吳秀穩(wěn)，溫 然，王 娜，李 麗，王苑宇

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

巖白菜素(bergenin)屬于天然異香豆素，是巖白菜、落新婦與紫金牛等植物的主要化學(xué)成分[1]?，F(xiàn)有研究表明，巖白菜素具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[2-5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面，巖白菜素可以通過對腦內(nèi)氧化應(yīng)激的調(diào)控和谷胱甘肽含量的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗麻醉作用[6]，還可以通過抑制膽堿酯酶活性、抗氧化活性和降低p-tau蛋白水平減輕認(rèn)知功能障礙，改善阿爾茨海默癥[7]。血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是存在于脊椎動物的血液循環(huán)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的一層細(xì)胞屏障，克服BBB是物質(zhì)或藥物作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵。為了進一步支持和擴大巖白菜素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用，本研究以轉(zhuǎn)染了人多藥耐藥基因。(multidrug resistance gene 1，MDR1)的馬丁達比犬腎上皮(Matin-Darby canine kidney，MDCK)細(xì)胞構(gòu)建的單層模型研究巖白菜素的透BBB行為。MDR1，又稱P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，在BBB內(nèi)皮管腔側(cè)高表達，可選擇性地將基質(zhì)從腦脊液轉(zhuǎn)運至血液，限制血液中的物質(zhì)進入腦組織[8]。MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型能夠穩(wěn)定表達大量P-gp，細(xì)胞間緊密連接和酶系與腦的內(nèi)皮細(xì)胞相似，藥物在該模型上的透過性與體內(nèi)實驗結(jié)果有較大的相關(guān)性；此外，該模型培養(yǎng)周期短，7 d左右便可用于實驗；因此，該模型是研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物跨膜轉(zhuǎn)運及機制的理想模型[9-10]。本研究采用MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型模擬巖白菜素透BBB跨膜轉(zhuǎn)運，同時結(jié)合分子對接和P-gp抑制劑維拉帕米對巖白菜素跨膜轉(zhuǎn)運特性的影響分析，闡釋巖白菜素的透BBB轉(zhuǎn)運機制，為巖白菜素的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料MDCK-MDR1細(xì)胞(上海中亞生物基因研究所，代數(shù)為25～30代)；巖白菜素、阿替洛爾、鹽酸維拉帕米(上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號分別為H14J10Z79791、B30N6R6660、Y05J6C2)；咖啡因(中國計量科學(xué)研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號GBW(E)100063)；3402型12孔聚碳酯膜Transwell板(美國Corning Costar公司，批號22720039)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(美國Gibco公司，批號分別為C11995500BT、10099141C、25200056、C20012500BT)；青-鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司，批號20200306)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(美國Sigma公司，批號M2003)；BCA蛋白定量檢測試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、β-actin、電轉(zhuǎn)緩沖液、電泳緩沖液、ECL、顯影定影試劑(武漢Servicebio公司，批號分別為G2026、G2013、G2002、G2003、GB23301、GB23303、GB12001、G2017、G2018、G2014、G2019)；0.22 μm PVDF膜(美國Millipore公司，批號ISEQ00010)；Anti-P-gp抗體[EPR10364-57](英國Abcam公司，批號ab170904)；蛋白Marker(加拿大Fermentas公司，批號26616)；色譜級甲醇(美國TEDIA公司，批號20055202)；水為雙蒸水。AIR TECH超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；NU-5810E型CO2氣體培養(yǎng)箱(美國Nuaire公司)；TDZ4-WS低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；新華醫(yī)療LMQ.C型立式壓力蒸汽滅菌器(濟南辰卓醫(yī)療器械有限公司)；MERS00002細(xì)胞電阻儀(美國Millipore公司)；Sunrise酶標(biāo)儀(奧地利Tecan公司)；THZ-98C恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海雙旭電子有限公司)；1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的MDCK-MDR1細(xì)胞，于完全DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素)、37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率約80%時傳代，傳代比例為1 ∶3～1 ∶5，每2～3 d傳代1次。

1.2.2Western blot法驗證MDCK-MDR1細(xì)胞中P-gp穩(wěn)定高表達 選取常規(guī)培養(yǎng)的MDCK-MDR1細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染MDR1的MDCK細(xì)胞作為對照組)，接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，每組設(shè)3個平行，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞匯合率約90%時，收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用Western blot法檢測P-gp的表達[11]，如Fig 1，MDCK-MDR1細(xì)胞中P-gp的表達量明顯高于MDCK細(xì)胞中P-gp的表達量；采用ImageJ軟件進行條帶灰度分析，MDCK-MDR1細(xì)胞中P-gp的表達量大約是MDCK細(xì)胞的18倍；因此，P-gp在MDCK-MDR1細(xì)胞中穩(wěn)定高表達。

Fig 1 Expression levels of P-gp in MDCK cells

1.2.3MTT法測定巖白菜素的細(xì)胞毒性 制備密度為5×107個·L-1的MDCK-MDR1細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔加入200 μL；空白組只加入培養(yǎng)液。放入培養(yǎng)箱中孵育24 h后，吸凈培養(yǎng)液，藥物組依次加入用HBSS溶液配置的5、10、20、40 μmol·L-1的巖白菜素溶液，對照組和空白組加入空白HBSS溶液，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸凈藥液或HBSS溶液；加入5 g·L-1的MTT溶液，每孔20 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入酸化三聯(lián)液100 μL，過夜，在492 nm測定吸光度值(OD)值，計算細(xì)胞存活率/%=(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4分子對接 從PubChem化合物數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取巖白菜素、鹽酸維拉帕米的分子結(jié)構(gòu)，將結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Schr?dinger軟件，經(jīng)過加氫、結(jié)構(gòu)優(yōu)化、能量最小化處理后作為分子對接的配體分子。采用Swiss-Model在線服務(wù)器(https：//swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建P-gp靶點蛋白結(jié)構(gòu)，選擇ABCB1蛋白靶點(PDB ID：7A69)作為同源模板；采用Maestro11.9平臺，Schr?dinger Maestro軟件中的Protein Preparation Wizard處理蛋白結(jié)構(gòu)：去除結(jié)晶水，補加缺失的氫原子，修復(fù)缺失鍵信息，修補缺失肽段，并對蛋白進行能量最小化以及幾何結(jié)構(gòu)的優(yōu)化；采用Glide模塊對P-gp進行預(yù)處理、優(yōu)化，并利用OPLS3e力場進行約束最小化處理；化合物結(jié)構(gòu)按LigPre模塊的默認(rèn)設(shè)置制備；在Glide模塊中進行篩選時，導(dǎo)入制備好的受體，將原配體作為參照，在受體網(wǎng)格生成活性位點位置；最后通過SP方法進行分子對接及篩選[12]。分析配體和P-gp的作用模式，得到其與蛋白殘基作用的情況，并記錄化合物的結(jié)合能。

1.2.5巖白菜素體外跨膜轉(zhuǎn)運

1.2.5.1 MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型的建立與驗證 按照操作規(guī)程[10]，制備密度為8×107個·L-1的MDCK-MDR1細(xì)胞懸液，并接種于12孔Transwell的頂(Apical，AP)端，每孔加入500 μL，底(Basolateral，BL)端加入1 500 μL完全DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d，每天換液；采用跨膜電阻和陽性對照藥物(透過良好的咖啡因和透過不良的阿替洛爾)滲透性評價MDCK-MDR1單層模型的完整性和緊密性。

1.2.5.2 巖白菜素在MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型中的雙向轉(zhuǎn)運 按照“1.2.5.1”項下方法制備MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型，電阻驗證合格后，按照操作規(guī)程[10]，將AP端和BL端的培養(yǎng)液吸凈，用37 ℃的HBSS溶液洗滌兩端各兩次，之后補加HBSS(AP端500 μL，BL端1 500 μL)，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱(37 ℃，50 r·min-1)孵育30 min后，吸走HBSS溶液(留存，備用)，根據(jù)實驗設(shè)計，分別在Transwell小室兩端加入巖白菜素測試液和HBSS溶液(AP端500 μL，BL端1 500 μL)。陽性對照藥物(咖啡因和阿替洛爾)的轉(zhuǎn)運只AP端給藥。AP端給藥、BL端取樣分析為吸收轉(zhuǎn)運試驗；BL端給藥、AP端取樣分析為外流試驗。給藥后于恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育。給藥濃度為5、10、20、40 μmol·L-1，按設(shè)定的時間點(30、60、90、120 min)收集接收端溶液200 μL，取樣后以HBSS溶液補足體積。實驗設(shè)置4個平行孔。所取樣品于-20 ℃冰箱中保存。測定轉(zhuǎn)運實驗后細(xì)胞單層的電阻值，確保單層模型的完整性。

1.2.5.3 維拉帕米對巖白菜素雙向轉(zhuǎn)運的影響 按照“1.2.5.1”項下方法制備MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型，取合格的MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型進行雙向轉(zhuǎn)運實驗。巖白菜素與維拉帕米聯(lián)合給藥組：吸收轉(zhuǎn)運試驗時，向AP端加入含20 μmol·L-1巖白菜素和100 μmol·L-1維拉帕米的混合液，BL端加入含100 μmol·L-1維拉帕米的HBSS溶液；外流試驗時，向BL端加入含20 μmol·L-1巖白菜素和100 μmol·L-1維拉帕米的混合液，AP端加入含100 μmol·L-1維拉帕米的HBSS溶液。巖白菜素單獨給藥組：吸收轉(zhuǎn)運試驗時，向AP端加入20 μmol·L-1巖白菜素溶液，BL端加入HBSS溶液；外流試驗時，向BL端加入20 μmol·L-1巖白菜素溶液，AP端加入HBSS溶液。給藥后于恒溫振蕩培養(yǎng)箱上溫育90 min后，收集接收端的樣品。其余操作同“1.2.5.2”項。

1.2.6HPLC-UV法測定巖白菜素的含量

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；流動相為甲醇和0.1%乙酸水(30 ∶70)，流速設(shè)置為1 mL·min-1；檢測波長設(shè)置為270 nm；柱溫設(shè)置為30 ℃；樣品進樣量為20 μL。

1.2.6.2 樣品處理 取出冷凍保存的轉(zhuǎn)運樣品于室溫放置至融化，0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.2.6.3 專屬性試驗 在“1.2.6.1”項色譜條件下，空白基質(zhì)、對照品溶液以及樣品的色譜圖見Fig 2，巖白菜素的保留時間約為5.563 min。

1.2.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用“1.2.5.2”項下留存的第三次洗滌細(xì)胞的HBSS溶液配制巖白菜素對照品溶液，濃度依次為0.2、1、5、10、20、50 μmol·L-1，采用“1.2.6.1”項HPLC色譜條件分析測定，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品摩爾濃度(X/μmol·L-1)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得巖白菜素的回歸方程Y=20.962X+10.289(r=0.999 6)，線性范圍為0.2～50 μmol·L-1。

1.2.6.5 精密度、準(zhǔn)確度、回收率和穩(wěn)定性試驗 用HBSS溶液配制5、20、40 μmol·L-1的低、中、高3個濃度的巖白菜素質(zhì)控(QC)樣品，每種濃度平行制備3份。0.45 μm微孔濾膜過濾后，采用“1.2.6.1”項HPLC色譜條件分析。1 d內(nèi)連續(xù)測定3次，計算日內(nèi)精密度；1周內(nèi)測定3 d，計算日間精密度。通過回歸方程計算得到檢測濃度，與真實濃度比較得到準(zhǔn)確度?；厥章适峭ㄟ^比較加入HBSS溶液處理后樣品峰面積與等量巖白菜素直接加入甲醇中的峰面積比值來計算。將上述3個濃度的QC樣品放入-20 ℃冰箱中冷凍24 h，取出放置室溫自然解融，然后冷凍12～24 h，反復(fù)操作3次后，按“1.2.6.2”項處理方法處理，按“1.2.6.1”項HPLC色譜條件分析，考察受試化合物的凍融穩(wěn)定性。本試驗條件下，巖白菜素低、中、高3個濃度的日內(nèi)精密度RSD為1.65%、2.23%、1.29%，日間精密度RSD為3.64%、4.35%、4.07%；日內(nèi)準(zhǔn)確度為96.55%、98.43%、105.46%，日間準(zhǔn)確度為94.97%、97.13%、95.33%；回收率為83.98%、89.27%、88.68%；穩(wěn)定性為93.45%、97.31%、101.08%；符合生物樣品分析的方法學(xué)要求。

Fig 2 HPLC chromatograms of blank HBSS solution (A)，reference solution (B)，and samples

1.2.7數(shù)據(jù)處理 表觀滲透系數(shù)Papp=dQ/dt×1/A×1/C0計算[10]；式中，Papp單位為cm·s-1；Q是累積轉(zhuǎn)運量，單位為μmol；dQ/dt是速率，單位為μmol·s-1；C0是受試化合物在給藥端的初始濃度，單位為mmol·L-1；A是聚碳酯膜的表面積，單位為cm2。外排率ER=Papp BL→AP/Papp AP→BL計算。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果不同濃度的巖白菜素作用MDCK-MDR1細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均>95%(Fig 3)，因此，巖白菜素濃度為5～40 μmol·L-1，在4 h內(nèi)對MDCK-MDR1細(xì)胞無影響。

Fig 3 Effect of bergenin on viability

2.2 分子對接結(jié)果維拉帕米和巖白菜素分別與靶點蛋白P-gp分子對接，將對接后化合物與蛋白形成的復(fù)合物利用Pymol 2.1軟件進行可視化，得到化合物與蛋白的結(jié)合模式，根據(jù)結(jié)合模式可以清晰的看到化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基，結(jié)果見Fig 4。維拉帕米與P-gp結(jié)合的活性氨基酸殘基有TYR-310、GLN-347、PHE-983、MET-986、GLN-946等。維拉帕米具有很強的疏水性，能夠與蛋白活性位點PHE-983形成很強的疏水相互作用；另外，維拉帕米與TYR-310、GLN-347、GLN-946、MET-986氨基酸殘基形成4個氫鍵相互作用(Fig 4A)，且氫鍵距離較短(平均2.70?)，結(jié)合能力強。巖白菜素與P-gp結(jié)合的活性氨基酸殘基有GLN-347、GLU-875、GLN-990、ILE-868、GLN-946等。巖白菜素含有多個氫鍵供受體，能夠與P-gp活性位點形成很強的氫鍵相互作用，如與GLN-347、GLU-875、GLN-990、ILE-868、GLN-946氨基酸殘基形成5個氫鍵相互作用(Fig 4B)，且氫鍵距離較短(平均2.48?)，結(jié)合能力強。維拉帕米和巖白菜素與P-gp結(jié)合的結(jié)合能分別為-8.09 kcal·mol-1和-8.23 kcal·mol-1，因此P-gp-巖白菜素復(fù)合物的穩(wěn)定性強于P-gp-維拉帕米復(fù)合物?？傊瑤r白菜素與P-gp結(jié)合作用強且匹配度高，推測巖白菜素是一個潛在的P-gp底物。

Fig 4 Interaction between verapamil (A)，bergenin (B)，and P-gp

2.3 巖白菜素在MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型的中的雙向轉(zhuǎn)運本試驗條件下，MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型電阻值>300 Ω·cm2，完整性良好；在MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型透過良好的陽性對照咖啡因的Papp為(2.29±0.15)×10-5cm·s-1，透過差的陽性對照藥阿替洛爾的Papp為(6.11±0.86)×10-7cm·s-1，符合標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)定值[10]。

巖白菜素從AP端到BL端的Papp值(Papp AP→BL)在10-6數(shù)量級或接近10-6數(shù)量級(Tab 1)，介于透過良好的陽性對照咖啡因和透過差的陽性對照阿替洛爾的數(shù)量級之間，因此判斷巖白菜素為透BBB中等的化合物。巖白菜素轉(zhuǎn)運的ER值>2.0(Tab 1)，提示外流占優(yōu)勢，推測其跨膜轉(zhuǎn)運過程可能有外排蛋白的參與。在90 min內(nèi)，巖白菜素的轉(zhuǎn)運速率隨濃度增加而增大(Fig 5)，給藥濃度為20 μmol·L-1時，巖白菜素的轉(zhuǎn)運量在120 min內(nèi)隨時間增加而增加(Fig 6)，說明巖白菜素的跨膜轉(zhuǎn)運方式以濃度差驅(qū)動的被動擴散為主。

2.4 維拉帕米對巖白菜素雙向轉(zhuǎn)運的影響與巖白菜素單獨給藥比，巖白菜素與維拉帕米聯(lián)合給藥后巖白菜素的Papp AP→BL由1.07×10-6cm·s-1增大到3.47×10-6cm·s-1(P<0.01)，Papp BL→AP由4.63×10-6cm·s-1減小到3.42×10-6cm·s-1(P<

Fig 5 The transport rate of bergenin across MDCK-MDR1 cell monolayer as the function of concentration

Fig 6 The transport amount of bergenin across MDCK-MDR1

0.05)，ER值減小至0.98，接近于1(Tab 2)，表明巖白菜素是P-gp的底物。

3 討論

一般來說，Papp AP→BL>3×10-6cm·s-1的化合物能有效透過BBB，Papp AP→BL<1×10-6cm·s-1的化合物較難透過BBB[13]。在MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型中，巖白菜素(c=20 μmol·L-1)在90 min內(nèi)轉(zhuǎn)運的Papp AP→BL介于1×10-6cm·s-1和3×10-6cm·s-1之間，說明巖白菜素透BBB能力中等。根據(jù)ER值可初步判斷化合物的轉(zhuǎn)運機制：當(dāng)ER值為1時，轉(zhuǎn)運過程以被動擴散為主；當(dāng)ER值>1.5時，轉(zhuǎn)運過程可能存在外排蛋白參與；當(dāng)ER值<0.5時，轉(zhuǎn)運過程可能存在主動轉(zhuǎn)運蛋白參與[14]。巖白菜素(c=20 μmol·L-1)在90 min內(nèi)轉(zhuǎn)運的ER值為4.32，初步判斷其轉(zhuǎn)運過程有外排蛋白參與。在巖白菜素的轉(zhuǎn)運速率與濃度關(guān)系曲線中，外排方向的轉(zhuǎn)運速率增長率隨著濃度增加有減小的趨勢，可能是由于濃度增加，巖白菜素與外排蛋白的結(jié)合飽和所致；在巖白菜素的轉(zhuǎn)運量與時間關(guān)系曲線中，雖然隨著轉(zhuǎn)運時間增長膜兩端的濃度差越來越小，但吸收方向的轉(zhuǎn)運量增長率呈現(xiàn)增大趨勢，可能依舊是受巖白菜素與外排蛋白結(jié)合飽和的影響。

Tab 1 Papp values and ER values for bergenin across

Tab 2 Effects of verapamil on bidirectional transport

GroupPappAP→BL(×10-6cm·s-1)PappBL→AP(×10-6cm·s-1)ERBergenin1.07±0.274.63±0.604.32Bergenin+Verapamil3.47±0.64??3.42±0.40?0.98

分子對接是一種藥物虛擬篩選方法[12]，本研究通過分子對接發(fā)現(xiàn)維拉帕米和巖白菜素均通過分子間的氫鍵及疏水作用與P-gp結(jié)合，而巖白菜素與P-gp結(jié)合的活性氨基酸位點較多，因此巖白菜素與P-gp的結(jié)合能較大。維拉帕米本身是P-gp底物，屬于競爭性P-gp抑制劑[15]，當(dāng)巖白菜素和維拉帕米在MDCK-MDR1細(xì)胞單層模型中聯(lián)合使用時，P-gp的功能被維拉帕米抑制，巖白菜素跨膜轉(zhuǎn)運的Papp AP→BL明顯增大(P<0.01)，Papp BL→AP明顯減小(P<0.01)，ER值減小。因此，巖白菜素是P-gp底物，其透BBB跨膜轉(zhuǎn)運過程除被動擴散外，還有P-gp的參與。

能透過BBB是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，因此實現(xiàn)藥物透BBB轉(zhuǎn)運入腦成為藥物開發(fā)亟待解決的難題。近些年來，國內(nèi)外學(xué)者嘗試通過聯(lián)合用藥的方式實現(xiàn)體外治療效果優(yōu)但難透過BBB藥物的腦靶向給藥。例如，川芎和天麻素聯(lián)用，川芎通過抑制P-gp的表達來促進天麻素透BBB[16]；艾片和梔子聯(lián)用，艾片通過打開細(xì)胞緊密連接促進梔子透BBB[17]。本研究已證明巖白菜素是P-gp底物，即競爭性P-gp抑制劑，提示在促進藥物透BBB方面可對巖白菜素進行進一步的開發(fā)利用。