李 偉

（天津市藥品檢驗研究院，天津 300070）

頭孢菌素類藥物是β-內(nèi)酰胺類抗生素中重要的組成部分，其分子構(gòu)成中含有碳青霉烯結(jié)構(gòu)，是β-內(nèi)酰胺類抗生素中的7-氨基頭孢烷酸（7-ACA）的衍生物。因其具有抗菌譜廣、抗菌性能強(qiáng)、毒性低、耐酸耐酶性好以及分子結(jié)構(gòu)易于改造等優(yōu)點，自第一代青霉素被發(fā)現(xiàn)以來，發(fā)展迅速，現(xiàn)已研制出第四代頭孢菌素，臨床也被廣泛使用。隨著臨床使用量的增加，有關(guān)此類藥物不良反應(yīng)的報道也日益增加［1-3］。常見的不良反應(yīng)為速發(fā)型過敏反應(yīng)，研究表明，速發(fā)型過敏反應(yīng)是頭孢菌素類藥物中存在的高分子雜質(zhì)引起的，而并不是人們通常認(rèn)為的藥物本身［4-6］。因此，考慮到頭孢菌素類藥物的臨床用藥安全性，對此類藥物中的高分子雜質(zhì)進(jìn)行控制非常必要。近年來國內(nèi)對包括頭孢菌素類藥物在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子聚合物的研究報道較多［7-11］，但在頭孢菌素類藥物進(jìn)行質(zhì)量控制研究中，高分子雜質(zhì)的控制仍然是其中的薄弱環(huán)節(jié)。本文總結(jié)了頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)來源、分類和形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)特性以及生理特性及致敏機(jī)制，并就包括葡聚糖凝膠G-10分子排阻色譜法、高效凝膠分子排阻法及反相高效液相色譜法等分離分析方法進(jìn)行匯總，總結(jié)了《中國藥典》中收載的關(guān)于此類藥物中高分子雜質(zhì)的分析方法，并對新技術(shù)的應(yīng)用前景進(jìn)行展望，為頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)的研究及檢測提供參考。

1 頭孢菌素類藥物中高分子雜質(zhì)

1.1 高分子雜質(zhì)的定義、來源及分類 頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)通常是指在生產(chǎn)、貯存、使用過程中產(chǎn)生的分子量大于藥物本身的特定雜質(zhì)的總稱，其分子量一般大于1 000 Da［12］。

頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)按其來源劃分，可分為外源性雜質(zhì)和內(nèi)源性雜質(zhì)。外源性雜質(zhì)一般針對全發(fā)酵類的抗生素（如青霉素類），主要包括發(fā)酵工藝中引入的多糖、多肽、蛋白等大分子雜質(zhì)或者該類大分子與抗生素本身結(jié)合產(chǎn)生的大分子雜質(zhì)。內(nèi)源性雜質(zhì)是頭孢菌素自身聚合產(chǎn)生的寡聚物和多聚物的總稱，其既可來源于生產(chǎn)過程，又可來源于運輸貯存和使用過程［13］。隨著生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和提高，以及對頭孢菌素類抗生素結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)一步明確，頭孢菌素類抗生素已經(jīng)不再依靠全發(fā)酵獲得，而是通過在天然頭孢菌素C的基礎(chǔ)上對其結(jié)構(gòu)改造得到半合成抗生素，引入外源性雜質(zhì)的概率和含量都大大降低，因此對內(nèi)源性雜質(zhì)的控制則成為當(dāng)前頭孢菌素類抗生素中高分子雜質(zhì)研究的重點。

1.2 高分子雜質(zhì)的形成機(jī)制及結(jié)構(gòu)特性 頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)的形成機(jī)制主要是聚合反應(yīng)，早在1991年胡昌勤等［14］就對頭孢菌素結(jié)構(gòu)及其聚合反應(yīng)的類型進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)，聚合反應(yīng)分為N型聚合反應(yīng)和L型聚合反應(yīng)。N型聚合反應(yīng)：頭孢菌素的母核為7-氨基頭孢烷酸（7-ACA），如頭孢噻啶、頭孢呋新、頭孢哌酮、頭孢孟多、頭孢噻酚等藥物，由于在7-ACA母核的7位側(cè)鏈中沒有自由氨基等活性基團(tuán)，此類型的聚合反應(yīng)只依賴于頭孢菌素的母核結(jié)構(gòu)，7-ACA在特定條件下開環(huán)從而得到親核的仲胺基，由于仲胺基具有較強(qiáng)的活性，與7-ACA另一側(cè)的羰基親核加成，形成自身聚合物。L型聚合反應(yīng)：這種聚合反應(yīng)由頭孢菌素的側(cè)鏈參與其中，7-ACA中的羰基碳原子受到7位側(cè)鏈上存在的活性基團(tuán)親核攻擊而形成聚合物。對于7位側(cè)鏈中含有自由氨基等活性基團(tuán)的化合物，聚合反應(yīng)發(fā)生的情況又因受到pH值的影響而不同：當(dāng)pH值小于7時，一般會在母核之間產(chǎn)生N型聚合反應(yīng)，此時側(cè)鏈不參與聚合；而當(dāng)pH值大于7時，母核與7位側(cè)鏈同時發(fā)生聚合反應(yīng)，也就是N型和L型聚合反應(yīng)都會發(fā)生，這種情況下產(chǎn)生的聚合物分子量也會比單純的N型聚合反應(yīng)下生成的聚合物分子量大，比如頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢噻肟等。但是兩種聚合反應(yīng)的強(qiáng)度大小則與頭孢菌素的化學(xué)結(jié)構(gòu)本身有關(guān)。

1.3 高分子雜質(zhì)的生理特性及致敏機(jī)制 過敏反應(yīng)是抗原抗體相互作用產(chǎn)生的特異性反應(yīng)，主要是由頭孢菌素類藥物在生產(chǎn)、貯存和配制過程以及進(jìn)入人體后通過降解或者聚合產(chǎn)生的特定雜質(zhì)（多為大分子雜質(zhì)）與人體內(nèi)的多糖、多肽及蛋白質(zhì)等結(jié)合而引起的不良反應(yīng)［15］。人體內(nèi)的特異性抗體免疫球蛋白E（IgE）抗體與過敏反應(yīng)密切相關(guān)［16］。頭孢菌素類藥物中7位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)是該類藥物的抗原決定簇，其結(jié)構(gòu)與青霉素6位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似度越高，引發(fā)交叉過敏反應(yīng)的概率就越大，反之，則不易引起交叉過敏反應(yīng)［17］。胡昌勤等［18］利用離子對凝膠色譜法分離得到氨曲南中的大分子雜質(zhì)，通過大鼠被動皮膚過敏反應(yīng)（PCA）發(fā)現(xiàn)，Kav（有效分配系數(shù)）=0的高分子雜質(zhì)能使PCA出現(xiàn)陽性反應(yīng)（+），而Kav＜0的氨曲南本身作對照，PCA則出現(xiàn)陰性反應(yīng)（-）。后續(xù)研究［19］通過試驗表明，頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)具有至少兩個抗原決定簇，可作為多價半抗原引發(fā)IgE介導(dǎo)的Ⅰ型速發(fā)型特異過敏反應(yīng)，而且聚合物的分子量越大，其抗原決定簇位點越多，引發(fā)過敏的可能性就越大。

2 高分子雜質(zhì)的分析方法

2.1 葡聚糖凝膠G-10分子排阻色譜法 葡聚糖凝膠G-10分子排阻色譜法（Sephadex G-10 SEG）是凝膠色譜法（GPC）的一種，是高效分子排阻色譜法（HPSEC）的前身，該方法最早由我國的胡昌勤等［20］研究并推廣使用。本方法的原理是利用高分子雜質(zhì)與藥物分子的分子量差異，通過凝膠色譜的分子篩作用，在流動相洗脫過程中，小分子量的藥物分子保留在凝膠顆粒的空隙中，而大分子雜質(zhì)由于體積大于凝膠顆粒之間的空隙而不能保留其中，最先被流動相洗脫進(jìn)入紫外檢測器中從而被檢測出色譜峰，而藥物分子及其降解產(chǎn)物等小分子化合物則晚于大分子雜質(zhì)被洗脫出來。為了保證該方法的精密度、準(zhǔn)確性和重復(fù)性，以濃度為1 mg/ml的藍(lán)色葡聚糖2000溶液在流動相A［0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液（61∶39）］和流動相B（水）中保留時間、理論板數(shù)和拖尾因子來作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時間在兩種流動相系統(tǒng)中的比值應(yīng)在0.93～1.07之間，對照溶液主峰和供試品溶液中聚合物峰與相應(yīng)流動相中藍(lán)色葡聚糖2000峰的保留時間比值均應(yīng)在0.93～1.07之間。張紅梅等［21］采用填充劑為葡聚糖凝膠G-10（40～120 μm）的玻璃柱（內(nèi)徑1.5 cm，柱長36.5 cm），對頭孢孟多酯鈉中的聚合物進(jìn)行分離測定，結(jié)果表明，該方法能有效分離頭孢孟多酯鈉中的聚合物。該研究進(jìn)一步考查了樣品濃度對測定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)隨著樣品濃度的增加聚合物峰面積增大，但隨之而來的弊端就是聚合物峰與藥物本身峰的分離度越來越差，而樣品濃度過低則聚合物峰面積過小，不易被檢測出來，為了平衡峰面積與分離度之間的矛盾，最終確定樣品的進(jìn)樣濃度為2.0 g/ml，在該濃度下，聚合物峰能與主峰達(dá)到有效分離，且峰面積適中。劉樹彬等［22］建立了Sephadex G-10 SEG方法來測定注射用頭孢地嗪鈉中高聚物的含量，由于頭孢地嗪對照品本身可以在水溶液中締合，因此可以采用頭孢地嗪作為自身對照。研究表明，該方法專屬性強(qiáng)、分離效果好。由于頭孢菌素類藥物在水溶液中穩(wěn)定性差，試驗中考查了樣品溶液的穩(wěn)定性，分別取供試品溶液于0、1.5和3 h進(jìn)樣分析，聚合物含量分別為0.183%、0.240%和0.356%，表明供試品溶液中的聚合物含量隨著放置時間的增加而增大，因此為了保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求供試品溶液在配制好以后立即進(jìn)樣測試。

表1 《中國藥典》2020年版頭孢菌素類藥物聚合物的分析方法匯總（G-10法）

2.2 高效凝膠分子排阻法 高效凝膠分子排阻法（HPSEC）是在Sephadex G-10 SEG的基礎(chǔ)上，采用更為高效的凝膠色譜填料作為填充劑，來實現(xiàn)對藥物中存在的高分子雜質(zhì)更好的分離效果，其分離機(jī)制仍是分子排阻。相較于Sephadex G-10 SEG法，HPSCE法不需要使用復(fù)雜的流動相系統(tǒng)，檢驗周期短，分離效果好，并能夠在一定程度上實現(xiàn)分離不同分子量的高分子雜質(zhì)。倪瓊珠［24］采用填料為球狀蛋白色譜用親水硅膠（分子量范圍1 000~10 000）的TSK gel-G2000SWXL高效凝膠色譜柱對鹽酸頭孢替安中的高分子雜質(zhì)進(jìn)行分析，在Sephadex G-10 SEG法使用的磷酸鹽流動相A的基礎(chǔ)上加入適當(dāng)比例的乙腈，使磷酸鹽緩沖液與乙腈的比例為90∶10，鹽酸頭孢替安中的高分子雜質(zhì)能夠與藥物分子本身得到很好的分離，并且檢出的高分子雜質(zhì)含量比Sephadex G-10 SEG法高，檢測時間15 min左右，該方法更高效簡便。王娜等［25］在測定注射用鹽酸頭孢替安中的高分子雜質(zhì)時，在系統(tǒng)適用性試驗中增加了靈敏度溶液和系統(tǒng)適用性溶液。通過增加系統(tǒng)適用性溶液，可以更好的提升該方法對高分子雜質(zhì)的檢測能力。取供試品溶液于80℃加熱2 min作為系統(tǒng)適用性溶液，通過加熱破壞，產(chǎn)生更多的高分子雜質(zhì)，在該色譜條件下，主峰前檢出的8個高分子雜質(zhì)峰均能與主峰達(dá)到良好的分離效果，且各雜質(zhì)峰之間的分離度良好。通過該研究進(jìn)一步說明，高效凝膠色譜法檢測出的主峰前的高分子雜質(zhì)峰不再像Sephadex G-10 SEG法那樣將多種分子量大于藥物本身的高分子雜質(zhì)包含在一個色譜峰中，而是可以將不同分子量的高分子雜質(zhì)進(jìn)行有效的分離，這也為進(jìn)一步研究高分子雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)提供了有利的技術(shù)支撐。王小明等［26］在測定頭孢克肟顆粒中聚合物含量時，采用分離效果更好的剛性、球形、親水的多孔聚甲基丙烯酸酯樹脂鍵合硅膠為填充劑的色譜柱（TSKgel G2500 PWxl，7.8 mm×30 cm，7 μm），分離出更多的高分子雜質(zhì)。在該色譜系統(tǒng)中對頭孢克肟特定雜質(zhì)（雜質(zhì)A、B、C、D、E、F）進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)A、D、E在頭孢克肟峰之前被洗脫出來，因此在計算頭孢克肟高分子雜質(zhì)時，將雜質(zhì)A、D、E扣除，這樣得出的聚合物含量結(jié)果更加準(zhǔn)確，有效減少了在主峰前流出的已知特定雜質(zhì)與輔料等共出峰的影響。崇小萌等［27］采用高效凝膠色譜法測定注射用頭孢硫脒中的聚合物，并與Sephadex G-10 SEG法的測定結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明高效凝膠法能更有效的檢測樣品中的高分子雜質(zhì)。楊倩等［28］通過優(yōu)化流動相中磷酸鹽緩沖液濃度、乙腈的添加比例、色譜柱溫度等條件，建立了合理有效的方法，在主峰前檢測出4個高分子雜質(zhì)峰，該方法可以有效分離頭孢替唑鈉及其制劑中的高分子雜質(zhì)。李敏等［29］建立的TSK凝膠色譜法，能夠分離頭孢妥侖匹酯片中高分子雜質(zhì)，并有效去除輔料的干擾。熊雯等［30］利用兩種凝膠色譜法測定注射用頭孢地嗪鈉中的高分子雜質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)HPSEC法比Sephadex G-10 SEG法能更真實全面的反映出樣品中的高分子雜質(zhì)的情況。

HPSEC法與Sephadex G-10 SEG法相比，雖然能解決分離效果差、分析時間長、受輔料干擾嚴(yán)重、只能檢測高分子雜質(zhì)總量等諸多不足之處，但是其檢驗機(jī)制仍然是分子排阻，主峰前流出的色譜峰中不完全是高分子聚合物。由于高效凝膠填料在具備分子排阻作用外，還會產(chǎn)生非排阻作用，在疏水作用、吸附作用等干擾下，化合物的出峰順序并不一定完全按分子量大小。崇小萌等［27］在測定注射用頭孢硫脒中的聚合物的時候，通過柱切換聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS），對主峰前后的雜質(zhì)峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證發(fā)現(xiàn)，主峰后的3個雜質(zhì)峰中，有2個色譜峰為高分子雜質(zhì)峰。因此需要在此方法的基礎(chǔ)上，聯(lián)用LC-MS技術(shù)，對化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為后續(xù)的研究提供了新的思路?！吨袊幍洹?020年版共收載頭孢地嗪鈉和頭孢米諾鈉兩個頭孢菌素類品種采用HPSEC測定樣品中的高分子雜質(zhì)，并將檢驗項目的名稱定義為“有關(guān)物質(zhì)Ⅱ”，這也進(jìn)一步印證了，采用此方法檢測出的主峰前的雜質(zhì)不完全是高分子雜質(zhì)，只是作為“有關(guān)物質(zhì)Ⅰ”項下采用反相高效液相色譜法檢測出的雜質(zhì)的一個補(bǔ)充。分析方法匯總見表2。

表2 《中國藥典》2020年版頭孢菌素類藥物有關(guān)物質(zhì)Ⅱ的分析方法匯總（HPSEC）

2.3 反相高效液相色譜法 反相高效液相色譜法（RP-HPLC）是在藥物及雜質(zhì)分離分析中最為常用的一種分析方法，樣品中的主成分和雜質(zhì)由于具有不同的極性大小，在不同的色譜柱填料、流動相的組成（pH值、緩沖鹽濃度、有機(jī)相比例）、柱溫、流速等參數(shù)共同作用下，不同極性的分子相繼被洗脫出來，因此該方法具有更強(qiáng)的專屬性和靈敏度。近年來，不少研究者利用RP-HPLC法來檢測頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)［31］。唐浩等［32］采用RP-HPLC法同時測定頭孢哌酮鈉原料藥中小分子雜質(zhì)及指針性大分子雜質(zhì)，通過優(yōu)化流動相系統(tǒng)，增大有機(jī)相比例，并采用梯度洗脫的方法，在檢測頭孢哌酮已知雜質(zhì)A、B、C、D、E、F的同時，在相對保留時間為1.5～2.5處發(fā)現(xiàn)兩個未知雜質(zhì)，采用LC-MS對未知雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，兩個化合物的分子量分別為678 Da和791 Da，均大于頭孢哌酮的分子量，可以作為頭孢哌酮的高分子雜質(zhì)進(jìn)行控制。李進(jìn)等［33］采用乙腈-甲醇水梯度洗脫的方法對頭孢克肟中的雜質(zhì)進(jìn)行分離，在分離出的11個疑似高分子雜質(zhì)中，經(jīng)過LC-MS分析，確定其中5個為高分子雜質(zhì)，其結(jié)構(gòu)分別為頭孢克肟二聚體異構(gòu)體、頭孢克肟脫水二聚體和頭孢克肟二聚體以及頭孢克肟二聚體衍生物，各個雜質(zhì)分離度均符合要求，該方法專屬性好。彭潔等［34］采用C8色譜柱同時測定頭孢呋辛酯及其制劑中的小分子雜質(zhì)及高分子雜質(zhì)，通過改變流動相中磷酸鹽的濃度及優(yōu)化梯度洗脫程序，使高分子雜質(zhì)分離良好，方法專屬性強(qiáng)。

由于高分子雜質(zhì)一般極性較弱，在RP-HPLC系統(tǒng)中出峰時間較晚，通常采用增大流動相中有機(jī)相比例，并同時使用梯度洗脫的方式來縮短檢驗周期。另外，利用RP-HPLC檢測高分子雜質(zhì)時，由于對高分子雜質(zhì)較難定位，并且高分子雜質(zhì)穩(wěn)定性差，很難獲得對照品，無法通過雜質(zhì)對照品來定位。在方法開發(fā)過程中，通常要聯(lián)用LC-MS等技術(shù)來對高分子雜質(zhì)進(jìn)行分子量確認(rèn)和結(jié)構(gòu)解析，為了提高新方法的開發(fā)效率、縮短研究周期、減少經(jīng)費開支，研究者一般采用試驗設(shè)計（DOE）來作為RP-HPLC方法開發(fā)的主要手段［35］。

3 結(jié)語與展望

頭孢菌素類藥物中的高分子雜質(zhì)，尤其是內(nèi)源性雜質(zhì)是控制頭孢菌素類藥物質(zhì)量的關(guān)鍵點，同時也是薄弱環(huán)節(jié)。隨著科技水平的發(fā)展以及科研工作者對于高分子雜質(zhì)控制的不斷研究，人們對高分子雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點、形成機(jī)制等有了深入的認(rèn)識，已經(jīng)從原來的總量控制發(fā)展到當(dāng)前的對指針性化合物進(jìn)行精準(zhǔn)控制。利用更加先進(jìn)的結(jié)構(gòu)分析手段，比如質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS）［36］、核磁共振技術(shù)（NMR）［37］、LC/MS柱切換技術(shù)［38］、二維高效液相色譜法（2D-HPLC）［39］等對高分子化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，更好的控制藥物中的高分子雜質(zhì)含量。

1徐麗清，黃文璐.剖析第三代頭孢菌素類抗菌藥物藥理作用及其臨床合理用藥情況［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2020，14（24）：243-244.