林敬軼，劉 雪，金小虎，石學(xué)穎，張?zhí)煊穑畹ね?，岳順利，周佳?/p>

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030)

近20年全球豬肉消費(fèi)呈現(xiàn)幾何式增長，迫切要求豬生產(chǎn)企業(yè)不斷提高生產(chǎn)效率來增加豬肉產(chǎn)量和提高豬肉品質(zhì)[1]。人工授精是提高豬群質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵技術(shù)。由于豬冷凍精液應(yīng)用效果不佳，所以生產(chǎn)中主要使用液態(tài)精液進(jìn)行人工授精[2]。雖然人們對(duì)液態(tài)保存技術(shù)已進(jìn)行過大量研究，但是仍存在保存時(shí)間短和受精能力低等問題。有研究表明，豬精液在液態(tài)保存過程中，會(huì)隨著保存天數(shù)的延長，精子內(nèi)的活性氧(ROS)會(huì)逐漸積累。過量的ROS會(huì)對(duì)精子的結(jié)構(gòu)及功能造成氧化損傷，進(jìn)而影響其精液的品質(zhì)和受精能力[3-4]。因此，人們一直在探索和研究用于豬精液液態(tài)保存的抗氧化劑[5-6]。

尿酸(UA)是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，也是人類精液中的主要抗氧化物質(zhì)。有研究報(bào)道，豬血清UA對(duì)烷氧基自由基的清除能力與人血清相同[7]。其在精液中的抗氧化活性接近維生素C的一半[8]。UA可以有效清除超氧陰離子自由基(·O2-)和羥自由基(·OH)等強(qiáng)氧化物，防止細(xì)胞受到氧化損傷[9]。有研究證明，人血液中UA含量與精子活力及形態(tài)呈正相關(guān)的趨勢。低尿酸血癥患者的精子畸形和精子不動(dòng)癥高發(fā)[10]。此外，UA還是魚精液中主要的抗氧化劑。在冷凍保存過程中添加一定濃度的UA可顯著提高魚精子的活力[11]。

雖然有報(bào)道UA對(duì)人和一些動(dòng)物精子有重要的抗氧化作用[11-13]，但UA在豬精液保存中的作用尚未見報(bào)道。本研究旨在精液保存液中添加UA，探究不同質(zhì)量濃度的UA對(duì)常溫保存下豬精子活力、質(zhì)膜完整性以及頂體完整性的影響。同時(shí)，還檢測了UA對(duì)豬精子抗氧化能力(總抗氧化能力(T-AOC)、ROS含量和脂質(zhì)過氧化水平)、線粒體膜電位以及體外受精能力的影響。為探究UA延長豬精液液態(tài)保存時(shí)間、UA的生物學(xué)功能和開發(fā)新型精液稀釋液提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑除特殊說明外，本研究所用試劑均購自Sigma-Aldrich公司。Modena稀釋液作為其豬精子保存液(pH6.9)，滲透壓為282 mOsm，成分包含25 g/LD-葡萄糖，2.25 g/L乙二胺四乙酸二鈉，6.9 g/L檸檬酸鈉，2 g/L檸檬酸，5.65 g/L三羥甲基氨基甲烷，0.05 g/L半胱氨酸，1 g/L碳酸氫鈉，3 g/L牛血清白蛋白，0.05 g/L青霉素鈉，0.05 g/L硫酸鏈霉素。

1.2 精液采集及保存豬精液采自6頭健康可育、年齡均為1.5～2.5歲的長白公豬。通過手握法進(jìn)行采精，每次采精至少間隔3 d。采集到的鮮精溫度需保持在35～37℃之間，且在45 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。其鮮精精子活力經(jīng)鏡檢在70%以上，且畸形率在15%以下可用于試驗(yàn)。采集的新鮮精液置于室內(nèi)避光處理2 h，使其溫度緩慢降至室溫。將鮮精置于15 mL離心管中，于室溫下1 000 r/min離心去除精漿，隨后用等溫的含有UA的Modena液稀釋，稀釋后UA的終質(zhì)量濃度為2.5，5.0，10.0，20.0 mg/L(其對(duì)照組不含UA，精子密度為3×107～5×107個(gè)/mL)。用1.8 mL凍存管分裝精液并置于17℃恒溫箱中避光保存，分別檢測0，1，3，5 d的精子質(zhì)量參數(shù)[14]。

1.3 精子活力檢測使用清華同方精子分析儀(MX 7.5)分析精子活力。檢測前取500 μL精液樣本混勻，于37℃恒溫箱中孵育20 min，取10 μL精子樣本于37℃預(yù)熱的精子計(jì)數(shù)池上，每次檢測6個(gè)視野，精子數(shù)量不少于200個(gè)。

1.4 精子質(zhì)膜完整性檢測采用低滲腫脹法對(duì)其精子質(zhì)膜完整性進(jìn)行檢測[15]。檢測前取50 μL樣本，加入到500 μL預(yù)熱低滲液中，37℃孵育50 min。取10 μL混合液于載玻片上，蓋片。在光鏡顯微鏡(×400)下觀察并統(tǒng)計(jì)頭部腫脹和彎尾精子數(shù)以及總精子數(shù)，每次計(jì)數(shù)不少于200個(gè)精子。

1.5 精子頂體完整性檢測采用異硫氰酸花生凝集素(FITC-PNA)對(duì)頂體進(jìn)行特異性染色[16]。檢測時(shí)，取30 μL精液均勻涂抹在載玻片上自然晾干，用無水甲醇固定10 min。隨后用30 μL FITC-PNA染液均勻涂片，于37℃避光孵育30 min。用PBS緩沖液輕輕沖洗載玻片2次，并置于黑暗中自然晾干。在倒置熒光顯微鏡(×400)下觀察精子頂體完整性，每次鏡檢精子數(shù)不少于200個(gè)精子，且全程避光。

1.6 精子T-AOC檢測采用T-AOC測定試劑盒對(duì)精子樣本的T-AOC進(jìn)行檢測。檢測前，取1 mL精子濃度為1×107個(gè)/mL的待測樣本進(jìn)行超聲破碎處理，4℃、3 000 r/min離心10 min，吸取上清液待用。根據(jù)試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑。使用分光光度計(jì)在波長為520 nm處測定各管的D值。

1.7 精子ROS含量檢測采用2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯(2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)染色檢測精子中ROS含量。檢測時(shí)，分別取對(duì)照組和試驗(yàn)組中1 mL的樣本(精子濃度為1×106個(gè)/mL)，室溫下2 000 r/min離心5 min，并用37℃預(yù)熱PBS緩沖液重懸精子樣本。加入DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育25 min，期間每隔5 min輕輕顛倒混勻。隨后用37℃預(yù)熱PBS緩沖液洗滌3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通過流式細(xì)胞儀對(duì)其進(jìn)行檢測分析，檢測細(xì)胞數(shù)為10 000個(gè)，設(shè)置其激發(fā)波長為488 nm，而發(fā)射波長為525 nm。

1.8 精子脂質(zhì)過氧化檢測過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛(MDA)可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。因此，可以通過檢測精子MDA含量進(jìn)而評(píng)估其脂質(zhì)過氧化水平。檢測前，取適量精子樣本進(jìn)行超聲破碎處理，4℃、3 000 r/min離心10 min，并吸取其上清液用于試驗(yàn)。隨后根據(jù)試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，使用分光光度計(jì)在波長為532 nm處測定其D值。

1.9 精子線粒體膜電位檢測采用線粒體膜電位檢測試劑盒對(duì)其精子進(jìn)行檢測。取1 mL精液樣本，室溫環(huán)境下2 000 r/min離心5 min。棄上清，用500 μL 37℃預(yù)熱PBS緩沖液重懸精子。取500 μL JC-1染色工作液與精液混合，反復(fù)顛倒并置于37℃恒溫箱中避光孵育25 min。4℃、600×g離心5 min，棄上清。用JC-1染色緩沖液(×1)清洗2次。在30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析，計(jì)算其線粒體膜電位高的精子百分比。

1.10 卵母細(xì)胞體外成熟將收集的卵巢置于37℃ 0.9%生理鹽水中盡快運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。隨后用含雙抗的37℃生理鹽水對(duì)卵巢緩慢清洗3次，抽取直徑為4～6 mm卵泡中的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體用于試驗(yàn)，置于預(yù)先37℃平衡4 h成熟液的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h。

1.11 體外受精檢測吸取1 mL精子，在室溫環(huán)境下，1 000 r/min離心5 min，并用PBS緩沖液洗滌2次后，將精子以106個(gè)/mL的密度在mTBM獲能液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)獲能1 h。每50 μL受精滴中放有30個(gè)成熟卵母細(xì)胞，并加入適量獲能精子，使其精子終質(zhì)量濃度為2.5×105個(gè)/mL。在受精6 h后，取部分卵母細(xì)胞于胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)中培養(yǎng)12 h，用乙酸/乙醇(1∶3)將其固定24 h，經(jīng)DPBS洗滌3次后，用Hoechst 33342染料染色10 min，在熒光顯微鏡鏡下觀察其受精情況(單精受精比例)。其余卵母細(xì)胞在受精6 h后，用預(yù)先平衡好的PZM-3洗滌3次，隨后轉(zhuǎn)入PZM-3滴中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后檢測并計(jì)算卵裂率，6 d后檢測并計(jì)算囊胚率。

2 結(jié)果

2.1 UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子活力的影響在保存第3天時(shí)，2.5，5.0，10.0 mg/L UA組的精子活力分別為(74.42±0.16)%，(78.69±0.73)%，(74.48±0.49)%，其活力均高于其對(duì)照組(70.73±0.48)%，且差異顯著(P<0.05)。而20.0 mg/L UA組的精子活力則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。保存第5天時(shí)，5.0 mg/L UA組的精子活力仍顯著高于其他組，比對(duì)照組提高了14.61%(表1)。

表1 不同質(zhì)量濃度的UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子活力的影響 %

2.2 UA對(duì)精子質(zhì)膜完整性的影響如表2所示，在保存第1天時(shí)，各組之間無顯著性差異(P>0.05)。從保存第3天開始，UA組與對(duì)照組之間出現(xiàn)差異。其中，5.0 mg/L UA組的精子質(zhì)膜完整性(68.45±0.29)%要高于其他組質(zhì)膜完整性。在保存第5天時(shí)，5.0 mg/L UA組的精子質(zhì)膜完整性(54.71±0.55)%要顯著高于對(duì)照組(47.23±0.31)%(P<0.05)。

表2 UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子質(zhì)膜完整性的影響 %

2.3 UA對(duì)精子頂體完整性的影響如表3所示，在保存第1天時(shí)，各組精子的頂體完整性并無顯著性差異(P>0.05)。在保存第3天時(shí)，5.0 mg/L UA組要顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在保存第5天時(shí)，2.5，5.0 mg/L UA組均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且5.0 mg/L UA組的效果最佳，而20.0 mg/L UA組的頂體完整性要顯著低于其他各組(P<0.05)。結(jié)果表明，在Modena保存液中添加5.0 mg/L的UA對(duì)豬精液液態(tài)保存效果最佳。因此，后續(xù)試驗(yàn)均采用5.0 mg/L UA試驗(yàn)。

表3 UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子頂體完整性的影響 %

2.4 UA對(duì)精子抗氧化能力的影響為探究UA對(duì)常溫保存過程中精子的抗氧化能力的影響，對(duì)其精子的T-AOC、ROS、MDA含量進(jìn)行檢測。結(jié)果如表4所示，在保存第1天時(shí)，加入5.0 mg/L UA對(duì)其精子的抗氧化能力的影響并不顯著(P>0.05)。隨著保存時(shí)間的延長，各組的T-AOC呈下降趨勢，而ROS和MDA含量呈升高趨勢。但在保存第3天后，對(duì)照組與試驗(yàn)組之間的抗氧化能力開始出現(xiàn)顯著性差異。其UA組的ROS和MDA含量要顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而其T-AOC要顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表4 UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子抗氧化能力的影響

2.5 UA對(duì)精子線粒體膜電位的影響隨著常溫保存時(shí)間的延長，其線粒體膜電位高的精子比例呈逐漸下降趨勢。如表5所示，在第1天時(shí)，對(duì)照組與5.0 mg/L UA組之間差異不顯著(P>0.05)。從第3天開始，兩者之間出現(xiàn)差異，UA組(68.55±0.60)%要顯著高于對(duì)照組(63.41±0.56)%。在第5天時(shí)，兩者差異擴(kuò)大，UA組的高膜電位精子比例要高于對(duì)照組約6.06%。

表5 UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子線粒體膜電位的影響

2.6 UA對(duì)豬精子體外受精能力的影響根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選用液態(tài)保存第5天的精子樣品進(jìn)行體外受精，檢測其體外受精能力及胚胎發(fā)育率。如表6所示，5.0 mg/L UA組的穿透率、受精率、卵裂率和囊胚率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

表6 UA對(duì)液態(tài)保存中豬精子體外受精及胚胎發(fā)育的影響

3 討論

隨著液態(tài)保存時(shí)間的延長，豬精液的質(zhì)量會(huì)逐漸降低,具體表現(xiàn)為豬精子的活力及運(yùn)動(dòng)能力降低，質(zhì)膜與頂體損傷，進(jìn)而導(dǎo)致其受精能力下降。本研究結(jié)果顯示，在稀釋液中添加一定質(zhì)量濃度的UA可有效抑制精子活力、質(zhì)膜及頂體完整性的下降。而其中添加5.0 mg/L的UA對(duì)其精子的活力和質(zhì)膜及頂體完整性要高于其他組。LAHNSTEINER等[17]研究表明，一定濃度的UA可以顯著提高其魚精子活力和精子膜完整性，與本研究結(jié)果相一致。此外，有研究表明，適量的UA可提高細(xì)胞抗氧化能力并通過調(diào)控B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)與Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的蛋白表達(dá)水平比值和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)蛋白表達(dá)水平進(jìn)而減少其細(xì)胞凋亡[18],說明UA可能會(huì)抑制保存過程中精子的凋亡，延長精子壽命。

本研究還發(fā)現(xiàn),高質(zhì)量濃度的UA(20.0 mg/L)會(huì)顯著降低其精子質(zhì)量。這與ZHANG等[19]報(bào)道的結(jié)果類似，較高質(zhì)量濃度的UA會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活率顯著降低。有研究表明，高質(zhì)量濃度UA會(huì)導(dǎo)致男性精液質(zhì)量顯著降低，其機(jī)制可能是高質(zhì)量濃度UA通過減弱內(nèi)皮一氧化氮合酶活性，導(dǎo)致一氧化氮水平減少，進(jìn)而影響其精子活力。也可能是高質(zhì)量濃度UA通過抑制肌酸激酶的活性，減少ATP的產(chǎn)生，從而降低精子功能[13,20-21]。

眾所周知，細(xì)胞內(nèi)ROS的形成主要是由細(xì)胞線粒體所產(chǎn)生的。在體外保存過程中，精子會(huì)由于自身代謝而產(chǎn)生ROS。生理范圍的ROS在精子獲能、過度活化、頂體反應(yīng)、受精能力的維持和精子-卵母細(xì)胞相互作用中起著至關(guān)重要的作用[22]。但大量的ROS堆積會(huì)引起精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化，使其通透性發(fā)生改變，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生破損，進(jìn)而導(dǎo)致精子結(jié)構(gòu)完整性被破壞和運(yùn)動(dòng)性能降低。而豬精子中多不飽和脂肪酸的濃度高于其他物種，因此豬精子更容易受到氧化損傷[23]，發(fā)生脂質(zhì)過氧化。而MDA則是氧化應(yīng)激脂質(zhì)過氧化過程中最普遍的脂質(zhì)過氧化副產(chǎn)物，常作為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物[24]。本研究結(jié)果表明，添加5.0 mg/L UA能夠有效降低其ROS水平，改善了精子的脂質(zhì)過氧化水平和T-AOC。YA等[25]的研究結(jié)果表明，適宜濃度的UA可有效減輕氧化損傷，降低MDA含量。也有大量報(bào)道顯示，一定質(zhì)量濃度的UA可有效提高其細(xì)胞的抗氧化能力，改善脂質(zhì)過氧化水平，降低ROS水平，進(jìn)而提高細(xì)胞的存活率[17,19，26-27]。因此，我們認(rèn)為UA通過這種提高其抗氧化能力以及減少脂質(zhì)過氧化水平，進(jìn)而改善在液態(tài)保存過程中維持其質(zhì)膜完整性，有利于精子活力的維持，延長保存時(shí)間。

線粒體是精子氧化磷酸化形成ATP的主要場所，在為精子運(yùn)動(dòng)提供ATP方面發(fā)揮著重要作用[28]。當(dāng)受到高濃度的ROS影響時(shí)，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致線粒體功能受到抑制，線粒體膜及DNA受到損傷，使線粒體膜發(fā)生去極化，從而導(dǎo)致線粒體活性、線粒體膜電位和精子活力的下降[29-32]。而低膜電位的動(dòng)物精子不易發(fā)生頂體反應(yīng)[33]。通過完整的線粒體膜電位來實(shí)現(xiàn)的線粒體功能似乎是維持精子中頂體酶活性、頂體反應(yīng)和染色質(zhì)完整性的先決條件。因此，線粒體膜電位是評(píng)價(jià)線粒體功能及精子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[34]。本研究結(jié)果表明，在保存過程中，添加UA可提高豬精子的線粒體膜電位。劉宣等[35]報(bào)道，UA能有效清除ROS，提高大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞線粒體膜電位，與本研究結(jié)果完全一致，其機(jī)制可能是UA通過清除過量ROS來維持線粒體的正常功能。

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)UA是否能夠提高保存精子的受精能力和胚胎發(fā)育能力，本試驗(yàn)通過體外受精檢測其液態(tài)保存精子的穿透率、受精率、卵裂率和囊胚率，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在保存液中加入5.0 mg/L UA能夠有效提高體外受精的精子穿透率、受精率、卵裂率及囊胚率。精子質(zhì)膜和頂體完整是精子存活和完成受精的重要條件。結(jié)合UA可提高精子質(zhì)量等結(jié)果，我們推測UA通過提高精子活力、質(zhì)膜和頂體完整性，從而提高其精子穿透率及體外受精能力。精子因含有高含量多不飽和脂肪酸，在受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致DNA損傷，誘導(dǎo)DNA片段化，進(jìn)而致使胚胎發(fā)育停滯[36-37]。有研究表明，UA能有效保護(hù)DNA免受損傷[38]。此外，HUGHES等[39]的研究結(jié)果顯示UA能有效減輕人精子在X-射線照射下所誘導(dǎo)的DNA損傷程度。因此，我們推測UA可能是通過清除ROS，減少精子DNA損傷，進(jìn)而提高胚胎發(fā)育能力。

綜上所述，在Modena保存液中添加一定質(zhì)量濃度的UA，可顯著提高精子的活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性。UA能夠有效清除活性氧，顯著提高其精子抗氧化能力，維持精子的線粒體活性，從而延長豬精子體外保存時(shí)間。此外，UA還可以有效提高保存精子的受精能力和胚胎發(fā)育能力。目前，UA對(duì)豬精子的影響仍處于初步研究階段，還可能存在其他調(diào)控機(jī)制需要深入研究。相關(guān)研究結(jié)果可為探究UA對(duì)雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞的影響及機(jī)制研究和新型豬精液稀釋液的研發(fā)提供理論參考。