中君藥（澤瀉）和臣藥（決明子）中所含的多種有效成分群含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定的報(bào)道鮮見(jiàn)，故本研究旨在同時(shí)測(cè)定血脂靈片中7種化學(xué)成分的含量。

由于中藥復(fù)方中有效成分較為復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，而品種、產(chǎn)地、加工方法等因素對(duì)單味中藥材的質(zhì)量影響較大，使得中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制成為走向國(guó)際化的阻礙[19]。因此，在以臨床用藥的有效性和安全性的前提下，有必要建立快速、準(zhǔn)確、全面的多種有效成分群的檢測(cè)分析方法。故本研究采用HPLC波長(zhǎng)切換法建立了同時(shí)檢測(cè)血脂靈片中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種有效成分的含量方法，旨在為全面控制與評(píng)價(jià)血脂靈片的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 主要儀器Waters e2695型HPLC色譜儀，配備PAD二極管陣列檢測(cè)器，四元梯度泵，Empower 3色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli Pore Advantage A10自動(dòng)純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試劑與藥物23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品（批號(hào)：111846-201504，純度：95.0%）、橙黃決明素對(duì)照品（批號(hào)：111900-201202，純度：95.0%）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201710，純度：98.3%）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201512，純度：98.0%）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201621，純度：96.5%）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013，純度：99.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；23-乙酰澤瀉醇C對(duì)照品（批號(hào)：486-66-8，純度：98.0%）購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；血脂靈片共5批（批號(hào)：20190420、20190503、20190523、20190605、20190701，0.3 g/片）購(gòu)自浙江天一堂有限公司；乙腈（色譜純）購(gòu)自默克公司；其他試劑（分析純）購(gòu)自天津化學(xué)試劑廠；純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫0～10 min，40%A；10～25 min，40%A→52%A；25～40 min，52%A→70%A；40～50 min，70%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～36 min時(shí)在284 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，36～44 min時(shí)在208 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)23-乙酰澤瀉醇B，45～50 min時(shí)246 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)23-乙酰澤瀉醇C；柱溫：30℃；體積流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 混合對(duì)照品貯備溶液的制備分別精密稱取23-乙酰澤瀉醇B對(duì)照品1.62 mg、23-乙酰澤瀉醇C對(duì)照品1.54 mg、橙黃決明素對(duì)照品2.67 mg、蘆薈大黃素對(duì)照品2.58 mg、大黃素對(duì)照品2.99 mg、大黃酚對(duì)照品2.57 mg、大黃素甲醚對(duì)照品2.08 mg分別置于同一100 mL的容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為15.39、15.09、25.37、25.36、29.30、24.80、20.76 μg/mL混合對(duì)照品貯備溶液。

2.3 供試品溶液的制備取20片血脂靈片，研成細(xì)粉，取約0.3 g，精密稱定質(zhì)量，置50 mL的具塞錐形瓶中，精密量取25 mL的甲醇，緩緩加入后稱定總質(zhì)量，水浴加熱回流60 min，放冷后再稱質(zhì)量，補(bǔ)足減失的甲醇質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾。精密量取續(xù)濾液5 mL置具塞錐形瓶中，氮?dú)獯蹈?，?0 mL的3.5 mol/L H2SO4溶液和20 mL的CHCl3溶液，加熱回流提取2 h，分取CHCl3液，水層用10 mL的CHCl3液振搖提取，合并提取液，用10 mL的水洗滌，棄去水層，CHCl3液水浴蒸干，殘?jiān)D(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解并定容至5 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備按本處方各藥材用量比例及制劑工藝流程分別制備缺決明子、制何首烏藥材陰性對(duì)照品，缺澤瀉藥材陰性對(duì)照品，再按“2.3”項(xiàng)下制備方法分別制備缺決明子、制何首烏藥材陰性對(duì)照溶液，缺澤瀉藥材陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品貯備溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按照既定的HPLC-PDA進(jìn)樣程序設(shè)置進(jìn)樣，最后記錄50 min的HPLC色譜圖。（見(jiàn)圖1）結(jié)果顯示，23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚7個(gè)色譜峰的分離度均良好，結(jié)果顯示所建立的HPLC-PDA方法滿足本次實(shí)驗(yàn)的測(cè)試要求。

圖1 HPLC圖

2.6 線性關(guān)系、定量限和檢出限分別精密吸取0.25、0.50、1.25、2.50、5.00mL的23-乙酰澤瀉醇B（質(zhì)量濃度為15.390μg/mL）、23-乙酰澤瀉醇C（質(zhì)量濃度為15.090 μg/mL）、橙黃決明素（質(zhì)量濃度為25.370μg/mL）、蘆薈大黃素（質(zhì)量濃度為25.360μg/mL）、大黃素（質(zhì)量濃度為29.300 μg/mL）、大黃酚（質(zhì)量濃度為24.800 μg/mL）、大黃素甲醚（質(zhì)量濃度為20.760 μg/mL）混合對(duì)照品溶液，置于透明的容量瓶中，緩慢滴加甲醇溶液定容至5 mL刻度線，即可稀釋制成不同質(zhì)量濃度的23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品溶液，然后依次按既定的HPLC-PDA色譜條件進(jìn)樣10 μL定量分析，根據(jù)峰面積（A）計(jì)算各個(gè)成分的含有量。即23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚7種成分的質(zhì)量（X，μg）為橫坐標(biāo)，其各自的峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，通過(guò)計(jì)算得出各自標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程與相關(guān)系數(shù)r。結(jié)果見(jiàn)表1，各成分的線性關(guān)系在其相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系。以3倍的信噪比（S/N=3）得出儀器檢出限和10倍的信噪比（S/N=10）得出儀器的定量限。

表1 7種化學(xué)成分線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.7 精密度試驗(yàn)取同一批次的血脂靈片樣品1份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法，連續(xù)測(cè)定6次后計(jì)算各成分的含量。23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量RSD分別為1.01%、1.06%、1.02%、1.15%、0.78%、1.23%、1.03%，表明本試驗(yàn)儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批次的血脂靈片供試品，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法，分別于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色譜儀。23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚各成分的峰面 積 的RSD為1.19%、1.02%、1.03%、0.94%、0.93%、1.12%、0.95%，表明樣品溶液中的7種成分在12h內(nèi)均有良好的穩(wěn)定性。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的血脂靈片樣品共6份，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法，分別進(jìn)樣分析。23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量RSD分別為1.01%、1.01%、1.13%、0.99%、0.89%、1.02%、1.05%，表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)取同一批次（批號(hào)：20190420）的血脂靈片樣品共9份，每份取約0.15 g，精密稱定后分別置于50 mL錐形瓶中，每組分別加入23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品貯備液，加入量為血脂靈片樣品中各成分含量的50%、100%和150%，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法進(jìn)行色譜分析，并計(jì)算7種有效成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，平均回收率分別為23-乙酰澤瀉醇B為99.98%（n=9，RSD=0.86%）；23-乙 酰 澤 瀉 醇C為101.29%（n=9，RSD=0.92%）；橙黃決明素為100.88%（n=9，RSD=1.10%）；蘆薈大黃素為99.98%（n=9，RSD=0.92%）；大黃素為101.50%（n=9，RSD=1.63%）；大黃酚為100.19%（n=9，RSD=0.55%）；大黃素甲醚為99.95%（n=9，RSD=0.60%）。（見(jiàn)表2）表明建立的試驗(yàn)方法準(zhǔn)確、可靠。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

續(xù)表2：

2.11 含量測(cè)定取5個(gè)批次的血脂靈片樣品，按照已定的樣品制備和HPLC-PDA程序進(jìn)樣方法進(jìn)行色譜分析，并記錄50 min的色譜峰。計(jì)算23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量。（見(jiàn)表3）

表3 5批樣品中7種化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果（mg/片，n=3）

3 討 論

3.1 測(cè)定指標(biāo)成分的選擇血脂靈片是在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，經(jīng)過(guò)中藥藥劑制備工藝精心制備而成的中藥復(fù)方，該方中各有效成分協(xié)同作用共同發(fā)揮療效[20]。筆者根據(jù)制劑配伍的君臣佐使原則，選擇可能發(fā)揮療效的君藥澤瀉（23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C）和臣藥決明子（橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）中的7種成分為測(cè)定指標(biāo)，采用HPLC-PDA法同時(shí)定量分析了各有效成分在樣品中的含有量。結(jié)果顯示，7種有效成分在一定的HPLC-PDA方法下分離度均良好。

3.2 樣品處理方法和檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)選參照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）中血脂靈片的處理方法處理樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該供試品溶液處理方法可使樣品中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚提取完全。23-乙酰澤瀉醇B在波長(zhǎng)208 nm處有吸收，23-乙酰澤瀉醇C在波長(zhǎng)246 nm處有吸收，橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚在波長(zhǎng)284 nm處均有吸收。故本試驗(yàn)選擇波長(zhǎng)切換法同時(shí)對(duì)23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種有效成分的含量進(jìn)行測(cè)定分析。

3.3 色譜條件的選擇試驗(yàn)過(guò)程中分別對(duì)乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水3種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.1%磷酸水流動(dòng)相體系下進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚7種成分之間色譜峰的分離度均大于1.5，分離效果較好；考察不同溫度（25℃、30℃、35℃）及不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）對(duì)各有效成分色譜峰的分離效果，發(fā)現(xiàn)30℃的柱溫、1.0 mL/min的流速可以達(dá)到色譜分基線平穩(wěn)、分離度和峰形較好的效果；考察不同品牌色譜柱，如Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridgeTMC18（4.6mm×250mm，5μm）、Thermo BDS-C18（4.6mm×250mm，5 μm），結(jié)果顯示W(wǎng)aters XBridgeTMC18柱能將7種指標(biāo)性成分，即23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的色譜峰分開(kāi)，并達(dá)到了良好的分離度。

3.4 樣品含量分析通過(guò)HPLC-UV波長(zhǎng)切換法對(duì)5批血脂靈片中7種成分同時(shí)測(cè)定，結(jié)果顯示不同批次之間三萜類(lèi)成分和蒽醌類(lèi)成分差異較小，其中23-乙酰澤瀉醇B含量最低，為0.050 9～0.057 3 mg/片；23-乙酰澤瀉醇C含量為0.053 5～0.058 8 mg/片；橙黃決明素含量為0.205～0.211 mg/片；蘆薈大黃素含量為0.231～0.255mg/片；大黃酚含量為0.198～0.211mg/片；大黃素甲醚含量為0.209～0.228 mg/片；大黃素含量最高，為0.312～0.342 mg/片。5批樣品均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）中規(guī)定的血脂靈片每片含大黃素（C15H10O5）不得少于0.15 mg。

4 小 結(jié)

本研究建立了HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定血脂靈片中23-乙酰澤瀉醇B、23-乙酰澤瀉醇C、橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的方法，并對(duì)HPLC分離參數(shù)進(jìn)行了一系列的方法學(xué)考察，優(yōu)化得出最理想的HPLC色譜分離方法，表明本次方法同時(shí)測(cè)定血脂靈片中不同有效成分的含量，結(jié)果較為準(zhǔn)確、可靠。本研究首次對(duì)血脂靈片君藥（澤瀉）和臣藥（決明子）中的有效成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，不僅可為血脂靈片內(nèi)在質(zhì)量有效評(píng)價(jià)提供參考，同時(shí)也為其他中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供借鑒。