宋阿北，李瑞乾，繆西鵬，謝玉杰，高 瑞，許立華

(寧夏大學 農(nóng)學院，寧夏 銀川 750021)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是主要由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)所引起的一種人畜共患性慢性消耗性傳染病[1-2]。在MTB感染過程中，宿主免疫系統(tǒng)對感染的應答是首先通過啟動炎癥反應和吞噬作用殺滅并清除病原體[3]。如果感染不能終止并持續(xù)進行，促進細胞死亡的信號通路就會被激活，從而從宿主生物體中清除受感染的細胞[3]。最終感染的巨噬細胞可能面臨壞死、凋亡、自噬3種結(jié)局。在典型的壞死中，被侵襲的細胞腫脹、破裂，細胞內(nèi)容物溢出到周圍組織，引起急性炎癥[4]。壞死也可能是肉芽腫形成并導致空洞化、液化和組織損傷，使細菌數(shù)量的大量增加的主要原因[5]。而在細胞凋亡中，細胞按時間順序崩解其細胞骨架，解體核膜，碎裂DNA，并將細胞碎片包裝成小的“凋亡小泡”，而不會泄漏細胞內(nèi)容物[2]。雖然在微生物感染中細胞凋亡可能會部分導致組織損傷，但總的來說細胞凋亡的啟動可能對宿主有益，因為其促進了微生物的清除[6]。此外，巨噬細胞的凋亡還可以通過激活先天性和適應性免疫反應來限制分枝桿菌感染。比如包含細胞質(zhì)、細胞器或微生物的凋亡小體通過受體介導的吞噬作用被巨噬細胞和樹突狀細胞吞噬，然后降解并通過MHC Ⅱ類分子遞呈促進先天免疫和適應性免疫[7-8]。細胞凋亡在宿主抵御MTB感染過程中發(fā)揮著重要作用。

電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel,VDAC)是一類線粒體膜蛋白(共VDAC1、VDAC2和VDAC3 3種亞型)，主要位于線粒體外膜。研究表明，VDAC1可通過介導Cyt C、AIF、Smac/DIABLO和內(nèi)切酶G的釋放從而誘導細胞凋亡。有報道指出VDAC在病毒感染中的作用。JITOBAOM等[9]發(fā)現(xiàn)VDAC1對登革病毒(DENV)在哺乳動物細胞中的復制非常重要，通過siRNA下調(diào)VDAC1可顯著降低DENV感染率。LI等[10]發(fā)現(xiàn)了VDAC在傳染性法氏囊病(IBD)中的作用，IBD是一種由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的免疫抑制禽病。IBDV蛋白VP5與活化蛋白激酶C1受體(RACK1)和VDAC2相互作用形成復合物，抑制細胞凋亡，促進病毒復制[11]。除此之外，VDAC1還被確定為線粒體抗病毒信號蛋白MAVS的靶點，并參與MAVS介導的病毒感染引發(fā)的細胞凋亡[12]。目前被普遍認可的VDAC介導內(nèi)源性凋亡途徑主要有2個：VDAC1與VDAC1、Bax/Bak等Bcl-2促凋亡蛋白相互作用，發(fā)生同源寡聚或異源寡聚，在線粒體外膜上形成大的蛋白質(zhì)傳輸通道，導致Cyt C等促凋亡因子釋放到細胞基質(zhì)進而引起細胞凋亡[13-14]。

本研究通過VDAC1的小干擾RNA(siRNA-VDAC1)和靶向VDAC1抑制劑VBIT-4分別處理RAW264.7細胞，并結(jié)合BCG感染，通過檢測各處理組細胞凋亡相關(guān)指標的變化，以期揭示VDAC1是否參與BCG感染小鼠巨噬細胞凋亡及其調(diào)控作用機制，為結(jié)核病的預防和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑全蛋白提取試劑盒、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基公司；BCA定量試劑盒、Cell ROX、eBioscienceTMJC-1Mitochondrial Membrane Potential Dye購自Invitrogen公司；4%多聚甲醛、Tritonx-100、一抗稀釋液購自北京索萊寶科技有限公司；HRP化學發(fā)光試劑盒購自美國BD公司；兔抗鼠VDAC1一抗購自美國Abcam公司和生工生物工程(上海)股份有限公司；LipofectanmineTMRNAiM-AX Transfection Reagent購自美國ZETA-LIFE公司；兔抗鼠PARP、Caspase-3一抗購自武漢愛博泰克科技有限公司；兔抗鼠Caspase-9一抗購自美國CST公司；兔抗鼠Cyt C一抗、辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Proteintech公司。

1.2 菌株與細胞系牛分枝桿菌減毒株(BCG)購自成都生物制品研究所有限公司，采用常規(guī)方法進行培養(yǎng)，每月傳代1次。小鼠肺泡巨噬細胞(RAW264.7)購自中科院上海細胞研究所，以胎牛血清(FBS)∶高糖DMEM為1∶9的比例配制培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d 傳代1次。

1.3 引物設(shè)計與合成使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計相關(guān)PCR引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物信息

1.4 小干擾RNA的構(gòu)建根據(jù)VDAC mRNA全長序列，在VDAC mRNA不同位點處設(shè)計并合成了3段小干擾序列。小干擾RNA序列見表2。

表2 小干擾RNA序列

1.5 小干擾RNA的轉(zhuǎn)染將RAW264.7細胞在感染前12 h鋪于6孔板中進行培養(yǎng)(1×106個/孔)，設(shè)置Control組、BCG組、干擾組和干擾+BCG組，轉(zhuǎn)染過程參照LipofectanmineTMRNAiM-AX Transfection Reagent說明書進行。轉(zhuǎn)染24 h后用BCG感染(MOI=1∶10)組和干擾+BCG組。

1.6 熒光定量PCR檢測參照北京天根生化科技有限公司總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA；參照全式金TransStart One-Stept cDNASynthesis SuperMix說明書進行反轉(zhuǎn)錄；反應結(jié)束后參照全式金TransStart Tip Green qPCR SuperMix說明書，利用合成的cDNA配制熒光定量PCR反應體系，進行熒光定量PCR反應。

1.7 噻唑藍比色法(MTT)檢測RAW264.7細胞存活率將RAW264.7細胞提前12 h接種于96孔板(5×103個/孔)，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。然后用BCG感染細胞，并設(shè)置(6,12,18,24 h)時間梯度，每個處理組設(shè)置4個復孔，每孔加入50 μL 1× MTT溶液，37℃孵育4 h后加入100 μL DMSO,37℃避光振蕩培養(yǎng)15 min后使用酶標儀測D490值，按照公式細胞存活率%=[(處理組D490值-空白組D490值)/(對照組D490值-空白組D490值)]×100%，計算細胞存活率。試驗重復3次，取平均值。

1.8 流式細胞檢測細胞凋亡率具體步驟參照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行。

1.9 流式細胞檢測ROS積累水平具體步驟參照活性氧(ROS)檢測試劑盒說明書進行。

1.10 流式細胞檢測線粒體膜電位具體步驟參照eBioscienceTMJC-1 Mitochondrial Membrane Potential Dye說明書進行。

1.11 線粒體胞漿蛋白的提取具體步驟參照細胞線粒體分離試劑盒說明書進行。

1.12 Western blot檢測RAW264.7細胞以1×106個/孔接種于6孔板培養(yǎng)皿中，按試驗設(shè)計處理后，使用南京凱基全蛋白提取試劑盒按說明書操作提取蛋白，使用BCA法試劑盒按說明書操作檢測蛋白濃度后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后采用Western blot分別測定Caspase-3(一抗稀釋液稀釋1∶1 000)、Caspase-9(一抗稀釋液稀釋1∶1 000)、PARP(一抗稀釋液稀釋1∶1 000)、VDAC1(一抗稀釋液稀釋1∶1 000)以及β-actin(一抗稀釋液稀釋1∶1 000)蛋白表達水平。

1.13 免疫熒光染色檢測Caspase-3剪切體表達情況取12孔板，每孔提前置入20 mm細胞爬片，每孔接入5×104個RAW264.7細胞，于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)12 h。按試驗組設(shè)計處理結(jié)束后，吸棄上清，PBS潤洗1次，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，常溫固定20 min。吸棄多聚甲醛，每孔加入500 μL PBS清洗3次，每次5 min。每孔加入500 μL 3% TritonX-100(PBS稀釋)，常溫通透20 min。吸棄TritonX-100，每孔加入500 μL PBS清洗3次，每次5 min。每孔加入500 μL 3% BSA(PBS)稀釋常溫封閉60 min，結(jié)束后吸棄，每孔加入Caspase-3抗體(兔抗鼠，3% BSA稀釋，1∶500)500 μL,37℃孵育過夜。吸棄一抗，每孔用500 μL PBS清洗3次，每次5 min。加入熒光二抗(羊抗兔，PBS稀釋1∶1 000)500 μL，避光常溫孵育2 h。孵育結(jié)束，吸棄熒光二抗，每孔加入500 μL PBS避光清洗3次，每次5 min。用含DAPI的封片劑封片，置于暗盒中儲存，盡快使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 BCG感染對RAW264.7細胞VDAC1表達的影響依據(jù)BCG感染不同時間設(shè)置處理組，檢測各組VDAC1 mRNA及蛋白表達水平。各時間段BCG感染處理后RAW264.7細胞的VDAC1 mRNA及蛋白表達量均高于對照組，并在感染12 h后比較顯著(P<0.001)。結(jié)果表明，BCG感染可誘導RAW264.7細胞內(nèi)VDAC1表達上調(diào)(圖1)。

2.2 小干擾RNA的驗證根據(jù)VDAC1 mRNA全長序列，通過生物信息學分析設(shè)計針對不同位點的小干擾RNA，并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將si-VDAC1轉(zhuǎn)染至小鼠巨噬細胞RAW264.7中，轉(zhuǎn)染24 h時通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果(圖2A～C)。隨后用Real-time PCR以及Western blot驗證小干擾RNA敲減效率。3個不同干擾位點的小干擾RNA中，si-VDAC1-1040 會使mRNA和蛋白的表達下調(diào)較為顯著(P<0.001)(圖2D～F)。因此，后續(xù)試驗均采用si-VDAC1-1040，轉(zhuǎn)染時間選擇24 h。

A.暗場下si-VDAC1轉(zhuǎn)染效果圖；B.明場下si-VDAC1轉(zhuǎn)染效果圖；C.Merge后si-VDAC1轉(zhuǎn)染效果圖；D.3條si-VDAC1 mRNA水平驗證；E、F.3條si-VDAC1 蛋白水平驗證

2.3 VDAC1對BCG感染RAW264.7細胞存活率的影響MTT法檢測細胞存活率，結(jié)果顯示BCG單獨處理組細胞存活率顯著下調(diào)(P<0.001)；si-VDAC1單獨處理組細胞存活率變化不明顯；BCG和si-VDAC1共同處理組相對于BCG組細胞存活率顯著上調(diào)(P<0.001)(圖3)。由此可見，BCG感染巨噬細胞后可顯著降低細胞存活率，且VDAC1參與了該過程。

圖3 VDAC1對BCG感染RAW264.7細胞存活率的影響

2.4 VDAC1對BCG感染致RAW264.7細胞凋亡影響采用AV/PI雙染色法檢測4個處理組細胞凋亡率，結(jié)果顯示，細胞分散在4個象限，其中AnnexinV陽性細胞為右上和右下2個象限，即為凋亡細胞所占比例(圖4A)。通過GraphPad Prism 9.0軟件分析試驗數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示BCG感染極顯著提高細胞凋亡率(P<0.001)，達到52.12%(圖4B)；而當BCG與si-VDAC1結(jié)合共同處理細胞后，細胞凋亡率顯著低于BCG單獨處理組(P<0.001)(圖4C)。

A～D.細胞凋亡散點圖；E.細胞凋亡率

2.5 VDAC1對BCG感染RAW264.7細胞內(nèi)ROS含量的影響為了驗證VDAC1參與誘導的細胞凋亡是否與ROS積累有關(guān)，比較BCG單獨處理和BCG與si-VDAC1共同處理組ROS表達情況(圖5A、B)。結(jié)果顯示，BCG單獨處理時細胞內(nèi)ROS含量顯著升高(P<0.001)；共處理組熒光強度顯著降低(P<0.001)(圖5D)。表明VDAC1參與了BCG感染巨噬細胞ROS在細胞內(nèi)的積累。

A～D.流式細胞儀檢測細胞ROS含量累積；E.ROS相對表達結(jié)果分析圖

2.6 VDAC1對BCG感染RAW264.7線粒體膜電位(MMP)的影響MMP是評價線粒體完整性和功能的重要指標之一。結(jié)果如圖6所示，BCG降低RAW264.7細胞線粒體膜電位，與對照組相比，差異極顯著(P<0.001)。當用BCG與si-VDAC1共同處理細胞后，BCG誘導的MMP下降被明顯恢復至對照組水平，且與BCG單獨處理組相比，差異極顯著(P<0.001)。結(jié)果提示VDAC1與BCG所致的細胞MMP下降有關(guān)。

A～D.流式細胞術(shù)檢測線粒體膜電位變化；E.結(jié)果分析圖

2.7 VDAC1對BCG感染RAW264.7細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響為驗證VDAC1是否參與由BCG誘導RAW264.7細胞凋亡過程，通過實時熒光定量PCR檢測Caspase-3、Caspase-9、PARP的mRNA水平。結(jié)果顯示，BCG單獨感染RAW264.7細胞后，Caspase-3、Caspase-9、PARP的mRNA水平表達量均顯著上調(diào)(P<0.001)；當干擾VDAC1后RAW264.7的3種促凋亡基因mRNA水平下調(diào)(P<0.001)(圖7)。表明VDAC1可顯著促進BCG感染巨噬細胞凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9、PARP的mRNA水平。

A.Caspase-3 mRNA表達量；B.Caspase-9 mRNA表達量；C.PARP mRNA表達量

2.8 VDAC1對BCG感染巨噬細胞凋亡相關(guān)蛋白的影響采用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果顯示，BCG單獨感染RAW264.7細胞后，Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9、Cleaved-PA-RP蛋白表達量均增加。干擾VDAC1后，與BCG單獨處理組相比，RAW264.7中這3種蛋白含量均下降(圖8)。說明VDAC1與BCG感染巨噬細胞凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9、Cleaved-PA-RP表達變化有關(guān)。

2.9 VDAC1對BCG感染巨噬細胞所致的胞漿Cyt C表達的影響Cyt C從線粒體內(nèi)釋放到胞漿是線粒體凋亡的一個重要特征。因此，分析了VDAC1對Cyt C釋放情況的影響。結(jié)果表明(圖8G、H)，與對照組相比，BCG處理組細胞的Cyt C在胞漿中的含量上升。當用BCG與si-VDAC1共處理時，發(fā)現(xiàn)si-VDAC1降低BCG誘導的Cyt C在胞漿中的表達且與BCG單獨處理組相比，差異極顯著(P<0.001)。結(jié)果提示VDAC1參與BCG誘導的Cyt C從線粒體釋放到細胞胞漿。

A、B.Caspase-3 剪切體蛋白表達量；C、D.Caspase-9 剪切體蛋白表達量；E、F.PARP 剪切體蛋白表達量；G、H.Cyt C 蛋白表達量

2.10 VDAC1參與BCG感染RAW264.7細胞凋亡的調(diào)控機制為了進一步探討VDAC1在BCG誘導細胞線粒體凋亡中的調(diào)控作用機制，檢測了VBIT-4對BCG感染RAW264.7后VDAC1寡聚體形成的影響。如圖9所示，BCG感染后，細胞內(nèi)綠色熒光斑點顯著增加，當使用VBIT-4和BCG共同處理時，顯著減少了細胞內(nèi)的綠色熒光斑點數(shù)量。說明BCG感染增加了細胞內(nèi)Caspase-3剪切體的含量，而使用VDAC1寡聚抑制劑VBIT-4之后抑制了BCG感染后細胞內(nèi)Caspase-3的活化。如圖10F、H所示，單獨BCG處理組顯著(P<0.001)促進VDAC1寡聚體的形成。當使用VBIT-4和BCG共同處理時顯著降低了VDAC1寡聚體的形成。因此，證明VBIT-4對VDAC1的寡聚有抑制作用。采用Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，BCG單獨感染RAW264.7細胞后，Caspase-3、Caspase-9、PARP蛋白剪切體在細胞內(nèi)的含量均顯著增加(圖10A～G)；當使用VBIT-4和BCG共同處理時，RAW264.7中表達的這3種蛋白含量均顯著減少(P<0.001)。

圖9 VBIT-4對BCG誘導的巨噬細胞中Caspase-3蛋白表達變化

A、C.Caspase-3 剪切體蛋白表達量；B、D.Caspase-9 剪切體蛋白表達量；E、G.PARP 剪切體蛋白表達量；F、H.VDAC1多聚體蛋白表達量

3 討論

隨著活動性結(jié)核病發(fā)病率的升高、結(jié)核病與艾滋病及糖尿病的并發(fā)、耐多藥結(jié)核病的增加、疫苗防范力的不足、篩選和診斷方法的短板以及結(jié)核病復雜的致病機理與機體復雜的免疫應答系統(tǒng)，使結(jié)核病的預防與治療面對著十分嚴峻的挑戰(zhàn)，同時也對全球畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生事業(yè)的健康發(fā)展造成了重大威脅[1]。當MTB進入機體后，雖然會面臨宿主細胞多重復雜的防御，但是MTB仍然可以通過一系列的免疫逃避機制幫助自己在宿主細胞中增殖擴散[15]。隨著人們對MTB的研究，發(fā)現(xiàn)調(diào)控細胞凋亡不僅可以保護機體免受炎性損傷，而且可以更好地激活先天性和適應性免疫反應進行防御和清除MTB[16]。VDAC作為線粒體外膜上含量最豐富的通道蛋白，不僅參與調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、負責離子和代謝物轉(zhuǎn)運、控制細胞運動、影響信號轉(zhuǎn)導、組織發(fā)育、而且能夠調(diào)控細胞凋亡，在維持線粒體和細胞的生理功能方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，當細胞受到凋亡刺激后，VDAC1會受到一系列的調(diào)節(jié)作用導致線粒體外膜的通透性改變，進而使其通透化并導致位于膜間隙(IMS)中的一系列凋亡因子，例如 Cyt C、AIF(凋亡誘導因子)、Smac/DIABLO 和核酸內(nèi)切酶G的釋放。然后通過啟動一系列級聯(lián)反應，使蛋白質(zhì)和DNA的降解，最終導致細胞凋亡[14]。事實上，線粒體功能障礙與多種疾病有關(guān)，包括癌癥、阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、2型糖尿病(T2D)和心血管疾病(CVDS)。因此，各種疾病的發(fā)生發(fā)展均與VDAC1調(diào)控有關(guān)[17-20]。而在BCG感染過程中，VDAC的作用尚不完全清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，在BCG感染巨噬細胞RAW264.7過程中，會導致VDAC1的表達上調(diào)。因此推測BCG感染RAW264.7巨噬細胞誘導的細胞凋亡可能與VDAC1的調(diào)控有關(guān)。隨后設(shè)計合成了針對VDAC1序列的干擾小RNA(si-VDAC)且進行了驗證，對其是否參與了BCG感染的RAW264.7細胞凋亡進行研究。通過采用MTT法檢測RAW264.7細胞存活率發(fā)現(xiàn)，當BGG刺激后細胞存活率下調(diào)，而si-VDAC1與BCG共同處理后細胞存活率得到了緩解。為進一步驗證VDAC1是通過何種方式影響細胞存活率的，本試驗通過流式細胞儀對細胞凋亡率進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCG感染RAW264.7巨噬細胞后，細胞凋亡率發(fā)生上調(diào)，但si-VDAC1與BCG共同處理組作用RAW264.7細胞后，細胞凋亡率顯著低于BCG單獨處理組。結(jié)果表明VDAC1的敲減是通過降低BCG感染的巨噬細胞凋亡率而提高細胞存活率的。為確實這一結(jié)論，本試驗通過流式細胞儀檢測了各處理組中線粒體膜電位的變化和ROS積累情況，其結(jié)果表明BGG單獨處理組會引起線粒體膜電位的逆轉(zhuǎn)以及ROS積累，而si-VDAC1組會明顯改善這種情況。以上結(jié)果說明了敲減VDAC1會影響細胞凋亡的發(fā)生。目前研究認為細胞凋亡有3種途徑，根據(jù)凋亡刺激和引發(fā)途徑的不同可分為：線粒體依賴的內(nèi)源性途徑、死亡受體介導的外源性途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。由于VDAC1參與介導內(nèi)源性凋亡，為進一步驗證VDAC1參與BCG感染的RAW264.7細胞中內(nèi)源性凋亡的發(fā)生，本研究通過Western blot與qPCR從分子水平檢測凋亡內(nèi)源性凋亡相關(guān)因子Caspase-3、Caspase-9以及參與DNA修復的PARP的表達。結(jié)果顯示BCG感染可引起凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、PARP的表達增加，而si-VDAC1與BCG共同處理組會顯著抑制這一情況，這一發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果相符。綜上，VDAC1的敲減會抑制BCG誘導的巨噬細胞RAW264.7的凋亡，表明VDAC1參與了BCG誘導巨噬細胞凋亡的調(diào)控作用。同時結(jié)合本試驗通過測定胞質(zhì)內(nèi)Cyt C的釋放情況，發(fā)現(xiàn)si-VDAC1和BCG共同處理組與BCG單獨感染組相比，胞質(zhì)內(nèi)Cyt C的釋放顯著被抑制，進一步證明，VDAC1參與了BCG誘導巨噬細胞內(nèi)源性凋亡的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)為后續(xù)試驗奠定了基礎(chǔ)。

目前研究認為，導致MPOP發(fā)生的方式主要由Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白Bax/Bak寡聚、Bax/VDAC1異源寡聚以及VDAC1/VDAC1同源寡聚形成的大離子通道3種[13-14]。許多與VDAC1相互作用的物質(zhì)可以通過抑制其寡聚進而調(diào)控細胞凋亡。其中VBIT-4通過與VDAC1相互作用，特異性地抑制VDAC1的寡聚化和隨后在各種刺激誘導的各細胞系中的凋亡[21]。重要的是，VBIT-4能夠保護線粒體免受功能障礙，特別是恢復線粒體膜電位，而線粒體膜電位被凋亡刺激所改變，會影響能量和代謝變化、ROS的產(chǎn)生、打破細胞內(nèi)Ca2+的生理平衡[22-23]。因此能夠有效避免以上因素誘導的細胞凋亡對試驗產(chǎn)生干擾。最后，本研究通過使用VBIT-4抑制VDAC1的寡聚作用，深入探討了VDAC1在BCG誘導細胞線粒體凋亡中的調(diào)控作用機制，檢測了VBIT-4抑制VDAC1寡聚體形成后對BCG感染RAW264.7誘導細胞凋亡相關(guān)因子表達。結(jié)果表明，使用VDAC1寡聚抑制劑VBIT-4處理后同BCG處理組相比，VBIT-4顯著抑制了VDAC1寡聚體的形成和凋亡相關(guān)因子Cleaved-Caspase 3、Cleaved-PARP1、Cleaved-Caspase 9的含量(P<0.001)。同時本研究結(jié)合免疫熒光檢測了Caspase-3的表達，結(jié)果表明，BCG感染后，細胞內(nèi)綠色熒光斑點顯著增加，當使用VBIT-4和BCG共同處理時，顯著減少了細胞內(nèi)的綠色熒光斑點數(shù)量。說明BCG感染增加了細胞內(nèi)Caspase-3剪切體的含量，而使用VDAC1寡聚抑制劑VBIT-4之后抑制了BCG感染后細胞內(nèi)Caspase-3的活化。BCG感染后，細胞內(nèi)綠色熒光斑點顯著增加，當使用VBIT-4和BCG共同處理時，顯著減少了細胞內(nèi)的綠色熒光斑點數(shù)量，說明BCG感染增加了細胞內(nèi)Caspase-3剪切體的含量，而使用VDAC1寡聚抑制劑VBIT-4之后抑制了BCG感染后細胞內(nèi)Caspase-3的活化。這一發(fā)現(xiàn)與上述結(jié)果相符。綜上，本研究推測VDAC1通過寡聚形成大的離子通道參與了BCG誘導巨噬細胞內(nèi)源性凋亡的調(diào)控。