李兆龍，陳常頌，孔祥瑞，李世榮

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院 茶葉研究所，福建 福州 350013；3.泉州華惠生物科技有限公司，福建 泉州 362407)

伴隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平的提高，民眾在日常生活中高脂、高糖和高蛋白飲食增加，我國近幾年高血糖、高血脂和高血壓的患者呈直線上升?，F(xiàn)有的降糖、降脂和降壓藥物需要長期服用，且大多有一定不良反應，給人民的生活負擔和身心健康帶來較多的影響[1-4]。

已有研究表明，作為無酒精飲料的茶具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、降低高血脂和高血糖癥、減少心腦血管疾病等作用，其中研究較多的有烏龍茶、綠茶、黑茶及其相關(guān)的活性成分，特別有研究報道茯磚黑茶對降糖、降脂功效明顯[5-11]。茯磚黑茶以安化黑毛茶為原料，經(jīng)加工制成塊狀成品，經(jīng)一定時間的存儲，茶內(nèi)磚綻放 “金花”(冠突散囊菌)豐度是近幾年磚茶制作受熱捧的原因之一[12]。金花是一種真菌，學名冠突散囊菌，其寄生在茶葉中，可分泌一些酶，催化茶葉中的蛋白質(zhì)分解為有益的小肽、促進淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，催化多酚類化合物氧化，轉(zhuǎn)化成對人體有益的物質(zhì)。此外，有報道稱茯磚黑茶中提取的茯茶素有顯著降脂減肥和降糖功效[13-15]。

本研究以冠突散囊菌茶粉為原料，選用 SD 大鼠為試驗動物，通過大鼠高糖和高脂模型，探討冠突散囊菌茶粉是否具有降脂減肥和降糖功效，以期為茶類新產(chǎn)品的奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及茶葉冠突散囊菌FJ201715株，由本實驗室分離鑒定及保存。鐵觀音茶葉，購自安溪縣有機茶有限公司(生產(chǎn)日期2018年5月15日)。

1.2 實驗動物雄性健康3周齡 SD 大鼠100只，體質(zhì)量為 55～58 g，購自福建省吳氏實驗動物有限公司，許可證號：FJAE(閩)2020-0121。所有動物試驗經(jīng)福建師范大學南方生物醫(yī)學研究中心實驗研究倫理委員會批準[批準號：倫審科 2020 第(35)號]；在無特定病原體環(huán)境下飼養(yǎng)，自由飲水和進食基礎(chǔ)飼料(表1)，室溫 25℃，濕度25%。

表1 大鼠日糧組成 %

1.3 試劑甲醇、三氯甲烷、乙醇、氯仿、異丙醇和甲酸均購自國藥化學試劑公司；TRIzol購自美國Invirtrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR反應試劑盒購自天根生化科技有限公司，熒光定量試劑盒和DEPC水均購自Sigma公司。膽固醇、膽鹽、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL-C)測定試劑盒(邁瑞生物公司提供)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 冠突散囊菌茶粉的制備取100 mL的冠突散囊菌，加入900 mL的麥芽汁培養(yǎng)基，移至恒溫培養(yǎng)箱，28℃、250 r/min恒溫培養(yǎng)(24 h左右)，待菌液的濃度達到1×108CFU/mL。然后裝入無菌噴壺，按體積1∶40將其噴灑接種至100℃烘培(滅菌)2 h后室溫冷卻的有機鐵觀音成茶(1 500 g)。噴灑接種菌的茶葉放至無菌恒溫培養(yǎng)箱，28℃、150 r/min，濕度40%，培養(yǎng)96 h，待菌均勻生長后，應用血球計數(shù)法測算孢子囊數(shù)達1×107個/mL后，取長孢子囊的茶葉，100℃烘干2 h,經(jīng)碾磨粗濾、精濾制成茶粉(規(guī)格按200目)備用。

1.5 高糖、高脂大鼠模型的制備3周齡雄性SD大鼠，適應性飼養(yǎng)5 d后，取體質(zhì)量為67～68 g雄性SD大鼠90只，每組15只，隨機分為6組，其中常規(guī)飼料組(對照組)和高糖、高脂飼料組(模型組)在無特定病原體環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫 25℃，濕度25%飼養(yǎng)4周，然后每組抽檢2只空腹血糖和血脂情況，以驗證高糖、高脂模型制備。

1.6 高糖、高脂大鼠的分組及干預取1.5制備的高糖、高脂模型大鼠72只，按造模時6組，每組剔除造模時采血驗證的大鼠，按每組12只進行干預試驗，其中5組高糖、高脂模型組大鼠，每天分別以20，40，60，80，100 mg/kg的劑量灌胃冠突散囊菌茶粉懸液，空白對照組則灌胃等量5 mL蒸餾水，喂養(yǎng) 4 周，每周定時測體質(zhì)量。每周每組定時選取2只，禁食12 h，尾靜脈采血1 mL,4℃、2 200 r/min離心10 min，分離出血清，測定血清 TC、TG、HDL-C 及LDL水平。4周試驗結(jié)束時，各組統(tǒng)一禁食12 h，稱量各組的體質(zhì)量，然后眼眶下動脈取血5 mL，4℃、2 200 r/min 離心10 min，分離出血清，測定血清 TC、TG、HDL-C、LDL及空腹血糖水平，再解剖大鼠，取試驗大鼠的十二指腸、回腸、結(jié)腸和盲腸各1 cm，用蒸餾水清理腸道食物殘渣，然后用生理鹽水漂洗，再分裝至對應的離心管后立即浸入液氮速凍，并轉(zhuǎn)移至-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 生化指標的檢測血清 TC、TG、HDL-C、LDL、空腹血糖按試劑盒說明書進行測定。

1.8 引物設計與合成根據(jù)GenBank公布的相應的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0引物設計軟件設計引物(表2)，由福州博尚生物科技有限公司合成。其中胰高血糖素原基因(proglucagon gene，PLG)的引物設計采用葡萄糖轉(zhuǎn)運體2(GLUT-2)在GenBank中的特異性序列進行設計與合成。

表2 各基因引物信息

1.9 RNA的提取及實時定量PCR將各段腸組織和液氮一起研成粉末，轉(zhuǎn)到EP管，加入1 mL TRIzol溶液，混勻室溫放置6 min后，4℃、12 000×g離心10 min，取上清至另一新EP管，加入0.2 mL氯仿，充分振蕩混勻，室溫放置5 min，4℃、12 000×g離心10 min，取上層水相加入等量異丙醇，混勻后離心10 min，棄上清，加入75%乙醇重懸沉淀，12 000×g離心10 min，棄液體，放置超凈臺風干，然后加入50 mL DEPC水溶解RNA，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 肝組織切片病理學觀察選取大鼠肝臟0.6 g，用10%甲醛固定，加入石蠟進行切片包埋，再HE染色，于顯微鏡下觀察并記錄肝臟的組織病理學變化。

2 結(jié)果

2.1 冠突散囊菌茶粉經(jīng)過28℃ 96 h的恒溫培養(yǎng)，冠突散囊菌(金花)遍布茶葉的葉片，每片葉片孢子囊數(shù)量為500～1 000個，呈現(xiàn)金黃色(圖1)。將該茶葉100℃烘干2 h后，200目的超微粉碎，制成冠突散囊菌茶粉室溫密封備用。

圖1 冠突散囊菌在茶葉中生長情況

2.2 高糖、高脂日糧對體質(zhì)量和血糖、血脂的影響結(jié)果顯示，經(jīng) 4 周高糖和高脂飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠的體質(zhì)量比正常日糧對照組的體質(zhì)量明顯增高(表3)；模型組大鼠的血清 TC、TG 也顯著高于空白對照組，空腹血糖值明顯高于對照組，證實高糖、高脂大鼠動物模型建成(表4)。

表3 高糖、高脂日糧對大鼠體質(zhì)量的影響

表4 高糖、高脂大鼠血清的血糖和血脂 mmol/L

2.3 冠突散囊菌茶對高糖、高脂大鼠的體質(zhì)量、血糖和血脂的影響經(jīng)過4周持續(xù)的冠突散囊灌胃菌茶粉懸液，模型組大鼠的體質(zhì)量增長幅度下調(diào)，至試驗結(jié)束時和對照組體質(zhì)量無明顯差異，整個模型組體質(zhì)量增長明顯減緩，與對照組相比差異不顯著(表5)。與高糖、高脂的模型組相比較，冠突散囊灌胃組的大鼠血清 TC、TG、LDL和空腹血糖值顯著降低(P<0.05)，其中以灌胃100 mg組大鼠血清的 TC、TG、LDL和空腹血糖值最低。此外，冠突散囊灌胃組的大鼠血清的HDL-C出現(xiàn)明顯下調(diào)，其中以灌胃100 mg組大鼠下調(diào)最為明顯(P<0.01)(表6)。

表5 冠突散囊菌茶對高糖、高脂大鼠體質(zhì)量的影響

表6 冠突散囊菌茶對高糖、高脂大鼠血脂和血糖的影響 mmol/L

2.4 冠突散囊菌茶大鼠的肝臟組織形態(tài)學變化的影響通過大鼠的肝臟病理組織切片(圖2)觀察可見，正常日糧飼喂組大鼠的肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，無明顯的脂肪變性。而高糖、高脂模型組大鼠的肝細胞結(jié)構(gòu)不完整(圖2B)，呈現(xiàn)大面積的空泡狀脂肪變性。與高糖、高脂模型組大鼠相比，灌胃冠突散囊菌茶粉60，100 mg組的肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細胞脂肪變性不明顯，肝細胞空洞現(xiàn)象少。

A.正常對照組；B.高糖、高脂模型組；C.60 mg冠突散囊菌茶灌胃組；D.100 mg冠突散囊菌茶灌胃組

2.5 PLG在腸道的表達量由圖3可知，5組不同劑量的冠突散囊菌茶灌胃組，其空腸、結(jié)腸和盲腸的PLG相對mRNA均有明顯上調(diào)(P<0.05)，其中高劑量(80，100 mg)冠突散囊菌茶灌胃組在空腸中的PLG mRNA上調(diào)最顯著(P<0.01)。十二指腸中，只有高劑量(80，100 mg)的PLG mRNA顯著上調(diào)，其他和對照組差異不顯著(P>0.05)。

A.空腸；B.結(jié)腸；C.盲腸；D.十二指腸；*表示P<0.05(與對照比較)；0表示與其他組比較差異顯著

2.6 GLUT-2的表達量由圖4可知，5組不同劑量的冠突散囊菌茶灌胃組，其空腸、結(jié)腸和盲腸的GLUT-2相對mRNA均有下調(diào)趨勢，其中高劑量(100 mg)冠突散囊菌茶灌胃組在60 d后，其各腸道的GLUT-2 mRNA下調(diào)明顯(P<0.05)。而盲腸和空腸在80 mg冠突散囊菌茶灌胃組也出現(xiàn)GLUT-2明顯下調(diào)(P<0.05)。

A.盲腸；B.空腸；C.結(jié)腸；D.十二指腸

3 討論

本研究結(jié)果表明，冠突散囊菌茶明顯下調(diào)了高糖、高脂大鼠的空腹血糖，也降低了高糖、高脂大鼠血清中TC、TG的含量。此外，冠突散囊菌茶對高糖、高脂大鼠血清中的HDL-C 水平有明顯的上調(diào)作用。這一結(jié)果說明冠突散囊菌茶對試驗大鼠具有輔助降糖和降血脂功能。

冠突散囊菌作為真菌的一種，多見于茯茶中生長。有研究證明，其寄生在茶葉表面，分泌一定量的胞外多糖和部分的茯茶素類化合物，具有顯著的降脂減肥和降糖功效[12-14]。而茶葉又含有兒茶素、咖啡因和葉酸等成分，可以促進脂肪分解，降低血液黏稠度，對降低血脂有一定作用[5-11]。本試驗結(jié)合兩者共同的功能作用，將冠突散囊菌接種至茶葉表面，通過短時間和大劑量的接種，并為菌群生長提供適宜條件等，推動冠突散囊菌在茶葉表面的快速生長，以研究兩者結(jié)合在降糖降脂的功效，試驗結(jié)果表明其對降糖和降脂有積極的作用。但對兩者結(jié)合是否有更多的疊加作用以及相關(guān)機理，還有待進一步研究。

本研究檢測了試驗大鼠腸道內(nèi)的PLG和葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT-2的mRNA量，以解釋冠突散囊菌茶下調(diào)高糖、高脂大鼠的空腹血糖和血脂的初步機理[16]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其可下調(diào)GLUT-2的mRNA量。同時，也明顯提升了胰高血糖素原基因的mRNA。具體機理尚待深入研究。