陳翠翠，梁艷輝

(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作江蘇中心，江蘇蘇州 215163)

毒死蜱(chlorpyrifos)是美國陶氏公司于1965年開始推廣使用的一種高效有機(jī)磷類殺蟲劑，主要用于糧食、蔬菜、水果及經(jīng)濟(jì)作物的害蟲防治。毒死蜱廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供保障，但其也存在缺點(diǎn)，即其對魚、蝦等水生生物毒性高，其中魚類LC50(96 h)為0.001 3 mg/L，水生甲殼類動物L(fēng)C50(96 h)為0.000 04 mg/L。此外，毒死蜱在自然環(huán)境中的半衰期較長，其在水中的降解半衰期為27～158 d，在土壤中的半衰期為10～120 d。毒死蜱也容易在農(nóng)作物和蔬菜中殘留，從而對人體造成損害，如人體急性毒死蜱中毒可引起頭痛、多汗、惡心、頭暈眼花、呼吸困難、心率減慢等癥狀，長期或反復(fù)接觸毒死蜱可引起麻木、刺痛等中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，高劑量可導(dǎo)致昏迷死亡。對毒死蜱越來越 多的研究表明，其對發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在慢性毒性作用。流行病學(xué)研究表明，毒死蜱的暴露與兒童注意多動缺陷障礙、記憶力減退、認(rèn)知障礙等相關(guān)，而且還影響胎兒的體格發(fā)育[1]。

由于毒死蜱對兒童的神經(jīng)毒性，為保護(hù)兒童健康，各國對毒死蜱實(shí)行了嚴(yán)格的禁限用措施。2000年6月，美國國家環(huán)境保護(hù)局宣布基于毒死蜱會危害到兒童的健康安全，禁止在美國家庭和庭院內(nèi)使用該殺蟲劑，并于2015年提議在美國全面禁用毒死蜱。2013年，我國農(nóng)業(yè)部第2032號公告指出，自2016年12月31日起，全面禁止毒死蜱在蔬菜上的使用[1]。

為了保證食品的安全性，許多國家規(guī)定了食物中各種農(nóng)藥殘留的限定量(MRL)，其中，我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中農(nóng)藥最大殘留限量》(GB 2763—2021)規(guī)定毒死蜱的最高殘留量為：谷物如稻谷和小麥0.5 mg/kg、玉米0.05 mg/kg、綠豆0.7 mg/kg、小麥粉0.1 mg/kg；油料和油脂如棉籽油0.05 mg/kg、大豆油0.03 mg/kg、玉米油0.2 mg/kg等；蔬菜如葉菜類0.02 mg/kg、芹菜和蘆筍0.05 mg/kg、食莢豌豆0.01 mg/kg等；水果如草莓0.3 mg/kg、葡萄和李子0.5 mg/kg、柑橘和蘋果、梨、山楂、枇杷等1 mg/kg、橙和柚2 mg/kg、桃和杏3 mg/kg等，相比之前的國家殘留標(biāo)準(zhǔn)均有進(jìn)一步的細(xì)化和殘留量的降低，即標(biāo)準(zhǔn)要求提高。

農(nóng)藥殘留分析是保證食品、環(huán)境安全的必要手段，其已成為世界各國農(nóng)藥管理中的必要環(huán)節(jié)。毒死蜱的環(huán)境毒性和健康危害以及我國對毒死蜱農(nóng)藥的限制使用，體現(xiàn)了對毒死蜱農(nóng)藥進(jìn)行殘留分析的必要性和重要性。

農(nóng)藥殘留檢測的傳統(tǒng)方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)等，具有使用范圍廣、分離效能高、靈敏度高、重復(fù)性好、選擇性強(qiáng)、可同時(shí)進(jìn)行多殘留分析且定性定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，已成為農(nóng)藥殘留檢測不可或缺的常規(guī)手段。但是，上述檢測方法所需要的儀器設(shè)備昂貴且龐大、笨重，樣品制備比較復(fù)雜、成本高，需要熟練專業(yè)技術(shù)人員操作，只能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行抽樣檢測，難以滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的要求[2]。

免疫分析技術(shù)是利用抗原(或半抗原)與抗體特異性結(jié)合而建立的高選擇性生物化學(xué)方法[3]，其作為一種操作簡單、快速、靈敏度高且經(jīng)濟(jì)的檢測技術(shù)，近年來在農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用飛速發(fā)展。相比較于儀器檢測，免疫分析在農(nóng)藥殘留檢測中，具有高度專一性和特異性、簡單快速、靈敏度高、性價(jià)比較佳等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速檢測[4]。本文著重闡述了毒死蜱殘留檢測中的免疫分析技術(shù)的專利概況，以期為毒死蜱殘留檢測的進(jìn)一步研發(fā)提供參考。

1 申請人、申請量、法律狀態(tài)分析

從申請年度和申請量來看，發(fā)明點(diǎn)涉及毒死蜱半抗原、抗體以及免疫分析技術(shù)的發(fā)明專利總量約150件，且申請主要集中在2014年以后，但每年的申請量也未超過20件?？梢?，研發(fā)熱度不是很高，當(dāng)然也有一部分新技術(shù)發(fā)表于期刊中，并未申請專利。其中，授權(quán)專利量為73件(其中目前授權(quán)有效專利量為53件，14件未繳年費(fèi)，6件有效期滿)、失效量(撤回和駁回)為48件，實(shí)審中專利量為28件、公開1件。雖然申請量不大，但是該領(lǐng)域的授權(quán)量較大，技術(shù)創(chuàng)新性高。

另外，在全球申請人中，國內(nèi)申請人約占88%，絕大多數(shù)為高校和科研院所，其中申請較多的申請人包括山東理工大學(xué)、浙江大學(xué)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、江南大學(xué)、江蘇大學(xué)、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、濟(jì)南大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究 所、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、合肥學(xué)院等。國內(nèi)的企業(yè)申請人主要有北京勤邦生物技術(shù)有限公司、江蘇美正生物科技有限公司、蘇州快捷康生物技術(shù)有限公司等，其申請量較少，多數(shù)僅有1件。國外申請人主要有印度阿米提大學(xué)(Amity University)、美國OHMICRON技術(shù)公司或美國陶氏益農(nóng)(Dow Elanco)等。由此可見，免疫分析技術(shù)以及其半抗原或抗體的制備技術(shù)主要掌握在各研究主體單位如高校和科研院所中，仍處于基礎(chǔ)研發(fā)階段，成熟的、商業(yè)化的免疫檢測試劑盒、試紙等產(chǎn)品較少。

2 毒死蜱的半抗原、人工抗原及抗體

毒死蜱屬于(C2H5O)2P(X)Y結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷類農(nóng)藥，其中，X代表O或者S，Y代表其他化學(xué)基團(tuán)或結(jié)構(gòu)。毒死蜱為非蛋白的小分子物質(zhì)(分子質(zhì)量＜1 000 Da)，本身沒有免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生特異性抗體，必須合成突出分子立體結(jié)構(gòu)特異性部位的半抗原，與大分子載體如蛋白質(zhì)等連接構(gòu)成有效人工抗原。建立毒死蜱免疫檢測方法的關(guān)鍵步驟是半抗原的設(shè)計(jì)與合成[5]。半抗原分子通常包括2部分：毒死蜱分子的部分或全部結(jié)構(gòu)與間隔臂。以此成功制備人工抗原及其特異性抗體。

2.1 特異性半抗原、人工抗原

浙江大學(xué)的朱國念等(CN1179966C)設(shè)計(jì)了一種毒死蜱人工半抗原，在毒死蜱分子的2個(gè)不同位點(diǎn)引入連接臂，合成毒死蜱的半抗原a或b；設(shè)計(jì)的最適半抗原制備的人工抗原為c或d (圖1)。以此人工抗原為免疫原制備獲得具有特異性識別的抗體，用于快速準(zhǔn)確分析食品、植物和環(huán)境土壤與水等樣品中毒死蜱的殘留量。這種方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，樣品前處理簡單，檢測費(fèi)用低，便于進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)控，最低檢測限為5 μg/L。

隨后，浙江大學(xué)(CN10680405A)還設(shè)計(jì)了另一種毒死蜱人工半抗原，將毒死蜱分子結(jié)構(gòu)中的-OC2H5通過化學(xué)合成改造成-NH(CH2)nCOOH，最大程度保留了毒死蜱的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又具有可調(diào)節(jié)長度的連接臂，同時(shí)還具有可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的-COOH，如圖1的化合物e。與CN1179966C相比，該法的最低檢測限大幅度降低，僅為0.4 μg/L，靈敏度明顯提高。

2.2 通用半抗原及通用抗體

有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留免疫檢測是針對一類農(nóng)藥同系物的共性結(jié)構(gòu)來設(shè)計(jì)和合成通用半抗原，從而制備得到對于特定的一類(或其中幾種)化合物都具有識別和檢測能力的通用結(jié)構(gòu)抗體，即具有廣譜特異性的抗體。此法能通過一次試驗(yàn)同時(shí)檢測多種農(nóng)藥殘留量，具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)。

目前采用免疫分析方法進(jìn)行多殘留檢測常有2種方法。一種是采用一類藥物的共有結(jié)構(gòu)作為免疫半抗原，獲得對同類農(nóng)藥具有特異性識別反應(yīng)的廣譜抗體。如英國農(nóng)漁業(yè)和食品部(Minister of Agriculture Fisheries and Food UK)(GB2293384B)設(shè)計(jì)了一類有機(jī)磷農(nóng)藥的通用型半抗原：(RO)2-P(S)-Z-(Y)-B-(D)，其中R為低級烷基，Z是O、S或-NH-，Y是間隔臂，優(yōu)選具有-(CH2)n結(jié)構(gòu)的間隔臂(n=4～6)，B是-CO-或-O-CO，D是H或能夠增強(qiáng)化合物與蛋白質(zhì)之間反應(yīng)的活化劑基團(tuán)。

韓國李元泰(LEE YONG-TAE)等(US7098341B2)設(shè)計(jì)了硫代磷酸酯類殺蟲劑的通用型半抗原的制備方法，如圖2所示。先將酚類化合物與二氯硫代磷酸O-甲基(乙基)酯反應(yīng)生成O-芳基氯硫代磷酸-O-甲基(乙基)酯，再將后者與氨基羧酸反應(yīng)，獲得用于有機(jī)磷硫代磷酸酯殺蟲劑免疫分析的半抗原。此法可用于甲基對硫磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、倍硫磷、殺螟硫磷等硫代磷酸酯類殺蟲劑的免疫分析。

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN101463086B)在二乙氧基硫代磷酸酯結(jié)構(gòu)的苯基的4位上引入丙烯酸活性手臂，制備免疫半抗原，半抗原偶聯(lián)BSA制備免疫原，免疫原免疫新西蘭大白兔制備得到所述有機(jī)磷農(nóng)藥多克隆抗體；所述抗體與作為酶聯(lián)免疫檢測中的包被原建立有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留ELISA檢測。所述免疫半抗原結(jié)構(gòu)為化合物f，免疫抗原為化合物g，包被原為化合物h (圖3)。該多克隆抗體具有廣譜特異性，能同時(shí)檢測二乙氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥12種以上，檢測限為0.000 2～3.393 8 μg/mL，可高通量快速篩選樣品，檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)方法，而且穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

另一種是采用將多個(gè)農(nóng)藥的半抗原偶聯(lián)到載體蛋白上制備成人工抗原，經(jīng)過動物免疫獲得對目標(biāo)農(nóng)藥有特異性識別的“寬譜特異性抗體”。如浙江大學(xué)(CN1908664B)設(shè)計(jì)了一種多簇抗原、寬譜特異性多克隆抗體，可用來同時(shí)檢測三唑磷、毒死蜱和克百威。該多克隆抗體能用于快速、簡便地同時(shí)檢測出樣品中多種相同或不同結(jié)構(gòu)類別的殘留小分子化合物，為免疫分析的抗原和抗體的制備提供了全新的思路。浙江工商大學(xué)(CN103044553A)將抗三唑磷的雜交瘤細(xì)胞株和抗毒死蜱的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞融合后篩選得到四體雜交瘤細(xì)胞，所述的四體雜交瘤細(xì)胞分泌抗三唑磷和毒死蜱的雙特異性單克隆抗體。該技術(shù)從抗體的結(jié)構(gòu)和特性入手，通過雜交-雜交瘤技術(shù)獲得能特異性識別2種同類藥物，甚至是結(jié)構(gòu)差異大的2類藥物的雙特異性單克隆抗體，與傳統(tǒng)的抗體快速檢測相比具有質(zhì)的飛躍，在探索藥物多殘留快速檢測技術(shù)新的研究領(lǐng)域和發(fā)展方向方面具有重要意義。

隨著人們對抗體基因結(jié)構(gòu)與功能的深入了解和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及多學(xué)科的交叉滲透，小分子有害物的特異性抗體制備正在朝著第3代抗體——基因工程抗體的方向發(fā)展。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN107056946A)基于第3代抗體——基因工程抗體技術(shù)提出了一種抗二乙氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥的Fab (即為抗原結(jié)合片段)抗體，用于檢測含有二乙氧基硫代磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥(DPPS)，如對硫磷、辛硫磷、毒死蜱等?？笵PPS的可溶性Fab抗體與抗原的結(jié)合可被游離的半抗原競爭性抑制，IC50為135.7 ng/mL，具有很好的抗原結(jié)合活性，比親本單克隆抗體(monoclonal antibody，Mab)的親和力提高1.4～2.8倍。該方法可實(shí)施大量樣品的快速檢測篩選，具有較高穩(wěn)定性和靈敏度，可通過基因工程技術(shù)體外表達(dá)得到，可在細(xì)菌中很經(jīng)濟(jì)地大規(guī)模生產(chǎn)，避免單克隆細(xì)胞陽性丟失風(fēng)險(xiǎn)。

3 毒死蜱的免疫分析技術(shù)

免疫分析技術(shù)是目前農(nóng)藥殘留檢測的有效方法之一，基于抗體的特異性識別作用，采用不同的標(biāo)記體系和檢測體系進(jìn)行信號的傳遞與檢測，賦予了免疫分析技術(shù)多樣化的特點(diǎn)，主要包括酶聯(lián)免疫分析、熒光免疫分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、SERS標(biāo)記免疫分析、免疫層析技術(shù)、免疫芯片、生物條形碼免疫分析法和免疫傳感器等，各方法在應(yīng)用中顯示出不同的分析特點(diǎn)。以下就發(fā)明專利中涉及毒死蜱的主要免疫分析技術(shù)進(jìn)行介紹。

3.1 酶聯(lián)免疫分析

酶聯(lián)免疫分析(ELISA)是經(jīng)典免疫分析技術(shù)，也是用于農(nóng)藥殘留檢測的最主要的免疫分析手段之一。ELISA的原理是將抗原或抗體吸附在固相載體表面，受檢樣品與固相載體表面的抗原或抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體。此時(shí)固相載體上的酶量與樣品中受檢物質(zhì)的量成一定比例。加入與酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與樣品中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其光密度(OD)值即可進(jìn)行定性或定量分析[6]。如北京勤邦生物技術(shù)有限公司(CN106324240B)采用間接競爭酶聯(lián)免疫法獲得了檢測毒死蜱的酶聯(lián)免疫試劑盒，其采用的毒死蜱半抗原是化合物i (圖4)。

為了減少ELISA檢測的缺點(diǎn)，如抗體的不穩(wěn)定性等，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN101241135B)采用毒死蜱抗體經(jīng)與抗體反應(yīng)被吸附于固相載體上的間接競爭酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)，制備了檢測農(nóng)藥毒死蜱殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒。所述酶聯(lián)免疫試劑盒采用第二抗體預(yù)包被酶標(biāo)板，節(jié)約了毒死蜱抗體的用量，而且克服了直接包被第一抗體不利于試劑盒長期保存的問題。同時(shí)，大幅度提高了試劑盒的檢測靈敏度與精密度，對毒死蜱線性檢測范圍為0.000 1～1 mg/L，最低檢測限為0.1 ng/mL，成本低，適用于農(nóng)藥毒死蜱殘留現(xiàn)場監(jiān)控的痕量分析。

3.2 熒光免疫分析

熒光免疫分析(FIA)技術(shù)是將不同的熒光素作為標(biāo)記物修飾在抗原、抗體上進(jìn)行分析檢測。如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN102206485A)提供了一種基于熒光偏振的有機(jī)磷農(nóng)藥均相多殘留免疫檢測方法，其采用的熒光素標(biāo)記物為化合物j、k、l (圖5)。所述有機(jī)磷農(nóng)藥均相多殘留免疫檢測方法具有方法簡便、樣品前處理簡單、一步反應(yīng)、無需洗滌分離，時(shí)間短，操作方便，可用微孔板進(jìn)行大量樣品檢測，可以同時(shí)測定20種有機(jī)磷農(nóng)藥，對毒死蜱的最低檢出限為211.45 ng/mL。

生物抗體由于其自身的易失活、不易保存等缺陷，實(shí)際應(yīng)用狀況不甚理想，為了解決生物抗體存在的問題，仿生抗體作為生物抗體的替代技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN108918859B)以多識別位點(diǎn)Fe3O4@SiO2@MIP為公共仿生抗體，用3種同一激發(fā)波長下的不同發(fā)射波長的量子點(diǎn)分別標(biāo)記甲基對硫磷、毒死蜱和敵百蟲3種有機(jī)磷農(nóng)藥半抗原，建立簡便、快速的仿生熒光免疫分析方法，可以同時(shí)檢測甲基對硫磷、毒死蜱和敵百蟲3種有機(jī)磷農(nóng)藥。這種仿生抗體可以克服生物抗體制備周期長、保存不當(dāng)易失活等問題，建立的仿生免疫吸附檢測技術(shù)，可用于檢測農(nóng)產(chǎn)品及食品中的農(nóng)藥殘留，是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

3.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLISA)是繼放射性免疫分析、酶免疫分析和熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項(xiàng)高敏感免疫分析技術(shù)。CLISA是將免疫分析的特異性與化學(xué)發(fā)光的高靈敏性相結(jié)合的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)采用發(fā)光劑或催化劑等化學(xué)發(fā)光試劑標(biāo)記抗原或抗體，在進(jìn)行免疫分析時(shí)，通過測定化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度來進(jìn)行待測物的定量分析。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN102053155A)以魯米諾-牛血清白蛋白-毒死蜱為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，構(gòu)建了一種檢測毒死蜱的均相化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(即為化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析)。該方法操作簡單、快速、成本低，在蛋白載體上標(biāo)記了化學(xué)發(fā)光劑魯米諾和目標(biāo)待測物質(zhì)毒死蜱，能夠放大響應(yīng)信號，增加了體系的靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)快速定性和定量的分析檢測。該方法對毒死蜱的檢測限為1.27 ng/mL。但該方法還存在一些缺陷，如檢測準(zhǔn)確性低、穩(wěn)定性不佳、無酶的信號放大作用。針對上述問題，該申請人 (CN112904003A)以辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶等為催化劑，以魯米諾(luminol)、吖啶酯或3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)為發(fā)光底物，構(gòu)建了一種酶促均相化學(xué)發(fā)光生物檢測方法，即為化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。該方法可用于樣品中毒死蜱的定量分析。該方法提高了檢測的準(zhǔn)確性、靈敏度，并且無需任何洗滌、分離操作，同時(shí)提高了檢測速度，降低了成本，適用性很廣。

雖然化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在有機(jī)磷農(nóng)殘檢測中取得了重大突破，但是生物識別敏感材料如抗體、酶、特異蛋白和DNA等生物分子性質(zhì)不穩(wěn)定，受環(huán)境影響大，價(jià)格極為昂貴。因此，使用生物敏感材料制作的化學(xué)/生物傳感器比較脆弱，使用壽命短，在苛刻條件下可能失去敏感特性，這嚴(yán)重阻礙了化學(xué)/生物傳感器的發(fā)展和普及。近來，使用分子印記材料代替生物材料作為識別元件的化學(xué)傳感器取得一些進(jìn)展。如皖西學(xué)院(CN102253201A)以功能化雙鍵修飾的SiO2為核，在其表面印記毒死蜱分子，然后洗脫毒死蜱，獲得毒死蜱分子印記空心粒子，構(gòu)建了基于表面印記空心粒子的化學(xué)發(fā)光免疫傳感器。毒死蜱分子印記空心粒子與傳統(tǒng)的分子印記聚合物相比較，具有較多的表面識別位點(diǎn)，較大的結(jié)合量和快速結(jié)合動力學(xué)。測定毒死蜱的檢測限為0.92 nmol/L，具有較高的靈敏度。

3.4 SERS標(biāo)記免疫分析

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是在拉普光譜的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種振動光譜技術(shù)，其靈敏度可降至單個(gè)分子水平，提供精細(xì)的分子指紋，可以直接識別目標(biāo)分析物。由于其具有操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥物分析、生物分析、環(huán)境污染物等領(lǐng)域的檢測。近年來，SERS在農(nóng)藥殘留的現(xiàn)場快速實(shí)時(shí)檢測方面凸顯了很大的應(yīng)用價(jià)值。

SERS標(biāo)記免疫分析技術(shù)是現(xiàn)代生物標(biāo)記技術(shù)與SERS光譜方法相結(jié)合而發(fā)展起來的一種新型SERS檢測方法。這種方法實(shí)現(xiàn)了生物分析技術(shù)、納米技術(shù)與SERS檢測技術(shù)3者的有機(jī)結(jié)合，其原理是基底上的固相抗體、標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合形成“固相抗體-待測抗原-標(biāo)記抗體”夾心復(fù)合物，利用金、銀等貴金屬納米粒子的增強(qiáng)作用建立基于免疫競爭的高靈敏檢測技術(shù)。

歐普圖斯(蘇州)光學(xué)納米科技有限公司(CN103698510A)將SERS光譜方法和免疫技術(shù)、納米標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，提供了一種可以識別有機(jī)磷類農(nóng)藥的方法，其原理如圖6所示。

SERS基底是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子特異性吸附的重要材料，研究適用于SERS基底材料以提高靈敏度和穩(wěn)定性尤為重要。東南大學(xué)(CN110376179B)將SERS技術(shù)和分子印跡納米纖維基底材料相結(jié)合，通過電紡技術(shù)制備了用于SERS檢測的分子印跡納米纖維增強(qiáng)基底膜，應(yīng)用于表面增強(qiáng)拉曼光譜實(shí)現(xiàn)了基底膜的特異性識別，并提高了基底膜的吸附容量，從而提高對有機(jī)磷農(nóng)藥如毒死蜱的檢測靈敏度。中國地質(zhì)大學(xué)(CN111208113B)基于PVDF-hfp/rGO-PEI柔性復(fù)合壓電薄膜負(fù)載納米Ag型自供能SERS基底是將表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)與柔性發(fā)電復(fù)合多孔薄膜相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了電壓促進(jìn)SERS基底的一體化。所得自供能SERS基底有較好的發(fā)電和保壓性能，利用電場來提高農(nóng)藥檢測的靈敏度，應(yīng)用更加廣泛，可以有效地檢測微量農(nóng)藥如毒死蜱的殘留。

近年來，SERS免疫標(biāo)記分析技術(shù)逐漸成為生物檢測方向的一個(gè)研究熱點(diǎn)，但是該技術(shù)還處于起步階段，存在不少亟需解決的問題。如在農(nóng)藥多殘留檢測中，需要進(jìn)一步發(fā)展SERS的多組分標(biāo)記技術(shù)，篩選合適的不同拉曼特征信號標(biāo)記分子，制備高靈敏多組分標(biāo)記探針，需要克服傳統(tǒng)免疫夾心法對小分子物質(zhì)結(jié)合活性位點(diǎn)少而導(dǎo)致檢測靈敏度低等技術(shù)缺陷。針對上述缺陷，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所(CN109187490B)以分子印跡技術(shù)與拉曼信號放大探針技術(shù)聯(lián)用，通過合成多種SERS信號標(biāo)記分子，采用共價(jià)鍵、靜電自組裝等重構(gòu)技術(shù)分別制備了基于金屬納米球/載體蛋白/目標(biāo)物構(gòu)成的3種不同信號標(biāo)記探針，實(shí)現(xiàn)了SERS信號放大檢測多組分農(nóng)藥的快速檢測。構(gòu)建的基于SERS技術(shù)的農(nóng)藥檢測試劑盒可以檢測莠去津、毒死蜱、三唑酮中的一種或多種，對毒死蜱的最低檢出限為0.10 μg/L，大大低于最高殘留限量值，拓展了農(nóng)藥多殘留快速檢測技術(shù)的新方法和新途徑。

3.5 免疫層析技術(shù)

免疫層析(IC)技術(shù)是20世紀(jì)80年代興起的一種檢測技術(shù)，它將抗原與抗體的特異性與層析技術(shù)集于一體，其原理簡圖如圖7所示。免疫層析技術(shù)相對于其他的檢測方法而言，更加適用于現(xiàn)場檢測和大批量樣本的篩選。

根據(jù)使用的標(biāo)記物不同可將免疫層析技術(shù)分為膠體金免疫技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)、量子點(diǎn)層析技術(shù)、熒光微球?qū)游黾夹g(shù)、時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)、磁珠免疫層析技術(shù)、適配體層析技術(shù)，統(tǒng)稱為免疫試紙條技術(shù)(IST)[4]。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院(CN104262486B)提出了檢測甲基毒死蜱的免疫層析試紙條，其以硝酸纖維素膜為檢測墊，以納米金標(biāo)記的保藏編號為CCTCC NO: C2014106的雜交瘤細(xì)胞株FQ-2G3分泌產(chǎn)生的單克隆抗體噴涂金標(biāo)墊。用該單克隆抗體研制的免疫層析試紙條可實(shí)現(xiàn)水、青菜和土壤中甲基毒死蜱的檢測，抗體穩(wěn)定性高，對檢測溶液中甲基毒死蜱含量的最低檢測限可達(dá)12.5 ng/mL。

根據(jù)使用的標(biāo)記物不同還可以制備出不同類型的免疫層析試紙條，如江蘇美正生物科技有限公司(CN106970217B)提供了一種指示劑可以為熒光染料或納米顆粒(如膠體金、量子點(diǎn)、磁納米顆粒、時(shí)間分辨熒光微球、彩色乳膠微球、熒光乳膠微球或上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒)的定量檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥(如毒死蜱等)的免疫層析方法，可以制備出不同類別的免疫層析試紙。該方法還使用電鰻乙酰膽堿酯酶代替有機(jī)磷農(nóng)藥抗體，制備的抗電鰻乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體對抗原具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，可以增強(qiáng)指示劑在檢測線位置的固定效果，檢測靈敏度高，檢測目標(biāo)物種類多，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速、現(xiàn)場高通量的檢測需求。

3.6 免疫芯片

免疫芯片，也稱抗體芯片或抗體微陣列，是最重要的蛋白質(zhì)芯片，也是一種全新概念的生物芯片檢測技術(shù)，它將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子芯片高密度集成原理相結(jié)合而建立，為高通量獲取生物 信息的檢測方法[7]。

抗體芯片技術(shù)主要采用微陣列點(diǎn)樣法將抗原抗體固定于玻片、硅膠板或多孔板上，使其高度集成，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)。該技術(shù)在農(nóng)藥殘留檢測中的應(yīng)用最為廣泛。相比于傳統(tǒng)免疫分析方法，免疫芯片的主要優(yōu)勢在于多組分同時(shí)分析和靈活便攜，且樣品用量少。如徐州工程學(xué)院(CN103439514B)構(gòu)建了基于微陣列檢測芯片的農(nóng)獸藥多殘留的檢測方法，將農(nóng)獸藥如毒死蜱的單克隆抗體制備捕獲單抗探針的微陣列芯片，以熒光分子Cy3標(biāo)記檢測抗原，然后進(jìn)行免疫反應(yīng)。該技術(shù)將酶聯(lián)免疫技術(shù)和生物芯片微點(diǎn)樣技術(shù)相結(jié)合，具有高通量，特異性強(qiáng)，檢測的可控性和可靠性遠(yuǎn)高于ELISA等其他常規(guī)檢測方法的特點(diǎn)。深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院(CN113281309B)將SPR技術(shù)和免疫芯片技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了SPR免疫芯片，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量檢測毒死蜱、多菌靈、莠去津3種農(nóng)藥的殘留濃度，檢測效率高，對毒死蜱的檢測限為5.14 μg/kg。

3.7 生物條形碼免疫分析

生物條形碼免疫分析法是將生物條形碼技術(shù)和免疫分析法相結(jié)合的一種具有超高靈敏度檢測的快速高通量篩選方法，是一類新型的核酸信號放大檢測技術(shù)，可用于核酸和蛋白質(zhì)的檢測，具有較高的靈敏度和特異性。該方法最早是由Mirkin等在2003年提出，2016年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所首次將生物條形碼技術(shù)結(jié)合免疫分析技術(shù)用于檢測小分子物質(zhì)——農(nóng)藥三唑磷，條形碼結(jié)合微孔板用于信號放大，定量限達(dá)1.96×10-2ng/mL[8]。隨后該申請人將生物條形碼免疫分析技術(shù)應(yīng)用到其他農(nóng)藥殘留檢測中，如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所(CN108931649A)將用熒光基團(tuán)標(biāo)記的生物條形碼、特異性單克隆抗體的金納米粒子相結(jié)合制備獲得了基于熒光寡核苷酸信號放大技術(shù)檢測有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留的免疫分析試劑盒。該申請人(CN113567658A)還將催化發(fā)夾自組裝技術(shù)與生物條形碼免疫分析相結(jié)合，構(gòu)建了一種基于發(fā)夾自組裝的有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留生物條形碼免疫檢測試劑盒，試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.01～50 ng/mL的線性范圍，三唑磷、對硫磷、毒死蜱LOD值(IC10)分別為0.012、0.0057、0.0074 ng/mL，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。

3.8 免疫傳感器

免疫傳感器是利用抗體能識別抗原并與抗原結(jié)合的功能生物傳感器。它利用固定化抗體(或抗原)膜與相應(yīng)的抗原(或抗體)的特異反應(yīng)，使生物敏感膜的電位發(fā)生變化。免疫傳感器的基本原理是免疫反應(yīng)，是利用抗體對相應(yīng)的抗原的識別和結(jié)合的雙重功能，將抗體或抗原與轉(zhuǎn)換器組合而成的檢測裝置[9～10]。

江蘇大學(xué)(CN103630587B)提供了一種快速、靈敏檢測有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱的光電化學(xué)免疫傳感器，將光電化學(xué)與酶傳感偶合技術(shù)相結(jié)合，以Cd0.5Zm0.5S-r-GO納米復(fù)合和乙酰膽堿酯酶修飾玻碳電極表面，基于Cd0.5Zm0.5S-r-GO良好的光電化學(xué)性能及生物相容性，構(gòu)建光電化學(xué)傳感界面應(yīng)用于有機(jī)磷農(nóng)藥的快速靈敏檢測。對毒死蜱的檢出限可達(dá)0.3 ng/mL。

電化學(xué)免疫傳感器是有機(jī)磷農(nóng)藥殘留專利申請中研究較多的技術(shù)，如CN10400715B、CN104034777B、CN105092850B、CN106370708B、CN106525949B、CN109100406B、CN110455898B、CN110487868B、CN110579522B、CN110632142B等。

山東理工大學(xué)(CN102608187B)采用殼聚糖、空殼納米金和L-半光氨酸對玻碳電極進(jìn)行修飾，用乙酰膽堿酯酶作為檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的分子識別元件，制備了電流型乙酰膽堿酶生物傳感器，具有檢測限低，范圍廣，精度高，適用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點(diǎn)。該 申請人(CN103115949B)還提供了另一種檢測農(nóng)藥殘留(如毒死蜱)的電流型乙酰膽堿酯酶生物傳感器，以多壁碳(MWNTs)-殼聚糖(CHIT)復(fù)合物和納米金膠(AuNPs)作為載體材料修飾玻碳電極(GCE)，并利用層層自組裝方法固定多層聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)和乙酰膽堿酯酶(AChE)，得到(PDDA- AChE)3/AuNPs/MWCNTs-CHIT/GCE傳感器。該傳感器提高了乙酰膽堿酯酶的固定量，提高了生物傳感器的穩(wěn)定性。

南昌大學(xué)(CN103424381B)提出了基于磁性分子印跡聚合物放大效應(yīng)構(gòu)建的表面等離子體共振(SPR)傳感器，與傳統(tǒng)的農(nóng)殘檢測技術(shù)相比，該技術(shù)對毒死蜱的檢測靈敏度高，選擇性好，具有很好的應(yīng)用前景。

揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院(CN109959684B)基于納米鈣鈦礦材料的酶-分子印跡雙識別型毒死蜱傳感器，即MIP/ITO/CH3NH3PbI3/CS/AChE雙識別型傳感器，對毒死蜱的選擇性好。

浙江大學(xué)(CN103558178B)構(gòu)建了太赫茲波譜結(jié)合生物傳感技術(shù)的毒死蜱檢測方法，利用已固定毒死蜱與未固定毒死蜱的檢測點(diǎn)的太赫茲時(shí)域波譜差異來檢測毒死蜱。因太赫茲波對大分子(DNA、蛋白質(zhì))敏感，故該方法準(zhǔn)確性高。該方法能夠同時(shí)檢測多點(diǎn)，檢測效率高，用時(shí)短，能滿足日益增長的快速檢測需求。

武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院(CN111007252A)構(gòu)建了一種基于生物正交反應(yīng)改變納米磁顆粒數(shù)量及狀態(tài)，進(jìn)而檢測農(nóng)藥殘留的生物傳感方法。該方法基于二苯基環(huán)辛炔與疊氮的級聯(lián)生物正交反應(yīng)，同時(shí)改變磁納米顆粒的數(shù)量和聚集狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)了磁納米顆粒數(shù)量和狀態(tài)的可控調(diào)節(jié)，2者有機(jī)結(jié)合進(jìn)行磁信號級聯(lián)放大，最終實(shí)現(xiàn)對樣品中農(nóng)藥殘留的高靈敏檢測。MNPs (磁納米顆粒)數(shù)量變化引起的信號放大與 MPs狀態(tài)變化引起的信號放大的有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)級聯(lián)信號放大，是該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)超靈敏檢測的核心技術(shù)。該檢測方法檢測速度快、成本低。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)(CN110470688B)構(gòu)建了一個(gè)對Cu2+具有很高親和力的納米鰲合篩，結(jié)合免疫磁富集和低場核磁共振技術(shù)，進(jìn)而構(gòu)建了一種納米螯合篩介導(dǎo)的低場核磁共振免疫傳感器，并且用于農(nóng)獸藥(如毒死蜱等)殘留和生物大分子的檢測。相比于傳統(tǒng)的低場核磁免疫傳感器，具有更高的靈敏度、穩(wěn)定性和特異性。

適配體的識別特性與抗體相似，又稱“化學(xué)抗體”。與抗體相比，適配體是由體外篩選和擴(kuò)增獲得，不需要免疫動物或培養(yǎng)細(xì)胞，具有極好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，很高的純度，可以避免產(chǎn)生批次間差異等優(yōu)勢。如山東理工大學(xué)(CN105301077A)提出了一種檢測毒死蜱的適配體傳感器，適配體傳感器的敏感界面組成包括介孔碳-殼聚糖復(fù)合物和二茂鐵-多壁碳復(fù)合物，進(jìn)而固定毒死蜱的適配體。此外，CN110186912B、CN110441369B等也構(gòu)建了毒死蜱的電化學(xué)適配體傳感器。

4 總結(jié)與展望

4.1 半抗原與抗體的設(shè)計(jì)

在免疫分析中，半抗原及抗體的制備是免疫分析方法的關(guān)鍵步驟，半抗原結(jié)構(gòu)特異性越強(qiáng)，抗體的靈敏度就越高，而有機(jī)磷通用型半抗原制備的抗體檢測譜廣。但是，分子結(jié)構(gòu)太小會導(dǎo)致抗原表位不能被機(jī)體有效識別，抗體靈敏度差，達(dá)不到殘留檢測的要求。因此，在農(nóng)藥多殘留檢測中，應(yīng)綜合通用半抗原與特異性半抗原的復(fù)合免疫，揚(yáng)長避短。

從抗體性質(zhì)和特性來看，多克隆抗體雖然能檢測多種農(nóng)藥，但是多克隆抗體不能再生，可能存在精確度不高、穩(wěn)定性差的缺陷。如上文所述，生物抗體自帶不穩(wěn)定缺陷，而且，農(nóng)藥抗體制作難度大，可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象。為了克服其缺陷，首先可以借助基因工程技術(shù)制備單克隆抗體，或者采用適配體技術(shù)，不僅能很經(jīng)濟(jì)地大批量生產(chǎn)，還不存在批次間差異。其次可以尋找能夠替代與毒死蜱結(jié)合的抗體，例如上述專利中提到的抗電鰻乙酰膽堿酯酶的單克隆抗體等。此外還可以通過設(shè)計(jì)非生物抗體-仿生抗體來解決生物抗體制備周期長、保存不當(dāng)易失活等問題。

4.2 免疫分析方法的存在問題與展望

免疫分析方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快速、高通量、檢測成本低、安全可靠等特點(diǎn)。該方法一般不需要貴重儀器，對使用人員技術(shù)要求不高，容易普及和推廣，尤其適合現(xiàn)場篩選和大量樣品的快速分析。但是不同的免疫分析技術(shù)也存在差異，如酶聯(lián)免疫分析法的樣品處理難、前處理步驟多，會存在較大的誤差，一般用于半定量或定性分析。免疫層析試紙條技術(shù)操作簡單快速，但準(zhǔn)確性和靈敏度偏低，也多用于半定量或定性分析。

免疫技術(shù)與熒光、電化學(xué)、基因工程、微陣列芯片、生物條形碼等新技術(shù)的結(jié)合，使得檢測靈敏度大大提高，多數(shù)免疫分析方法都可以達(dá)到半定量以及定量分析要求。電化學(xué)生物免疫傳感器、SPR傳感器等不需要標(biāo)記物即可進(jìn)行高靈敏的快速檢測，是目前研究的熱點(diǎn)。但是，免疫技術(shù)和新技術(shù)的結(jié)合方法中也存在一定的問題，如穩(wěn)定性差，成本高，樣品復(fù)雜的基質(zhì)干擾，發(fā)光劑的選擇和制備，免疫芯片的集成和制備，SPR傳感器的制備，大量抗體的消耗等問題，這也是新型免疫分析技術(shù)的研究動力。在追求更高的靈敏度和便攜性的同時(shí)，降低研究和制備成本、降低基質(zhì)抗干擾性，仍然是目前的發(fā)展要求。生物條形碼免疫分析是近幾年發(fā)展起來的農(nóng)藥殘留分析方法，免疫技術(shù)結(jié)合新型的核酸信號放大檢測技術(shù)，使得該方法具有超高靈敏度、特異性和快速高通量篩選的優(yōu)點(diǎn)，具有較好的發(fā)展前景。

在專利分析中發(fā)現(xiàn)，新型免疫分析技術(shù)一般集中在高?；蚩蒲性核?，這也間接說明了新型的免疫分析技術(shù)對專業(yè)技術(shù)要求較高，在農(nóng)藥殘留檢測的實(shí)際應(yīng)用中仍然較少，這也進(jìn)一步提示了新型免疫分析技術(shù)應(yīng)當(dāng)符合在實(shí)際應(yīng)用中的要求。因此，隨著免疫技術(shù)與其他技術(shù)的不斷結(jié)合和發(fā)展，檢測分析技術(shù)將會朝著綠色、快速、多殘留、高靈敏、低成本和商品化的方向發(fā)展，將會在農(nóng)藥殘留檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用。