蔣 菲，楊春江，汪葆玥，張 昕，張 瑩，王睿男，趙榮茂，吳佳俊，王傳彬，倪建強*

(1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618；2.北京納百生物科技有限公司，北京 100176)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種豬的急性、熱性高度接觸傳染性疾病[1-4],發(fā)病率和病死率可高達(dá)100%，是世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)法定報告的動物疫病之一，也是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《一、二、三類動物疫病病種名錄》中規(guī)定的一類動物疫病[2]。2018年8月，我國首次發(fā)生ASF疫情，截至2020年6月31日，全國31個省(市、自治區(qū))已報道191起疫情，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害。目前尚無有效的疫苗可用于ASF的免疫預(yù)防，快速早期診斷及對疫情的及時處置，是預(yù)防和控制該病的主要手段。

ASFV屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，為雙鏈DNA病毒，ASFV P72蛋白位于病毒衣殼表面，在ASFV感染中起重要作用[6-8]。研究表明，P72蛋白對自然感染具有免疫原性且其免疫原性較為穩(wěn)定，因此P72蛋白是血清學(xué)檢測的主要靶抗原[9-11]。ASFV感染48 h后，病原學(xué)檢測即可轉(zhuǎn)陽，但抗體轉(zhuǎn)陽時間較晚，通常在7～9 d后抗體檢測為陽性[12]。同時ASFV感染的特急性和急性病例致死時間較早，因此，對于感染的早期診斷以病原學(xué)檢測為主。目前，熒光PCR被廣泛應(yīng)用于ASFV檢測，但是，該檢測方法需要有熒光PCR儀以及一定的操作經(jīng)驗和實驗室條件，限制了該方法在基層實驗室或養(yǎng)殖場的使用。試紙條檢測技術(shù)不僅特異、靈敏、快速，而且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，是基層養(yǎng)殖場戶和獸醫(yī)機構(gòu)開展ASFV感染早期檢測最為方便的技術(shù)，基于該優(yōu)點以及ASFV臨床和基層實驗室檢測的實際需求，本研究建立了ASFV快速檢測試紙條方法，并對其進行了系統(tǒng)評價和初步應(yīng)用，以期為基層實驗室和養(yǎng)殖場ASFV現(xiàn)場檢測提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 蛋白、病毒、單克隆抗體和臨床樣品ASFV P72重組蛋白、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)由中國動物疫病預(yù)防控制中心實驗室保存，ASFV臨床樣品由中國動物疫病預(yù)防控制中心實驗室采集和保存?？笰SFV P72蛋白單克隆抗體7A7株和3E1株由北京納百生物科技有限公司制備保存。豬瘟活疫苗、豬偽狂犬疫苗購自武漢科前科生物股份有限公司、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗購自中牧實業(yè)股份有限公司。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備商品化羊抗鼠IgG購自杭州索萊爾博奧生物技術(shù)有限公司；乳膠微球購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜購自長沙博優(yōu)生物科技有限公司；玻璃纖維濾膜購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；PVC板購自北京金材生物科技有限公司；其他膠體金試紙條制備材料購自上海捷寧生物工程有限公司。ASF檢測試劑盒購自西班牙INGENASA(英吉納)公司。ASFV熒光PCR檢測試劑盒(獸藥生字010628858)購自北京森康生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

ABIStepone熒光定量PCR儀購自ABI公司；劃膜儀購自上海捷寧生物科技有限公司；切條機購自杭州峰航科技有限公司。

1.3 ASF抗原試紙條檢測方法的建立

1.3.1乳膠微球標(biāo)記單克隆抗體 以抗ASFV P72蛋白單克隆抗體7A7株作為捕獲抗體，使用乳膠球標(biāo)記法進行標(biāo)記。取100 μL粒徑為300 nm的乳膠微球按說明書進行活化，活化后加入15 μg單克隆抗體，快速混勻，室溫孵育3 h。加入100 μL封閉液(20 g/L的BSA，用終濃度為100 mmol/L乙醇胺溶液充分溶解)，室溫孵育1 h。17 000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 mL標(biāo)記緩沖液(50 mmol/L MES，pH 6.0)重懸微球，重復(fù)2次，去除未結(jié)合的抗體。最后加入1 mL標(biāo)記緩沖液重懸微球，即為抗體微球標(biāo)記復(fù)合物，4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2乳膠微球墊的制備 吸取1 mL 恢復(fù)至室溫的抗體微球標(biāo)記復(fù)合物溶液，用其均勻潤濕切好的玻璃纖維膜。室溫晾干12～16 h，置于裝有干燥劑的密封袋中，密封備用。

1.3.3檢測線和質(zhì)控線的包被 選擇抗ASFV P72蛋白單克隆抗體3E1株作為硝酸纖維素膜上檢測線的檢測抗體，并以羊抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線檢測抗體。用劃膜包被液(含1%蔗糖、0.05%疊氮鈉的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)分別將檢測線抗體及質(zhì)控線抗體稀釋至1.5，0.3 g/L，用劃膜儀以0.1 μL/mm噴涂于黏附在PVC板的硝酸纖維素膜上，40℃烘干16 h，室溫干燥備用。

1.3.4樣品墊的制備 將裁剪好的玻璃纖維樣品墊用樣品墊溶液(含0.5% 吐溫20的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)浸泡，室溫干燥16 h，備用。

1.3.5試紙條組裝及檢測方法 試紙條組裝方法如圖1所示，最底層為劃有檢測線(T線)及質(zhì)控線(C線)的NC膜。T線一側(cè)的NC膜，由下至上分別為貼有樣品墊1、乳膠微球墊、濾血膜、樣品墊2、樣品墊3。在C線一側(cè)，NC膜上方貼有吸水紙。將組裝好的檢測板修剪整齊，送入切條機，切成寬為(4.0 ± 0.1)mm的試紙條，挑取無劃痕、無污漬，邊緣整齊的試紙條，放入卡的底卡中，蓋上卡殼的蓋，送入壓蓋機中壓蓋，放入干燥劑后密封，2～8℃保存。

圖1 試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

檢測時，取1滴(約30 μL)樣品至加樣孔，隨后垂直緩慢滴入3滴樣本稀釋液，等待10～20 min判定結(jié)果，超過20 min后結(jié)果無效。若質(zhì)控線顯色，檢測線顯色，判定為陽性結(jié)果；若質(zhì)控線顯色，檢測線不顯色，則判定為陰性結(jié)果。

待檢樣品可為全血、脾臟或淋巴結(jié)樣本，其中全血樣品應(yīng)為抗凝血樣品，脾臟、淋巴結(jié)等組織采樣時需同時在3個不同位置分別取樣，稱取樣品約1 g，剪碎混勻，再取0.1 g進行研磨，加入1.5 mL生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min離心2 min，取上清液100 μL待檢。樣品的采集和處理應(yīng)遵循相應(yīng)的生物安全規(guī)定，處理好的血清、全血或研磨破碎后的組織樣品應(yīng)連同EP管在生物安全柜中60℃水浴滅活30 min。

1.4 試紙條的檢測、靈敏度、特異性和穩(wěn)定性試驗

1.4.1對照樣品的制備 陰性對照樣品的制備：將經(jīng)ASFV熒光PCR檢測試劑盒檢測為ASFV核酸陰性的仔豬，無菌采集抗凝血，加入0.01%硫柳汞，定量分裝，置-70℃以下保存。陽性對照樣品的制備：將ASFV P72重組蛋白用ASFV核酸陰性的仔豬抗凝血稀釋至0.25 g/L，定量分裝備用。

1.4.2靈敏度試驗 將陽性對照樣品用ASFV核酸陰性抗凝血作倍比稀釋，使其樣品中ASFV P72重組蛋白質(zhì)量濃度分別為25 000.00，2 500.00，250.00，25.00，2.50，0.25 μg/L。隨機選取本研究試制的3批試紙條進行檢測，確定該檢測方法靈敏度。

1.4.3特異性試驗 特異性樣品制備：使用豬瘟活疫苗、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬偽狂犬疫苗按照說明書稀釋后經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后無菌分裝，500 μL/管。PPV、PCV2細(xì)胞培養(yǎng)樣液樣品分別經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后無菌分裝，500 μL/管。隨機選取本研究試制的3批試紙條進行檢測，確定該檢測方法特異性。

1.4.4穩(wěn)定性試驗 隨機選取本研究試制的3批試紙條于2～8℃保存，在第0，3，6，9，12，15個月進行穩(wěn)定性試驗，檢測質(zhì)量濃度分別為250.00，25.00，2.50 μg/L的陽性對照樣品，陰性對照樣品及特異性試驗樣品。檢測樣品均在-20℃保存。

1.4.5臨床樣品的檢測 采用3個批次的ASFV抗原檢測試紙條對100份的臨床樣本(全血50份、脾臟25份、淋巴結(jié)25份)進行檢測，并同時進行熒光定量PCR檢測，比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 ASF抗原試紙條的制備和鑒定

2.1.1乳膠微球標(biāo)記捕獲抗體 選擇7A7株單克隆抗體作為捕獲抗體，3E1抗體作為檢測抗體用于建立ASF抗原試紙條檢測方法。標(biāo)記好的7A7單抗乳膠微球復(fù)合物為紅色的不溶性顆粒，可穩(wěn)定保存于4℃。

2.1.2試紙條的檢測結(jié)果驗證 將7A7單抗乳膠微球復(fù)合物包被在結(jié)合墊上，并將3E1單抗包被在硝酸纖維素薄膜表面作為檢測線(T線)。7A7單抗乳膠微球復(fù)合物與待測樣品中的抗原結(jié)合后，通過毛細(xì)作用在層析條上滲濾、移行并與膜上的3E1單抗反應(yīng)，從而以顏色直觀顯示檢測結(jié)果。該試紙條對ASFV陽性對照樣品和陰性對照樣品的檢測如圖2所示。結(jié)果表明，本研究制備的試紙條可特異性檢測ASFV陽性對照品，在質(zhì)控線和檢測線位置均出現(xiàn)清晰的條帶；而陰性對照品僅在質(zhì)控線(C線)位置有顯色。

A.陽性對照樣品；B.陰性對照樣品；C.質(zhì)控線；T.檢測線

2.2 特異性試驗本研究試制的3批試紙條可與ASFV P72重組蛋白反應(yīng)，均不與豬瘟病毒(CSFV)、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、PRV、PPV和PCV2產(chǎn)生交叉反應(yīng)(表1)，試紙條特異性良好。

表1 特異性試驗結(jié)果

2.3 靈敏度試驗結(jié)果表明,3批試紙條檢測結(jié)果一致，試紙條的靈敏度可達(dá)到2.50 μg/L(表2)。

表2 靈敏度試驗結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，ASFV P72重組蛋白質(zhì)量濃度為250.00，25.00，2.50 μg/L的陽性對照樣品檢測結(jié)果均為陽性，特異性對照樣品檢測結(jié)果均為陰性，表明試紙條存放15個月時仍能保持良好的靈敏度和特異性(表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品的檢測隨機抽取100份臨床樣品(50份全血、25份脾臟、25份淋巴結(jié))進行檢測，同時與商品化熒光PCR試劑盒進行比較。結(jié)果顯示，試紙條檢測出陽性全血樣品20份、脾臟樣品8份、淋巴結(jié)樣品7份，共35份陽性樣品，檢出率為35%(35/100)。熒光PCR試劑盒檢出陽性全血樣品30份、脾臟樣品10份、淋巴結(jié)樣品10份，檢出率為50%(50/100)，3種樣品使用2種方法進行檢測的符合率分別為80%，92%，88%，總體符合率為70%(表4，5，6)。

表4 試紙條和熒光PCR試劑盒方法檢測結(jié)果比較(全血樣品) 份

表5 試紙條和熒光PCR試劑盒方法檢測結(jié)果比較(脾臟樣品) 份

表6 試紙條和熒光PCR試劑盒方法檢測結(jié)果比較(淋巴結(jié)樣品) 份

3 討論

2020年以來，我國共發(fā)生29起ASF疫情，雖然疫情發(fā)生強度低于2018年，但2020年5月22日OIE通報印度首次發(fā)生ASF疫情，加之韓國、緬甸等周邊國家近2年ASF疫情仍在發(fā)展，我國ASF疫情防控工作仍然十分艱巨。有較多研究在滅活病毒疫苗、減毒活疫苗重組亞單位疫苗等方向進行了嘗試，但疫苗保護效果都不甚理想，疫苗研究仍存在一定難點[13]。由于目前尚無商品化的疫苗可用于ASF的預(yù)防，因此該病的防控措施仍以撲殺為主，力爭做到早發(fā)現(xiàn)、早控制。

本試驗建立的檢測試紙條方法為乳膠微球免疫層析法(DLIA)，使用染色的乳膠微球作為標(biāo)記物，通過乳膠微球的羧基與抗體等蛋白質(zhì)分子胺基共價結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)合物，其顆粒大小均一程度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定程度均優(yōu)于通過靜電吸附物理結(jié)合制備的膠體金抗體復(fù)合物。因此與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條相比，DLIA顯色更加穩(wěn)定，成本相對較低，試紙條保存時間更長[14]。目前，DLIA方法在PRV gE蛋白抗體檢測、牛日本血吸蟲病抗體檢測或動物源性食品萊克多巴胺、鹽酸克侖特羅、磺胺及喹諾酮等藥品檢測的領(lǐng)域均有應(yīng)用[15-18]。

本研究制備的ASFV-DLIA試紙條靈敏度可達(dá)到2.5 μg/L，且特異性良好，在2～8℃保存有效期長達(dá)15個月。對100份臨床樣品進行檢測，試紙條檢測出陽性樣品35份，檢出率為35%(35/100)。熒光PCR試劑盒檢出陽性樣品50份，檢出率為50%(50/100)，2種方法的符合率為85%，一致性良好。

雖然熒光PCR相較試紙條檢測技術(shù)的敏感性更高。但是，鑒于ASFV-DLIA試紙條不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，操作簡便，對檢測操作人員實驗技術(shù)要求低，同時檢測耗時短且檢測成本低等特點，該方法在臨床樣品快速檢測上具有一定優(yōu)勢，更適合現(xiàn)場和基層實驗室應(yīng)用，尤其在大規(guī)模養(yǎng)殖場、屠宰場、散養(yǎng)戶、畜牧獸醫(yī)站或運輸環(huán)節(jié)等ASF防控前端的推廣使用。