趙子玉，張 鵬，王春光，張 鐵

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

抗生素不僅是人類抵抗病原微生物感染的最主要手段，還為畜禽健康養(yǎng)殖提供了重要保障。但是，抗生素的不規(guī)范應(yīng)用和濫用現(xiàn)象在全球范圍內(nèi)均有發(fā)生，從而導(dǎo)致了耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)和傳播[1]，因此需要尋找一種新的抗菌途徑，來應(yīng)對細(xì)菌的耐藥。目前大腸桿菌的耐藥已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥，并且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[2-4]。外排泵是引起大腸桿菌多重耐藥的生理基礎(chǔ)，有研究顯示大腸桿菌最主要的藥物外排泵為AcrAB-TolC外排泵[5]，該外排泵也是其家族中典型的外排系統(tǒng)[6]。

AcrAB-TolC外排泵是由內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白(AcrB)、外膜通道蛋白(To1C)和周質(zhì)膜融合蛋白(AcrA)3部分組成[7]，該外排泵由質(zhì)子驅(qū)動力提供能量，AcrB從細(xì)胞漿中直接捕獲底物，底物會與其胞質(zhì)中的發(fā)夾環(huán)相結(jié)合，從而導(dǎo)致AcrB整體構(gòu)象發(fā)生變化，通過AcrA的傳遞作用，TolC構(gòu)象也發(fā)生變化，并與AcrB連接在一起，導(dǎo)致通道開放。該系統(tǒng)中AcrB主要負(fù)責(zé)識別底物和傳導(dǎo)能量，如果AcrB的功能受到干擾或抑制，菌體內(nèi)的藥物濃度將會不斷升高，從而使得抗菌藥物恢復(fù)其殺菌效能。因此，AcrB是非常理想的外排泵抑制劑靶點。

目前，已被證實的大腸桿菌AcrB抑制劑有PAβN[8]、吡喃并吡啶化合物MBX2319(9)[9]、吡啶并咪唑類化合物D13-9001[10]等，這些抑制劑普遍存在毒性大的缺點，因此沒有進(jìn)行臨床應(yīng)用，而尋找安全有效的抑制劑有望解決大腸桿菌的多重耐藥。

本試驗首先通過虛擬篩選從中藥單體數(shù)據(jù)庫中篩選出合適的AcrB外排泵抑制劑—黃芩苷，并通過尼羅紅外排試驗、內(nèi)外膜影響試驗以及AcrB調(diào)控蛋白表達(dá)影響試驗闡明其主要抑制機(jī)制，為臨床防治多重耐藥菌提供一種外排泵抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料大腸桿菌E320(本實驗室測序并保存的多重耐藥大腸桿菌菌株，NCBI登錄號：CP020933)、大腸桿菌ATCC35218、ATCC25922均購自美國組織細(xì)胞收藏中心(ATCC)；頭孢噻肟鈉、磷霉素鈉、氯霉素購自北京酷來搏科技有限公司；黃芩苷(98%)、多黏菌素B、頭孢噻肟鈉購自上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；頭孢噻吩購自美侖生物技術(shù)有限公司；PAβN(≥99%)購自上海麥克林生化科技有限公司；羰基氰化物3-氯苯腙(CCCP)、尼羅紅購自北京索萊寶科技有限公司；RNAisoPlus、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa公司；DioC2(3)購自Abbkine生物技術(shù)有限公司；熒光分光光度計(JascoFP-750)(日本Jasco公司)；LyightCyler實時熒光定量PCR儀(羅氏公司)。

1.2 虛擬篩選及作用力分析試驗方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.3 聯(lián)合抑菌試驗在橫縱方向上分別以抗生素和中藥單體最小抑菌濃度(MIC)為初始濃度進(jìn)行倍比稀釋，具體試驗方法參照文獻(xiàn)[10]。分級抑菌濃度指數(shù)(FICI)[12]=MIC(中藥單體聯(lián)合用藥)/MIC(中藥單體單用)+MIC(抗生素聯(lián)合用藥)/MIC(抗生素單用)。判定標(biāo)準(zhǔn)：FICI≤0.5判定為協(xié)同作用，0.52判定為拮抗作用[13]。

1.4 尼羅紅外排試驗試驗分組見表1，具體方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

表1 尼羅紅外排試驗菌液處理分組

1.5 qPCR檢測黃芩苷與氯霉素對AcrB正負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)的影響試驗分組見表2，具體方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

表2 qPCR對正負(fù)調(diào)控基因表達(dá)影響試驗菌液分組

1.6 外膜滲透穩(wěn)定性試驗試驗分組見表3，具體方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

表3 外膜滲透性試驗菌液處理分組

1.7 內(nèi)膜質(zhì)子梯度影響試驗試驗分組見表4，具體方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

表4 內(nèi)膜質(zhì)子梯度影響試驗菌液分組

2 結(jié)果

2.1 AcrB外排泵抑制劑的虛擬篩選共篩選得到結(jié)合能低于-41.8 kJ/mol的中藥單體242個，部分結(jié)果見表5，考慮中藥單體成分的溶解性、應(yīng)用廣泛性、價格等因素，選取bacalin(黃芩苷)進(jìn)行后續(xù)的研究。

表5 Autodock Vina虛擬篩選的部分中藥成分評分結(jié)果

2.2 作用力分析通過DS可視化軟件可以看出黃芩苷與AcrB蛋白的Phe136形成氫鍵，與Phe628、Phe178、Val612、Ile277、Phe615、Pro326形成疏水作用力(圖1)。

A.黃芩苷與AcrB蛋白結(jié)合2D示意圖(綠色圓形.氫鍵的蛋白殘基；綠色虛線.氫鍵；黑色字體.鍵長；紫色、粉色圓形.疏水作用力殘基)；B.甘草酸與AcrB蛋白結(jié)合3D示意圖(粗棒.配體；細(xì)棒.蛋白殘基；綠色虛線.氫鍵；蛋白表面的顏色.疏水作用力；左下角圖例.作用力)

2.3 聯(lián)合抑菌試驗通過微量肉湯二倍稀釋法測得黃芩苷對大腸桿菌E320的MIC為2.5 g/L，磷霉素鈉、氯霉素、頭孢噻肟鈉對大腸桿菌E320的MIC分別為512，512，1 024 mg/L，磷霉素鈉、氯霉素、頭孢噻肟鈉對大腸桿菌ATCC25922的MIC分別為32，8，2 mg/L。黃芩苷與磷霉素鈉聯(lián)合抑菌時，兩者具有協(xié)同作用，黃芩苷使磷霉素鈉的MIC降為原來的1/8(64/512)；黃芩苷與氯霉素聯(lián)合抑菌時，兩者屬于協(xié)同作用，黃芩苷使氯霉素的MIC降為原來的1/4(128/512)；黃芩苷與頭孢噻肟鈉聯(lián)合抑菌時，兩者屬于協(xié)同作用，黃芩苷使頭孢噻肟鈉的MIC降為原來的1/4(256/1 024)(表6)。

表6 黃芩苷和抗生素聯(lián)合抑菌試驗

2.4 尼羅紅外排試驗如圖2所示，黃芩苷1.250 g/L組熒光強(qiáng)度(13.7 a.u.)高于0.625 g/L組(12.8 a.u.)并且都高于空白對照組(12.5 a.u.)，加入葡萄糖激活外排泵后，黃芩苷1.250 g/L組熒光強(qiáng)度(12.1 a.u.)下降明顯小于0.625 g/L組(10.7 a.u.)，且下降后熒光強(qiáng)度仍保持原有趨勢，即高于空白對照組(10.4 a.u.)。

1.空白對照組；2.黃芩苷0.625 g/L組；3.黃芩苷1.250 g/L組；4.25 mg/L PAβN組

2.5 實時熒光定量PCR檢測對外排泵基因表達(dá)的影響黃芩苷對AcrB調(diào)控基因表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示，黃芩苷可顯著誘導(dǎo)SoxS、SoxR的mRNA下調(diào)，氯霉素可顯著誘導(dǎo)RpoS的mRNA表達(dá)上調(diào)，黃芩苷聯(lián)合氯霉素使用可顯著促進(jìn)AcrR、Fis、MarR、MppA、Rob、RpoS、SdiA的mRNA的表達(dá)和抑制AcrB、SoxR的mRNA的表達(dá)(圖3)。

Control.空白對照組；Bai.黃芩苷組；CHL.氯霉素組；Bai+CHL.氯霉素和黃芩苷聯(lián)用組;同組內(nèi)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.6 外膜滲透穩(wěn)定性測定如圖4所示，黃芩苷0.625，1.250 g/L組與空白對照組在20 min內(nèi)熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，均無明顯上升。

1.空白對照組；2.陽性對照組；3.黃芩苷0.625 g/L組；4.黃芩苷1.250 g/L組

2.7 內(nèi)膜質(zhì)子梯度影響試驗如圖5所示，黃芩苷0.625 g/L組與空白對照組相比基本無變化，黃芩苷1.250 g/L組與空白對照組相比有輕微變化。

1.空白對照組；2.黃芩苷0.625 g/L組；3.黃芩苷1.250 g/L組

3 討論

3.1 蛋白對接分析目前已知的AcrB抑制劑有MBX2319[10]、D13-9001[13]、CCCP，MBX2319與AcrB疏水阱中5個丙氨酸殘基,其中4個(Phe136、Phe178、Phe610、Phe628)有很好的親和力[14]。本研究通過Autodock vina對黃芩苷與AcrB進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示其結(jié)合能為-44.7 kJ/mol，通過DS可視化軟件分析，主要作用位點為Phe136、Phe178、Phe615、Phe628、Val612、Ile277、Pro326，其主要作用力為氫鍵和疏水作用力。與目前已知的AcrB抑制劑的作用位點的主要重疊部分主要存在疏水阱中，由此疏水阱是AcrB蛋白抑制劑作用的主要位點。

3.2 聯(lián)合抑菌作用分析大腸桿菌AcrAB-TolC外排泵的底物廣泛，能夠?qū)Ζ聝?nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、磺胺類等多種抗生素藥物呈現(xiàn)高度耐藥[15]。本研究中黃芩苷與頭孢噻肟鈉、氯霉素和磷霉素鈉均呈現(xiàn)協(xié)同作用(FICI≤0.5)，其中氯霉素與頭孢噻肟鈉剛好屬于大腸桿菌AcrAB-TolC外排泵底物[16]，一定程度上說明黃芩苷降低多重耐藥菌E320的耐藥性是由于黃芩苷抑制AcrB的活性引起的。

3.3 尼羅紅外排試驗分析尼羅紅是一種親脂性染料，在水溶性介質(zhì)幾乎不發(fā)出熒光，可以忽略，但是在細(xì)胞膜的非極性環(huán)境中，其熒光水平會迅速升高，因此可以通過熒光強(qiáng)度的變化來判斷尼羅紅在細(xì)胞內(nèi)的濃度[17]。尼羅紅作為AcrAB-TolC外排泵的底物，在進(jìn)入到細(xì)菌體內(nèi)后，很快會被外排泵排出體外，但是在加入CCCP的菌液中，菌體的外排功能被抑制，菌體內(nèi)尼羅紅的含量受外排系統(tǒng)的影響很小，菌體內(nèi)尼羅紅的含量會明顯上升，葡萄糖可以恢復(fù)供能從而使外排泵恢復(fù)功能。PAβN是一種已知的作用于革蘭陰性菌(例如大腸桿菌AcrB)的主要多藥耐藥外排泵抑制劑[18]。試驗結(jié)果顯示黃芩苷高劑量組與PAβN(陽性對照)組均高于低劑量組，并且都高于空白對照組，并在加入葡萄糖后，除黃芩苷高劑量組與低劑量組高于陽性對照組外其他趨勢基本不變，表明黃芩苷能夠使大腸桿菌外排泵的活性受到抑制，從而阻止抗菌藥物的外排。

3.4 外排泵相關(guān)調(diào)控基因表達(dá)量分析目前AcrAB-TolC外排系統(tǒng)表達(dá)的影響已經(jīng)被廣泛研究，已知的調(diào)控蛋白包括AcrR、AcrS、Fis、MarA、MarR、MppA、RamA、Rob、RpoS、SdiA、SoxR、SoxS，其中正向調(diào)控蛋白有MarA、SoxS、RamA、Rob、SdiA，MarA調(diào)控蛋白是一種轉(zhuǎn)錄激活蛋白，由MarA基因編碼，其主要作用不僅可以加強(qiáng)AcrAB的啟動子和RNA聚合酶的親和力來完成對AcrAB表達(dá)的激活，還可以與TolC基因的啟動子結(jié)合，從而促進(jìn)AcrAB-TolC的表達(dá)[19]，YAMASAKI等[20]也通過對左氧氟沙星耐藥菌株中MarA的表達(dá)顯著增加證實了MarA的表達(dá)可以調(diào)控外排泵的表達(dá)。MarA還與MarR存在著反饋調(diào)節(jié)，MarA與MarRAB操縱子的上游區(qū)結(jié)合，促進(jìn)MarRAB的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，同時也促進(jìn)MarR基因的表達(dá)產(chǎn)生MarR調(diào)控蛋白，而MarR調(diào)控蛋白又會與MarRAB上游區(qū)以二聚體的形式結(jié)合，抑制MarRAB的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，調(diào)控MarA的水平。

SoxS調(diào)控蛋白由SoxS基因編碼，屬于一種全局調(diào)控蛋白，受SoxR的正向調(diào)節(jié)，可以正向調(diào)節(jié)超過20個與AcrAB-TolC相關(guān)基因的合成，促進(jìn)AcrAB、TolC的表達(dá)從而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[21]。SoxR基因編碼的SoxR調(diào)控蛋白也能夠激發(fā)SoxS基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)SoxS的表達(dá)，從而促進(jìn)AcrAB-TolC的表達(dá)。FERRARI等[22]也發(fā)現(xiàn)SoxS調(diào)控蛋白可以激活A(yù)crAB的表達(dá)。

Rob調(diào)控蛋白由Rob基因編碼，自身沒有活性，只有當(dāng)癸酸鹽、吡啶等化合物與其結(jié)合后，才能發(fā)揮作用，激活其靶基因的轉(zhuǎn)錄[23]。在大腸桿菌中，Rob調(diào)控蛋白過表達(dá)會增加多種抗生素的低水平耐藥性[24]。RamA調(diào)控蛋白由RamA基因編碼，過表達(dá)可能通過誘導(dǎo)AcrAB-TolC外排泵的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)多重耐藥性[25]。

主要負(fù)向調(diào)控蛋白有AcrR、AcrS、MarR、MppA、RpoS，AcrR調(diào)控蛋白由AcrR基因編碼，是AcrAB操縱子的阻遏蛋白，其會與AcrAB的啟動子以二聚體的形式相結(jié)合，來抑制AcrAB的表達(dá)[26]。任艷娜等[27]通過在大腸桿菌的AcrR片段插入序列也證實了AcrR的負(fù)調(diào)控作用。AcrS調(diào)控蛋白由AcrS基因編碼，HIRAKAWA等[28]發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌中，AcrS對AcrAB有抑制作用。MarR基因編碼的MarR調(diào)控蛋白能夠抑制正向調(diào)控蛋白MarA基因的轉(zhuǎn)錄激活[29]。MppA調(diào)控蛋白由MppA基因編碼，是AcrB的負(fù)調(diào)控蛋白，通過降低膜內(nèi)外質(zhì)子壓力差，從而導(dǎo)致AcrAB-TolC失去能量供應(yīng)[15]。RpoS調(diào)控蛋白由RpoS基因編碼，不僅能夠控制外排蛋白AcrAB的表達(dá)量，從而增加細(xì)菌的耐藥性[30]。

BLAIR等[31]發(fā)現(xiàn)單個或多個Acr基因失活時，所有RND外排泵基因的表達(dá)均增加，這種情況的出現(xiàn)可能是外排泵基因的表達(dá)存在著反饋調(diào)節(jié)。ZHANG等[32]發(fā)現(xiàn)調(diào)控蛋白RamA的表達(dá)在AcrA或AcrB單一缺失突變體中顯著增加，該發(fā)現(xiàn)也一定程度上證實了這一反饋機(jī)制存在。

黃芩苷聯(lián)合氯霉素導(dǎo)致AcrB的表達(dá)降低很可能是由于黃芩苷聯(lián)合氯霉素導(dǎo)致負(fù)向調(diào)控蛋白AcrR、MarR、MppA、RpoS的過表達(dá)引起的，黃芩苷聯(lián)合氯霉素導(dǎo)致Rob的過表達(dá)很可能是由于反饋機(jī)制的存在，與AcrB蛋白結(jié)合使正常的AcrB蛋白失活，從而促進(jìn)正向調(diào)控蛋白的表達(dá)。

3.5 外膜質(zhì)子濃度影響分析細(xì)胞外膜在革蘭陰性菌中發(fā)揮著滲透屏障的作用，有的化合物可以通過破壞其外膜滲透性導(dǎo)致抗生素透過外膜屏障，從而增加菌體中藥物濃度的累積。β-內(nèi)酰胺酶很容易將頭孢噻吩水解，可在490 nm處檢測到水解產(chǎn)物。ATCC35218是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶質(zhì)控菌株[33]，因此選用ATCC35218作為試驗菌株，當(dāng)頭孢噻吩進(jìn)入ATCC35218菌體內(nèi)后，會被菌體內(nèi)的β-內(nèi)酰胺酶分解，產(chǎn)物可被紫外分光光度計檢測到。多黏菌素是一種多肽類抗生素，會對細(xì)菌的細(xì)胞膜完整性進(jìn)行破壞，使細(xì)菌膜通透性發(fā)生變化，通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[34]，因此選擇多黏菌素作為陽性對照。頭孢噻吩水解產(chǎn)物的信號強(qiáng)度可以間接反映外膜滲透性的變化。本試驗中黃芩苷作用組與空白對照組均未見明顯變化，而多黏菌素(陽性對照)組可見明顯上升，說明黃芩苷抑制大腸桿菌耐藥性不是通過破壞細(xì)胞外膜質(zhì)子濃度來實現(xiàn)的。

3.6 內(nèi)膜質(zhì)子梯度影響分析DiOC2(3)是一種膜電位探針，可通過熒光信號來分析其細(xì)菌活力，其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)綠色熒光，由于高電位可引起染料分子發(fā)生自聚，使得染料的熒光往紅色波長出偏移，可以在熒光分光光度計中檢測到紅色熒光信號，當(dāng)加入CCCP后，膜電位會遭到破壞，染料的聚集也會隨之消失，導(dǎo)致紅色熒光信號降低。未經(jīng)藥物處理的大腸桿菌菌體由于具有完整的細(xì)胞膜和正常的膜電位，加入DiOC2(3)后會引起染料的聚集，其膜電位也隨之升高，加入葡萄糖以維持該勢能的存在，從而維持熒光強(qiáng)度的變化，最后通過加入CCCP破壞現(xiàn)有的質(zhì)子濃度梯度，細(xì)胞內(nèi)膜原有的質(zhì)子濃度被破壞，染料聚集消失，熒光強(qiáng)度也將下降到以前的水平。該試驗可以檢測一定濃度的中藥單體下大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜質(zhì)子濃度梯度的變化，通過觀察其變化，來確定中藥單體是否影響內(nèi)膜質(zhì)子濃度梯度。本試驗中黃芩苷的低劑量組與空白對照組基本無變化，表明質(zhì)量濃度為0.375 g/L的黃芩苷不會阻礙AcrB外排泵的能量來源。

黃芩苷與其他的AcrB外排泵抑制劑相比(如：PaβN、MBX2319和D13-9001等)具有天然、來源廣泛、價廉等優(yōu)勢，有望成為新的AcrB外排泵抑制劑，對治療耐藥菌引發(fā)的疾病具有重要意義。

黃芩苷可以抑制多重耐藥大腸桿菌E320耐藥性，其主要機(jī)制：黃芩苷結(jié)合大腸桿菌多藥外排泵轉(zhuǎn)運蛋白AcrB抑制其外排活性，可提高AcrB負(fù)調(diào)控蛋白AcrR、MarR、MppA、RpoS的表達(dá)使AcrB蛋白的表達(dá)降低且不影響細(xì)菌內(nèi)膜質(zhì)子梯度和外膜通透性，從而造成抗生素在菌體內(nèi)蓄積從而提高殺菌作用。