汪潔，楊彩鳳，吳亞凡，趙濤

（1.保定市第二中心醫(yī)院，河北 保定 072750；2.石家莊市第一醫(yī)院，河北 石家莊 050011）

子宮內(nèi)膜癌源于子宮內(nèi)膜上皮性惡性腫瘤，是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。目前子宮內(nèi)膜癌常規(guī)治療主要是以手術(shù)為主，輔助以放療、化療、激素替代治療等綜合療法[1]。早期患者經(jīng)手術(shù)治療后大多預后良好，死亡率較低，而癌癥晚期或復發(fā)轉(zhuǎn)移腫瘤患者，術(shù)后放療、化療或激素替代治療等方法只能暫時控制，且有一定的副作用，嚴重影響患者的生存質(zhì)量[2]。據(jù)統(tǒng)計，10年內(nèi)死于子宮內(nèi)膜癌的女性所占比例已經(jīng)增加到22%，因此迫切需要研究出新的治療方法及藥物在殺傷腫瘤細胞的同時降低對機體的毒副反應(yīng)，以提高患者的生存率及生存質(zhì)量[3]。雷公藤是衛(wèi)茅科雷公藤屬木質(zhì)藤本植物，具有祛風除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛、殺蟲解毒之功效[4]。雷公藤甲素是雷公藤主要的有效成分，對多種癌癥細胞具有抑制作用，其抗腫瘤作用主要與誘導細胞凋亡、干預細胞周期和抑制腫瘤新生血管形成等因素有關(guān)[5]。因此，本研究主要探討雷公藤甲素如何通過誘導子宮內(nèi)膜癌KLE細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

1 材料

1.1 細胞系 人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞，購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物與試劑 雷公藤甲素（批號：111567，純度≥98%，上海恒遠生物科技有限公司）；胎牛血清（批號：F2442）、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（批號：M2128）、DMEM-F12培養(yǎng)基（批號：D6421）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（批號：D2650）均購自美國Sigma公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium Iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1052，碧云天生物技術(shù)有限公司）；STAT3激活劑RO8191（批號：691868-88-9，美國MedChemeExpress）；兔抗人磷酸化組蛋白H2AX（phosphorylated histone H2AX，γH2AX）單克隆抗體（批號：ab229914）、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）單克隆抗體（批號：ab68153）、p-STAT3單克隆抗體（批號：ab267373）、程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-Ligand 1，PD-L1）單克隆抗體（批號：ab205921）、干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor 1，IRF-1）單克隆抗體（批號：ab243895）、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（批號：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 FACSCalibu流式細胞儀系統(tǒng)（美國BD公司）；Varioskan LUX多功能酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；DHP-9402恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DYCZ-20H電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；LSM900激光共聚焦顯微鏡（北京普瑞賽司儀器有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 取常規(guī)凍存復蘇的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞，接種于體積分數(shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 mg/mL鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用0.25%胰酶-EDTA進行消化傳代，選用處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 分組及藥物處理 用DMSO溶解雷公藤甲素和RO8191，配制成0.1 mmol/L的雷公藤甲素母液和RO8191母液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；實驗時用DMEM-F12培養(yǎng)基稀釋雷公藤甲素母液，使培養(yǎng)基中雷公藤甲素濃度為40 nmol/L，DMSO最終濃度＜0.1%。將對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞分為對照組（DMSO）、雷公藤甲素組（40 nmol/L雷公藤甲素）、激活劑（0.2 μmol/L RO8191）+雷公藤甲素（40 nmol/L雷公藤甲素）組、激活劑組（0.2 μmol/L RO8191）。

2.3 細胞核形態(tài)觀察 將用75%酒精浸泡過的蓋玻片放入6孔板中，取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞，經(jīng)胰酶消化后，按1×106個/mL密度接種于蓋玻片上，細胞貼壁后各組細胞分別更換為對應(yīng)的培養(yǎng)基，每孔終體積為2 mL，培養(yǎng)24 h后，去除培養(yǎng)基，預溫的PBS清洗6孔板，5 min×3次，用PBS配制4%多聚甲醛，滴加到蓋玻片上，室溫靜置10 min，PBS清洗蓋玻片5 min×3次。用Hoechst 33342室溫避光染色10 min，PBS漂洗，5 min×3次。在無菌載玻片中心位置滴加5 μL抗熒光衰減封片劑，蓋玻片烘干后倒扣于載玻片上。避光封片，晾干，4 ℃避光儲藏，觀察細胞核形態(tài)。

2.4 細胞抑制率檢測 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞，胰酶消化后，用DMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105個/mL接種于96孔板。細胞貼壁后，對照組、雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組、激活劑組更換相對應(yīng)的培養(yǎng)基，200μL/孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h。在各個時間段結(jié)束前4 h每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h，每孔加150 μL DMSO，震蕩8 min，用酶標儀檢測各孔490 nm處的光密度（OD）值，計算抑制率。抑制率=（OD對照值-OD用藥值）/OD對照值×100%。

2.5 細胞凋亡情況檢測 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞經(jīng)胰酶消化后，用DMEM-F12培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×106個/mL接種于6孔板，細胞貼壁后，各組細胞分別更換為對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，2 500 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），棄上清，加入4 ℃PBS漂洗，加入195 μL Binding buffer重懸細胞，加5 μL AnnexinV-FITC 4 ℃避光孵育15 min，加入10 μL PI染色5 min，在流式細胞儀中檢測細胞凋亡情況。

2.6 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞經(jīng)胰酶消化后按1×106個/mL接種于6孔板，細胞貼壁后分別更換相對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，用胰酶消化后收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），用4 ℃PBS漂洗2次后加入預冷的70%乙醇，4 ℃過夜固定，1 000 r/min離心5 min（離心半徑8 cm），PBS漂洗2次，用核糖核酸酶消化30 min，用PI染液避光染色30 min，使用流式細胞儀進行細胞周期檢測。

2.7 Western blotting法檢測γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達水平 取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞，按密度1×106個/mL接種于錐形瓶中，細胞貼壁后分別更換相對應(yīng)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔加入蛋白樣品40 μL，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST溶液洗膜3次，10min/次，用5%脫脂奶粉孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入1∶4 000稀釋的辣根過氧化物酶標記相應(yīng)二抗，搖床室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入適量ECL超敏發(fā)光液，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)顯影，計算目的蛋白和β-actin蛋白條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達水平。

2.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標準差”（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組KLE細胞的細胞核形態(tài)比較 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細胞的細胞核增大，數(shù)量增多；激活劑組、對照組KLE細胞的細胞核較小，數(shù)量較少。（見圖1）

圖1 各組KLE 細胞的細胞核形態(tài)（×400）

3.2 各組KLE細胞的細胞增殖抑制率比較 與雷公藤甲素組比較，激活劑+雷公藤甲素組KLE細胞24、48、72 h細胞增殖抑制率均明顯降低（P＜0.05），且雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細胞的細胞增殖抑制率均隨時間延長而增加（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組KLE 細胞的細胞增殖抑制率比較（，n=3）

3.3 各組KLE細胞的細胞凋亡情況 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細胞的細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），激活劑組KLE細胞的細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）；且雷公藤甲素組KLE細胞凋亡率高于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組KLE 細胞的細胞凋亡情況

圖4 各組KLE 細胞的細胞凋亡情況比較（，n=3）

3.4 各組KLE細胞的細胞周期比較 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組S期KLE細胞百分率均明顯升高（P＜0.05），G2/M期KLE細胞百分率均明顯降低（P＜0.05）；與對照組比較，激活劑組S期KLE細胞百分率明顯降低（P＜0.05），G2/M期KLE細胞百分率明顯升高（P＜0.05）；雷公藤甲素組S期KLE細胞百分率明顯高于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05），G2/M期KLE細胞百分率明顯低于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05）；4組G1期KLE細胞百分率組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖5）

圖5 各組KLE 細胞的細胞周期比較（，n=3）

3.5 各組KLE細胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達量比較 與對照組比較，雷公藤甲素組、激活劑+雷公藤甲素組KLE細胞γH2AX蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05）；與對照組比較，激活劑組KLE細胞γH2AX蛋白相對表達量均明顯降低（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達量均明顯升高（P＜0.05）；雷公藤甲素組KLE細胞γH2AX蛋白相對表達量明顯高于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05），p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達量明顯低于激活劑+雷公藤甲素組（P＜0.05）；4組KLE細胞STAT3蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見圖6～7）

圖6 各組KLE 細胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白表達Western blotting圖

圖7 各組KLE 細胞γH2AX、STAT3、p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達量比較（，n=3）

4 討論

子宮內(nèi)膜癌占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%，且發(fā)病率逐年遞增。早期患者術(shù)后生存率高，但晚期患者發(fā)生轉(zhuǎn)移或復發(fā)率高，預后較差。雷公藤甲素是從雷公藤中分離提取的一種環(huán)氧二萜類化合物，具有抗炎、抗生育及免疫調(diào)節(jié)等多種作用[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤甲素具有廣譜抗腫瘤作用，能夠抑制人胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌細胞的增殖[7-9]。雷公藤甲素抗腫瘤機制可能涉及多種途徑，如抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制核因子-κB、調(diào)控半胱天冬氨酸蛋白酶通路、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達、影響血管新生和阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移等[10]。

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主有序的死亡過程，是具有獨特細胞形態(tài)和生物化學變化的細胞死亡方式。細胞增殖與凋亡在正常情況下維持動態(tài)平衡，細胞增殖失控或凋亡受阻都可導致腫瘤發(fā)生。細胞周期是從上一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束的整個過程，一個完整的細胞周期包括有絲分裂期（M期）和分裂間期（G1期、S期、G2期），細胞周期阻滯可以減慢細胞增殖速度、誘導細胞凋亡[11]。陳志等[12]研究表明雷公藤甲素能抑制人結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖，通過促進p21的表達，抑制Cyclin D1使細胞周期阻滯于G0/G1期，并可通過線粒體途徑誘導HCT-116細胞凋亡。張雅莉等[13]研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能改善子宮頸癌患者術(shù)后免疫功能、降低機體炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細胞的增殖，對子宮頸癌具有一定的治療效果。李鑫等[14]研究發(fā)現(xiàn)低濃度雷公藤甲素聯(lián)合高三尖杉酯堿可以抑制KG-1α細胞增殖，并誘導其凋亡。徐俊偉等[15]發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能抑制食管癌Eca-9706細胞增殖并促進其凋亡，從而抑制食管癌的進展。本研究中雷公藤甲素組KLE細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡率高于對照組，S期細胞百分率升高，G2/M期細胞百分率降低，且雷公藤甲素組細胞核形態(tài)增大。DNA損傷是指在DNA復制過程中，DNA核苷酸序列發(fā)生改變，影響基因的復制和轉(zhuǎn)錄。γH2AX是雙鏈DNA損傷的重要生物標志物，DNA損傷后可募集并激活ATM，從而促進γH2AX磷酸化，以達到DNA損傷修復的作用[16]。本研究結(jié)果表明雷公藤甲素可上調(diào)KLE細胞中γH2AX表達，提示雷公藤甲素通過介導子宮內(nèi)膜癌KLE細胞DNA損傷，細胞周期阻滯停留在S期，進行DNA損傷修復，減慢細胞增殖，從而誘導細胞凋亡。

PD-1/PD-L1是形成腫瘤免疫耐受的關(guān)鍵分子。研究表明，PD-L1在多種實體瘤中高表達，幫助腫瘤細胞免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3在細胞增殖、存活及分化過程中發(fā)揮重要作用，是致癌信號傳導過程中重要的介質(zhì)，多種癌組織中均檢測到STAT3高表達。IRF-1是重要的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠被磷酸化的STAT3激活，調(diào)節(jié)PD-L1的表達，且IRF-1與PD-L1高表達密切相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，IRF-1通過使STAT3發(fā)生磷酸化而上調(diào)PD-L1的表達[18]。體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，STAT3抑制劑可通過在S期誘導細胞凋亡和細胞周期停滯而顯著抑制人胰腺癌細胞的增殖[19]。研究表明，STAT3在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中異常表達，且阻斷STAT3表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡[20]。依含等[21]研究發(fā)現(xiàn)STAT3可誘捕寡核苷酸抑制STAT3/IRF-1的信號通路，降低前列腺癌細胞PD-L1的表達。本研究中雷公藤甲素組p-STAT3、IRF-1、PD-L1蛋白相對表達量低于對照組、雷公藤甲素+激活劑組、激活劑組，提示雷公藤甲素通過抑制STAT3/PD-L1通路誘導人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用。

綜上所述，雷公藤甲素通過誘導子宮內(nèi)膜癌KLE細胞DNA損傷，促進細胞凋亡，發(fā)揮抑瘤作用，可能是通過調(diào)控STAT3/PD-L1通路發(fā)揮作用。