陳宏昱，程 紅，莊震坤，徐 翀，劉樹楷，趙海梅，彭少林，燕竹青，陳穎穎，焦萁薈，程 晶

（廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院/深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）一直是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因，亦是其防治的關(guān)鍵。由AS所致的臨床疾病主要包括缺血性心臟病、缺血性中風和周圍動脈硬化等，這些疾病都有很高的致殘率、致死率。截至2019年，我國心血管病患病人數(shù)達3.3億，其中腦卒中1 300萬、冠心病1 100萬[1]?；贏S復雜的發(fā)病機制，從20世紀50年代至今涌現(xiàn)出多種相關(guān)假說，包括脂質(zhì)浸潤學說、損傷-反應學說、內(nèi)皮功能學說、炎癥反應學說、氧化學說、剪切應力學說等，這些假說基本明確了炎癥、脂肪、血流異常、內(nèi)皮細胞等作為媒介在AS過程中的重要作用，為進一步研究AS的病理機制奠定了基礎。目前治療AS的藥物主要有他汀類的調(diào)脂藥，以阿司匹林為主的抗血小板聚集藥，通過降低心率-血壓乘積進而減緩AS進程的β受體阻滯劑，以及抑制血管內(nèi)皮增生的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及其受體拮抗劑，但藥物的禁忌證、副作用及患者依從性使得治療存在一定局限性；非藥物治療有動脈內(nèi)膜切除術(shù)、動脈內(nèi)支架植入術(shù)及經(jīng)皮動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)，因手術(shù)的創(chuàng)傷性及其一定比例的再狹窄率使其應用受到限制[2]。近幾年AS相關(guān)microRNA（miRNA）領(lǐng)域的研究飛速發(fā)展，從基因?qū)用娼衣读薃S的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)miRNA作為細胞黏附、增殖，脂質(zhì)攝取和流出，以及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生等病理生理過程的重要調(diào)節(jié)因子，可以直接或間接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能、炎癥反應和脂質(zhì)代謝，以發(fā)揮延緩AS進程的作用[3-4]。

miRNA-126是一種內(nèi)皮細胞特異性miRNA，是在內(nèi)皮細胞分化過程中和成年內(nèi)皮細胞中表達最多的miRNA之一[5]。在維持血管完整性和調(diào)節(jié)血管生成方面，miRNA-126能夠直接靶向某種蛋白或調(diào)節(jié)因子，激活相關(guān)分子途徑以發(fā)揮抗AS的作用。研究表明，HUVEC凋亡小體中過表達的miRNA-126-3p靶向祖細胞動員的負調(diào)節(jié)因子G蛋白信號調(diào)節(jié)因子16（Regulator of G-protein signaling 16，RGS16）可以誘導趨化因子（C-X-C基序）配體12[chemokine（C-X-C motif）ligand 12，CXCL12]表達，通過促進具有內(nèi)皮祖細胞功能的lin-Sca-1+祖細胞募集，以加速內(nèi)皮修復的方式抑制AS進展[6-7]。miRNA-126-3p作為miRNA-126的主要客鏈，在AS進展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，故本研究嘗試以miRNA-126-3p為主要對象以闡明補腎通脈方對miRNA-126的調(diào)控作用。

1 材 料

1.1 實驗動物10周齡普通級健康雄性新西蘭大白兔15只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（粵）2019-0035，正式實驗開展前適應性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件為溫度（23±2）℃，濕度（50±10）%，自由攝食水。本實驗中新西蘭大白兔均由耳緣靜脈注射空氣致死，實驗操作符合一般動物實驗倫理學原則，經(jīng)醫(yī)學實驗動物管理委員會批準。

1.2 藥物與試劑補腎通脈方，方藥組成：附子15 g，桂枝15 g，酒蓯蓉30 g，川芎20 g，三七10 g，麥冬15 g，陳皮10 g，熟地黃10 g，石菖蒲15 g，制天南星10 g，人參30 g。上述中藥均來源于深圳市中醫(yī)院藥劑科，藥劑科主任審核鑒定后由醫(yī)院煎藥房煎煮成湯劑。氨基甲酸乙酯（烏拉坦，批號：H20130609）購自上海滬試實驗室器材股份有限公司；阿托伐他?。⑵胀祝枺篐20051408）購自美國輝瑞制藥有限公司；TRIzol Reagent（貨號：15596-018）購自廣州創(chuàng)融生物科技有限公司；人源氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）（貨號：OX-LDL-01）購自北京華力德科技有限公司；RIPA裂解液（貨號：P0013B）購自廣州繼科生物科技有限公司；0.1%Ⅰ型膠原酶（貨號：AAPR531-A）購自廣州沛瑜生物制品有限公司；胰蛋白酶（貨號：T6325-100g）購自上海麥克林生化科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix（貨號：RR036A）購自廣州天駿生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：RBWG5-100T）購自廣州一科生物科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix（貨號：SL2690-1mL）購自深圳市文樂生物科技有限公司；CD31抗體（貨號：ab28364）購自廣州維德昕生物科技有限公司；山羊抗兔IgG H&L（貨號：ab150077）購自寶如億（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器H1M型多功能微孔板檢測儀（廣州達瑞生物技術(shù)股份有限公司）；5810R型臺式大容量冷凍離心機（廣州金鋒生物科技有限公司）；ME203E型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；371型二氧化碳培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Ts2R倒置顯微鏡（北京中實天工儀器設備有限公司）；FQD-96A型熒光定量PCR儀（濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）。

2 方 法

2.1 補腎通脈方及阿托伐他汀含藥血清的制備將15只新西蘭大白兔隨機分為補腎通脈方組、阿托伐他汀組及正常組，每組5只；補腎通脈方組和阿托伐他汀組每只兔分別給予30 mL補腎通脈方湯劑、30 mL阿托伐他汀溶液（按0.8 mg/kg給藥）進行灌胃，1次/d，灌胃7 d，在末次給藥2 h后采血；正常組兔正常進食水，7 d后采血；腹腔注射20%烏拉坦溶液（按1.2 g/kg給藥）對兔進行麻醉，觀察兔活動度，待兔失去疼痛反射后解剖，充分暴露腹主動脈后采血；所得血液標本靜置于37℃環(huán)境中，3 000 r/min離心15 min，無菌條件下使用移液器分離血清，分裝后保存于-20℃環(huán)境中備用。

2.2 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）培養(yǎng)獲取健康剖腹產(chǎn)新生嬰兒臍帶（已簽署知情同意書），立即在室溫下用濃度為0.1%的Ⅰ型膠原酶消化，1 h后得血管內(nèi)皮細胞，置于5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱進行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)基采用含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基（50 μg/mL肝素鈉、2 mmol/L谷氨酰胺、10 U/mL貝復濟、50 U/mL慶大霉素、100 U/mL青霉素），定期更換培養(yǎng)液，并在倒置顯微鏡下觀察原代及傳代細胞的形態(tài)特點。

2.3 HUVEC鑒定將已培養(yǎng)完成的HUVEC接入鋪有蓋玻片的六孔板內(nèi)，24 h后，觀察細胞融合情況，細胞融合至70%左右時開始染色；HUVEC經(jīng)過固定、透化和封閉，加入CD31抗體，后于4℃條件下孵育12 h；次日經(jīng)PBS漂洗后加入熒光二抗，室溫孵育1 h；重復上述操作，共漂洗3次，并在最后一次漂洗時加入核染料DAPI，再加入10～20 μL封片劑封片；最后鏡下觀察拍照。

2.4 ox-LDL干預HUVEC建立內(nèi)皮細胞損傷模型在96孔板中配置100 μL的HUVEC細胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)。24 h后向培養(yǎng)板加入10 μL不同質(zhì)量濃度（10、50、100 μg/mL）的ox-LDL，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱孵育24 h，然后向每孔加入10 μL CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，用酶標儀測定各組細胞在450 nm處的吸光度，了解細胞活性；選定ox-LDL作用濃度。以同樣的方法選定合適的作用時間，最終以合適的ox-LDL作用濃度及作用時間干預HUVEC建立內(nèi)皮細胞損傷模型。

2.5 分組及含藥血清干預在ox-LDL誘導內(nèi)皮細胞損傷模型建立中，將HUVEC分為8組：正常對照組，損傷對照組，補腎通脈方5%、10%、15%濃度組，阿托伐他汀5%、10%、15%濃度組。正常對照組予正常兔血清干預；在細胞損傷模型建立完成后，損傷對照組予正常兔血清干預，補腎通脈方組及阿托伐他汀組予不同濃度的含藥血清干預，含藥血清濃度設定為補腎通脈方5%、10%、15%及阿托伐他汀5%、10%、15%。24 h后用CCK-8法檢測各組細胞活性。

2.6 qPCR檢測HUVEC中miRNA-126-3p的表達分別收集正常對照組、損傷對照組、補腎通脈方10%濃度組和阿托伐他汀組細胞，經(jīng)PBS漂洗3次，加入Trizol裂解液。分離提取總miRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，再以cDNA為模板，采用SYBR Green染料法相對定量qPCR實驗；所采用反應條件：94℃預變性2 min，94℃5 s、60℃30 s共40個循環(huán)，72℃10 min，最后以2-ΔΔCt法（Livak法）計算miRNA-126-3p相對表達量，每組實驗均進行3次。引物序列詳見表1。

表1 qPCR引物序列

2.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 HUVEC培養(yǎng)光鏡下可見大量3～4個成團的內(nèi)皮細胞。細胞接種后4 h開始貼壁生長，5 d左右可融合成片，原代細胞呈小三角形、圓形或梭形，細胞分布不均勻，成簇生長互不重疊。（見圖1）

圖1 光鏡下觀察HUVEC細胞形態(tài)

3.2 HUVEC鑒定免疫熒光結(jié)果顯示所有HUVEC細胞均表達CD31，表明本實驗分離培養(yǎng)的HUVEC細胞純度較高。（見圖2）

圖2 CD31免疫熒光染色HUVEC細胞

3.3 ox-LDL作用濃度及作用時間對細胞活性的影響以ox-LDL作用24 h為條件，ox-LDL干預質(zhì)量濃度為10、50、100 μg/mL時，細胞活性均有下降。與正常對照組比較，10、50 μg/mL組細胞活性下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）；100 μg/mL組細胞活性下降至正常對照組的47%，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。（見圖3A）選定ox-LDL作用質(zhì)量濃度為50 μg/mL，ox-LDL干預時間分別為12、24、48 h，細胞活性均有下降。與正常對照組比較，干預12、24 h組細胞活性下降不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）；48 h組細胞活性下降至正常對照組的53%，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。（見圖3B）綜上，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的ox-LDL作用24 h為最適合的實驗條件。

圖3 ox-LDL作用濃度及作用時間對細胞活性的影響（±s，n=6）

3.4 補腎通脈方及阿托伐他汀對ox-LDL內(nèi)皮細胞損傷的保護作用與正常對照組比較，損傷對照組、補腎通脈方5%濃度組、補腎通脈方15%濃度組、阿托伐他汀5%濃度組及阿托伐他汀15%濃度組細胞活性均明顯降低（P〈0.05）；與損傷對照組比較，補腎通脈方5%、10%、15%濃度組及阿托伐他汀10%、15%濃度組細胞活性均明顯升高（P〈0.05）；與補腎通脈方10%濃度組比較，補腎通脈方5%、15%濃度組細胞活性均明顯降低（P〈0.05）；與阿托伐他汀10%濃度組比較，阿托伐他汀5%、15%濃度組細胞活性均明顯降低（P〈0.05）。表明補腎通脈方對ox-LDL內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用。（見圖4）

圖4 各組細胞活性水平比較（±s，n=8）

3.5 各組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量比較與正常對照組比較，阿托伐他汀組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）；與損傷對照組比較，補腎通脈方組及阿托伐他汀組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量均明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）；補腎通脈方組HUVEC細胞中miRNA-126-3p的相對表達量與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見圖5）

圖5 各組HUVEC細胞中miRNA-126-3p相對表達量比較（±s，n=3）

4 討 論

本研究通過體外實驗已證實補腎通脈方對ox-LDL誘導的內(nèi)皮細胞損傷具有保護作用，并能上調(diào)miRNA-126-3p的表達。中醫(yī)學以“以證定法，以法選方”為基本原則，動脈粥樣硬化以腎氣虧虛、痰瘀互結(jié)為基本證型。腎陽虧虛，則鼓動無力，津液運行遲緩，布散失常，聚留而成痰瘀，與血液軸流失常的病理狀態(tài)相似，并逐步發(fā)展為炎癥細胞浸潤、內(nèi)皮損傷等病理階段；腎陰不足，濡潤失司，津液化生乏源，則津枯血少，結(jié)為痰瘀，此過程與血管內(nèi)皮損傷后炎癥細胞浸潤類似，最后發(fā)展為動脈粥樣硬化。故自擬方藥“補腎通脈方”以奏補腎益氣、活血化瘀之功，發(fā)揮內(nèi)皮保護功能而起到預防作用。該方中用附子、桂枝溫腎助陽，徐生腎氣，桂枝以通為主，附子以補為要，一通一補，使陽氣充沛，腎氣得充；人參為補氣之要藥，氣為血之帥，氣充才能鼓動脈道內(nèi)的血液運行周身，與熟地黃相配，使陰中有陽，助生精血；熟地黃補血滋陰，益精填髓?！侗静菥V目》有云：“填骨髓，長肌肉，生精血，補五臟內(nèi)傷不足，通血脈，利耳目，黑須發(fā)?！笔斓攸S兼有補益和通利血脈兩種功效；肉蓯蓉歸腎經(jīng)，專補腎中水火，與熟地黃為伍可增強溫腎陽、益精血之功；川芎善行散，走而不守，上至巔頂，下至血海，活血祛瘀之力強，三七尤其擅長活血、止血，但補虛強壯亦能彰顯其特點，正如《本草綱目拾遺》中記載：“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等，故稱人參三七，為中藥中之最珍貴者?！贝ㄜ?、三七兩藥配伍一者可補血潤脈，二者可活血通脈；麥冬養(yǎng)陰生津，與人參相伍，一補一潤，則益氣養(yǎng)陰之功益彰；陳皮理氣健脾，使全方補而不滯；石菖蒲、制天南星燥濕化痰，使痰瘀得散。各藥相配，旨在補腎活血化痰。大量臨床研究已經(jīng)證實了以補腎、活血為首要原則的中藥處方治療動脈粥樣硬化的有效性[8-9]。王信林等[10]研究表明人參皂苷Rg1對載脂蛋白E基因敲除小鼠的主動脈動脈粥樣硬化具有較好的抑制作用，其作用機制可能為抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路異?；罨柚咕奘杉毎虼傺仔途奘杉毎D(zhuǎn)化，抑制炎癥細胞浸潤，從而通過抑制炎癥反應發(fā)揮內(nèi)皮保護作用。孫曉晶等[11]采用人參皂苷Rb1干預缺血性腦卒中大鼠模型，結(jié)果表明，實驗組中胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）與蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的表達上調(diào)。行為學評分、水迷宮實驗顯示，人參皂苷Rb1對缺血性腦卒中大鼠模型腦組織具有保護作用，其機制可能與調(diào)控PI3K/AKT信號通路相關(guān)。該通路與細胞增殖、凋亡密切相關(guān)，可通過促進內(nèi)皮修復的直接方式保護內(nèi)皮細胞。亦有相關(guān)實驗證明了三七、川芎、附子、桂枝、肉蓯蓉的內(nèi)皮保護特性[12-14]。就整體方藥而言，本課題組前期研究應用該方治療頸動脈粥樣硬化患者，結(jié)果提示補腎通脈方能夠發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，其作用效果與阿托伐他汀組無明顯差別[15]；體外實驗表明，補腎通脈方可上調(diào)抑制凋亡基因B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達，降低促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表達活性，減少內(nèi)皮細胞的凋亡數(shù)，抑制細胞凋亡發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用，此過程可能與補腎通脈方上調(diào)miRNA-126-3p的表達有關(guān)[16]；同時，該方還能下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinases-2，MMP2），上調(diào)金屬蛋白酶2組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2）在兔動脈粥樣硬化模型斑塊內(nèi)的表達，而MMP2作為分解斑塊內(nèi)基質(zhì)的主要蛋白，其表達水平的下降能有效穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊、抑制動脈粥樣硬化進展[17-18]。所以補腎通脈方不僅能夠在動脈粥樣硬化初期階段保護損傷的內(nèi)皮細胞，在動脈粥樣硬化進展期也能夠有效穩(wěn)定斑塊，進而延緩動脈粥樣硬化的進一步發(fā)展。

通過與給定靶標mRNA的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，miRNA在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)基因表達模式，進而調(diào)控蛋白質(zhì)的表達水平以達到影響動脈粥樣硬化發(fā)展過程的作用[19-21]。近幾年，有一些研究已經(jīng)明確了有關(guān)miRNA在炎癥激活、細胞增殖和內(nèi)皮細胞再生中的調(diào)節(jié)作用[22-23]。miRNA-126-3p防治動脈粥樣硬化的作用機理較為復雜，在多個方面均有論證。QU Q X[24]等通過細胞實驗研究證明miRNA-126-3p能促進HUVECs增殖、遷移和成管作用，并在之后的動物試驗中建立大鼠靜脈動脈化模型，結(jié)果分析顯示，用miRNA-126-3p修飾的人臍帶間充質(zhì)干細胞移植治療的組別具有更高的靜脈再內(nèi)皮化，并可以顯著減少大鼠移植血管內(nèi)膜增生。此作用機制可能與SPRED-1（sprouty related EVH1 domain containing 1，SPRED-1）/PI3K/AKT/ERK1/2信號通路有關(guān)。該信號通路與細胞增殖、遷移密切相關(guān)，能加速病變血管的內(nèi)皮修復。高水平的促炎性細胞因子一直被認為是動脈粥樣硬化疾病發(fā)展及并發(fā)癥發(fā)生的危險因素。OHTA M等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）能夠抑制人臍靜脈細胞融合細胞中miRNA-126-3p的表達水平，加速內(nèi)皮細胞炎癥反應，其作用機制可能與調(diào)控細胞間黏附分子1（ICAM-1），促進單核細胞向內(nèi)皮細胞遷移有關(guān)。除了脂質(zhì)聚集所致的內(nèi)皮損傷之外，大量單核細胞黏附于內(nèi)皮細胞表面也是動脈粥樣硬化前期進展的關(guān)鍵因素之一。IL-6可通過下調(diào)miRNA-126-3p的表達水平促進ICAM-1表達，進而導致動脈粥樣硬化進展。另外，細胞自噬作為機體自我更新的保護機制，對于抗細胞衰老及凋亡至關(guān)重要。研究表明，ox-LDL誘導的HUVEC自噬通量下調(diào)，而miRNA-126的干預能夠逆轉(zhuǎn)此過程、挽救自噬通量，以減少HUVEC中的細胞損傷及細胞凋亡，此過程可能與PI3K/AKT/mTOR通路有關(guān)，但具體客鏈尚未明確[26]，這也值得研究者深入探索。這些研究確定了miRNA-126-3p無論是調(diào)控內(nèi)皮細胞增殖和遷移、抑制炎癥反應，還是抗細胞衰老及凋亡，均能夠發(fā)揮延緩動脈粥樣硬化進展的作用，這與補腎通脈方的內(nèi)皮保護機制相契合。

本實驗通過體外實驗觀察補腎通脈方對miRNA-126-3p的調(diào)控作用，嘗試從基因?qū)用骊U釋補腎通脈方對動脈粥樣硬化中內(nèi)皮損傷的保護作用。結(jié)果顯示，在補腎通脈方含藥血清的作用下，ox-LDL誘導的HUVEC損傷模型細胞活性明顯升高。與損傷對照組比較，5%、10%、15%濃度補腎通脈方均能挽救細胞活性；10%濃度的作用最明顯，且補腎通脈方10%濃度組細胞活性與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。同時，與損傷對照組比較，補腎通脈方含藥血清能明顯提高HUVEC中miRNA-126-3p的表達水平，且補腎通脈方組HUVEC中miRNA-126-3p表達水平與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。綜上所述，補腎通脈方能夠上調(diào)miRNA-126-3p的表達以發(fā)揮內(nèi)皮保護作用，進而延緩動脈粥樣硬化進展。