左文婷，郭銀華，談 勇，殷燕云，周 潔，于 茜

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210000；2.南通市第一人民醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

現(xiàn)代生活中導(dǎo)致不孕的因素增多，包括飲食結(jié)構(gòu)失調(diào)、壓力、環(huán)境污染、輻射等，而不孕癥發(fā)病率的提高也給臨床輔助生殖帶來巨大壓力[1]。卵巢低儲(chǔ)備（diminished ovarian reserve，DOR）是導(dǎo)致女性不孕癥的主要原因之一，以儲(chǔ)備卵泡少、卵子質(zhì)量低為特征[2]，患者在輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）治療期間容易出現(xiàn)卵巢低反應(yīng)（poor ovarian response，POR）、早發(fā)黃體生成素（luteinizing hormone,LH）峰、卵母細(xì)胞質(zhì)量差等情況[3]，如何解決這些問題從而提高活產(chǎn)率仍然是體外受精（in vitro fertilizotion,IVF）/卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（intracytoplasmic sperm injection,ICSI）過程中最具挑戰(zhàn)的任務(wù)之一[4]。高孕激素下促排卵方案（progestin primed ovarian stimulation，PPOS）是目前臨床上認(rèn)為能有效抑制LH激增的促排卵方案[5]，且因其價(jià)格友好、可多次使用累積胚胎，與其他促排卵方案臨床結(jié)局相當(dāng)而越來越被生殖科醫(yī)師青睞。烏鱉返春口服液（蘇藥制字Z04001287）為我院院內(nèi)制劑，臨床長期用于卵巢低儲(chǔ)備患者并取得滿意療效[6]。本研究回顧性分析2019年1月至2021年3月于我科行IVF/ICSI-胚胎移植（ET）助孕的DOR患者103例，探討烏鱉返春口服液聯(lián)合PPOS方案對(duì)其臨床結(jié)局的影響，旨在為中醫(yī)藥優(yōu)化DOR患者ART促排卵方案及妊娠結(jié)局提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn) 夫婦同居，性生活正常，未避孕未孕1年[7]。

1.1.2 卵巢低儲(chǔ)備診斷標(biāo)準(zhǔn)（1）基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）≥10 U/L；（2）陰道B超示雙側(cè)竇卵泡（AFC）＜7個(gè)；（3）抗米勒管激素（AMH）＜1.1 ng/mL。3項(xiàng)中至少符合兩項(xiàng)[8]。

1.1.3 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《中醫(yī)婦科常見病診療指南》[9]及《中醫(yī)診斷學(xué)》[10]中腎陰虛證不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。主癥：（1）婚后1年不避孕未孕；（2）月經(jīng)量少；（3）經(jīng)色黯淡質(zhì)稀；（4）腰膝酸軟。次癥：（1）頭暈耳鳴；（2）潮熱盜汗；（3）五心煩熱；（4）失眠多夢(mèng)。以上主癥必備，次癥具備1～2項(xiàng)，即可診斷。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合DOR及中醫(yī)腎陰虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）均符合“衛(wèi)生部關(guān)于修訂人類輔助生殖技術(shù)與人類精子庫相關(guān)技術(shù)規(guī)范、基本標(biāo)準(zhǔn)和倫理原則的通知”[11]中體外受精-胚胎移植（IVF-ET）適應(yīng)證，無手術(shù)禁忌證；（3）均詳細(xì)告知所有患者DOR可能導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)及意外情況，患者均簽署知情同意書；（4）均使用PPOS方案促排卵。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）合并其他內(nèi)分泌障礙或自身免疫疾病；（2）存在宮腔器質(zhì)性病變；（3）夫婦其中一方染色體異常；（4）男方患有逆行射精疾病、嚴(yán)重少弱精子癥或無精子癥，需行附睪或睪丸穿刺術(shù)者。

1.4 一般資料 收集2019年1月至2021年3月就診于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科采用PPOS方案的DOR患者共103例，采用回顧性病例對(duì)照研究，根據(jù)是否口服烏鱉返春口服液分為觀察組（烏鱉返春口服液+PPOS組）52例，對(duì)照組（PPOS組）51例。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過（方案注冊(cè)號(hào)：ChiCTR-OOC-14005389）。

1.5 治療方法

1.5.1 對(duì)照組 從月經(jīng)第3天開始口服安宮黃體酮（規(guī)格：2 mg/片，浙江仙琚制藥，批號(hào)：160619）8～10 mg/d，聯(lián)合注射用尿促性素（human menopausal gonadotropin，HMG，麗珠集團(tuán)，批號(hào)：H10940097）150～300 IU/d，定期監(jiān)測B超及血激素水平，當(dāng)2個(gè)以上卵泡直徑≥18 mm或3個(gè)以上卵泡直徑≥17 mm時(shí)，予人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,HCG）（麗珠集團(tuán)，批號(hào)：H44020668）5 000～10 000 IU肌注，36 h后陰道超聲引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù)。

1.5.2 觀察組 在對(duì)照組基礎(chǔ)上提前予烏鱉返春口服液（組成：炙鱉甲、何首烏、枸杞子、白術(shù)、茯苓、續(xù)斷、黃狗脊，規(guī)格10 mL/支，江蘇省中醫(yī)院，蘇藥制字Z04001287）預(yù)處理3個(gè)月，于月經(jīng)干凈后開始服用，2次/d，1支/次，至下次月經(jīng)來潮停服，連續(xù)治療3個(gè)月經(jīng)周期。進(jìn)入促排卵周期后于促性腺激素（Gn）啟動(dòng)日開始口服，直至取卵后月經(jīng)來潮，繼續(xù)口服至凍胚移植周期，確認(rèn)妊娠則停藥。

1.5.3 受精方式、胚胎質(zhì)量評(píng)估及胚胎移植 取卵后根據(jù)精子質(zhì)量選擇授精方式（IVF/ICSI），取卵后4～6 h受精，取卵后第3日觀察胚胎發(fā)育情況，冷凍1～2枚可移植胚胎后其余胚胎繼續(xù)養(yǎng)囊，囊胚評(píng)級(jí)依據(jù)Gardner標(biāo)準(zhǔn)[12]，第5、6日囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）和/或滋養(yǎng)層（TE）細(xì)胞達(dá)到B級(jí)及以上則將囊胚冷凍。移植周期采用人工周期，月經(jīng)周期第2～3天口服戊酸雌二醇片（商口名：補(bǔ)佳樂，拜耳醫(yī)藥保?。? mg/次，2次/d，5～7 d后遞增至3 mg/次，2次/d，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度達(dá)標(biāo)后口服地屈孕酮片（商品名：達(dá)芙通，雅培制藥）20 mg/d，同時(shí)予黃體酮陰道緩釋凝膠（商品名：雪諾同，默克雪蘭諾）90 mg和（或）黃體酮軟膠囊（商品名：安琪坦，BESINS）0.6 g/d陰道內(nèi)放置，進(jìn)行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，3～5 d后移植卵裂期胚胎或囊胚1～2枚。移植后14 d查血HCG，若為陽性，繼續(xù)用藥，于移植后28～35 d陰道B超檢查宮內(nèi)見妊娠囊確定為臨床妊娠。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 中醫(yī)證候改善情況 參照《中醫(yī)婦科常見病診療指南》[9]及《中醫(yī)診斷學(xué)》[10]對(duì)主、次癥進(jìn)行評(píng)分。主癥按其無、輕度、中度、重度分別計(jì)以0、2、4、6分；次癥按其無、輕度、中度、重度分別計(jì)以0、1、2、3分。于治療前及HCG注射日進(jìn)行證候評(píng)分。

1.6.2 臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)Gn使用時(shí)間、Gn用量、HCG注射日E2水平、HCG注射日LH水平、早發(fā)LH峰率、周期取消率[周期取消率=（未取卵周期+未獲卵周期+無可移植胚胎周期數(shù)）/促排卵總周期數(shù)×100%]、MⅡ卵數(shù)、雙原核受精卵數(shù)（2PN）、正常受精率（正常受精率=2PN數(shù)/MⅡ卵數(shù)）、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率（囊胚形成率=形成囊胚數(shù)/進(jìn)行囊胚培養(yǎng)的胚胎數(shù)×100%）。臨床妊娠率（臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%）、持續(xù)妊娠率（持續(xù)妊娠率=妊娠20周以后妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%）、活產(chǎn)率（活產(chǎn)率=有活產(chǎn)嬰兒的分娩次數(shù)/移植周期數(shù)×100%）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，符合正態(tài)分布者組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者比較采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料 兩組患者年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、既往移植失敗周期、既往無可移植胚胎周期、AMH、基礎(chǔ)E2、FSH、LH及AFC比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。（見表1）

表1 兩組患者基線資料比較 （±s）

表1 兩組患者基線資料比較 （±s）

項(xiàng)目 對(duì)照組（n=51）觀察組（n=52） t P年齡（歲） 36.22±5.54 34.98±4.86 1.189 0.230不孕年限（年） 3.63±2.87 3.34±2.86 0.498 0.620 BMI（kg/m2） 22.13±3.20 21.73±2.98 0.619 0.530既往移植失敗周期（個(gè)） 0.84±0.73 0.75±0.68 0.668 0.510既往無可移植胚胎周期（個(gè)）0.73±0.67 0.79±0.67 -0.480 0.630 AMH（ng/mL） 1.11±0.82 1.01±0.69 -0.002 0.990 E2（pg/mL） 44.82±19.31 50.25±20.12 -1.350 0.180 FSH（mIU/mL） 9.94±3.64 10.87±7.67 -0.765 0.440 LH（mIU/mL） 3.86±2.39 4.67±3.24 -1.420 0.820 AFC（個(gè)） 4.67±2.00 5.00±2.11 -0.800 0.430

2.2 兩組患者治療前后腎陰虛證候積分比較 治療前兩組患者腎陰虛證候積分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組患者HCG注射日腎陰虛證候積分明顯低于治療前（P＜0.01），對(duì)照組治療前后無明顯變化。治療后觀察組患者HCG注射日腎陰虛證候積分低于對(duì)照組（P＜0.01）。（見表2）

表2 兩組治療前后腎陰虛證候積分比較 （±s）

表2 兩組治療前后腎陰虛證候積分比較 （±s）

注：與本組治療前比較，aP＜0.01

組別 例數(shù) 治療前 治療后（HCG注射日）對(duì)照組 51 29.12±2.84 28.14±4.64觀察組 52 28.96±3.19 14.44±4.40a t 0.262 15.354 P 0.794 0.000

2.3 兩組患者臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 觀察組患者Gn使用時(shí)間、Gn用量少于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組患者HCG注射日LH水平、早發(fā)LH峰率、周期取消率低于對(duì)照組，其中周期取消率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。觀察組患者HCG注射日E2水平、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率均高于對(duì)照組，其中HCG注射日E2水平、獲卵數(shù)、囊胚形成率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見表3）

表3 兩組患者臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.4 兩組患者凍胚移植周期比較 對(duì)照組19例、觀察組26例患者進(jìn)入移植周期，兩組患者解凍后移植胚胎情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。觀察組患者移植日子宮內(nèi)膜厚度、A型子宮內(nèi)膜比例高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察組患者臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、活產(chǎn)率均高于對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 兩組患者凍胚移植周期比較

3 討 論

DOR患者在促排卵過程中由于多卵泡發(fā)育導(dǎo)致血清E2水平增高，更容易出現(xiàn)早發(fā)LH峰，進(jìn)而導(dǎo)致逸卵、獲卵數(shù)減少及子宮內(nèi)膜不同步等一系列問題，因此，選擇合適的控制性促排卵（COS）方案有效抑制早發(fā)LH峰十分重要[13]。目前臨床上常用的促排卵方案包括GnRH-a激動(dòng)劑方案、GnRH-ant拮抗劑方案、溫和刺激方案等，但哪種為DOR女性的最佳選擇，尚無統(tǒng)一定論[14]。部分學(xué)者認(rèn)為GnRH-a激動(dòng)劑方案在降調(diào)過程中會(huì)使患者出現(xiàn)垂體過度抑制，導(dǎo)致卵巢反應(yīng)不良[15]，因此不主張對(duì)DOR患者采用激動(dòng)劑方案，而選擇拮抗劑、溫和刺激等方案?？镅悠?015年提出的高孕激素促排卵方案（progestinprimed ovarian stimulation，PPOS）[16]通過在卵泡期口服孕激素抑制下丘腦GnRH的分泌，減緩LH脈沖頻率并降低其血漿含量，研究表明，PPOS與拮抗劑、溫和刺激方案比較，三者活產(chǎn)率相當(dāng)，但PPOS的早發(fā)LH峰發(fā)生率更低[17-18]。因此，筆者認(rèn)為對(duì)于以卵巢反應(yīng)不良、早發(fā)LH峰發(fā)生率高為特點(diǎn)的DOR患者，PPOS方案更為適用。

中醫(yī)學(xué)并無“卵巢低儲(chǔ)備”病名，根據(jù)其臨床癥狀，可歸屬于“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇?！陡登嘀髋啤吩疲骸敖?jīng)水之名者，原以水出于腎……然則經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸?！盵19]國醫(yī)大師夏桂成認(rèn)為卵巢低儲(chǔ)備的病機(jī)為腎精虧虛、腎氣不足，沖任脈虛，陽明脈衰，脾腎功能進(jìn)一步衰退，則胞脈、胞宮失養(yǎng)，女性生殖功能減退，乃至不孕。中醫(yī)藥在改善卵巢儲(chǔ)備功能方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，可從調(diào)節(jié)血清性激素水平、改善卵巢局部微循環(huán)、抑制顆粒細(xì)胞凋亡等多角度發(fā)揮優(yōu)勢，改善卵巢儲(chǔ)備功能[20]。烏鱉返春口服液（蘇藥制字Z04001287）為我院院內(nèi)制劑，方藥組成：炙鱉甲、何首烏、枸杞子、續(xù)斷、白術(shù)、茯苓、黃狗脊。其中炙鱉甲、何首烏為君藥，滋腎養(yǎng)陰；枸杞子、續(xù)斷為臣藥，補(bǔ)益肝腎；君臣合用滋腎健脾，脾腎雙補(bǔ)；白術(shù)、茯苓為佐藥，健脾祛濕；黃狗脊為使藥。全方共奏補(bǔ)肝腎、健脾胃、調(diào)沖任功效。經(jīng)幾十年臨床實(shí)踐，烏鱉返春口服液能夠提高卵巢功能早衰患者血清E2水平，降低FSH、LH水平，具有雌激素樣作用，能改善卵巢功能、延緩卵巢功能衰退[21]。

本研究中，觀察組患者Gn使用時(shí)間、Gn用量少于對(duì)照組，說明烏鱉返春口服液的雌激素樣作用能減少Gn用量，縮短Gn使用時(shí)間，觀察組HCG注射日E2水平、獲卵數(shù)均高于對(duì)照組，盡管兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在Gn使用時(shí)間、Gn用量均顯著減少的情況下，HCG注射日E2水平、獲卵數(shù)有增高趨勢，表明烏鱉返春口服液對(duì)減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有積極作用。對(duì)照組早發(fā)LH峰率為5.9%，這與FAN X Y等[22]研究結(jié)果相似，而觀察組無早發(fā)LH峰發(fā)生，觀察組LH水平低于對(duì)照組，盡管兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明烏鱉返春口服液的雌激素樣作用并未增加早發(fā)LH峰的發(fā)生率。觀察組MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率均明顯高于對(duì)照組，周期取消率明顯低于對(duì)照組，說明烏鱉返春口服液能提高卵子質(zhì)量，增加卵子成熟率，增加MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)，提高正常受精率，能改善胚胎質(zhì)量，增加優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率，同時(shí)降低周期取消率。研究表明，卵母細(xì)胞質(zhì)量與顆粒細(xì)胞凋亡增加有關(guān)[23]，在ART周期中，卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COC）水平與凋亡蛋白水平密切相關(guān)，但顆粒細(xì)胞中凋亡蛋白影響ART結(jié)局的潛在機(jī)制尚不完全清楚[24]。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)烏鱉口服液對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[25]，烏鱉口服液是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步改善胚胎質(zhì)量，從而改善ART結(jié)局有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。觀察組囊胚形成率高于對(duì)照組，然而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是樣本量小的原因。凍胚移植周期中，兩組移植胚胎情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，觀察組移植日子宮內(nèi)膜厚度、A型子宮內(nèi)膜比例均明顯高于對(duì)照組，說明烏鱉返春口服液能增加子宮內(nèi)膜厚度，提高A型子宮內(nèi)膜比例。目前尚無烏鱉返春口服液在子宮內(nèi)膜方面的研究，后期可進(jìn)一步深入研究。觀察組臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率均有增高趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明烏鱉返春口服液可能對(duì)提高DOR患者的臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率、活產(chǎn)率有積極影響，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行前瞻、隨機(jī)研究，驗(yàn)證其療效。

綜上，烏鱉返春口服液聯(lián)合PPOS方案能減少Gn用量，減少Gn使用時(shí)間，同時(shí)能提高卵子質(zhì)量，提高DOR患者的MⅡ卵數(shù)、2PN數(shù)，提高正常受精率，能改善胚胎質(zhì)量，增加優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率，降低周期取消率，增加凍胚移植周期患者子宮內(nèi)膜厚度，提高A型子宮內(nèi)膜比例，從而臨床妊娠率、持續(xù)妊娠率及活產(chǎn)率均有增高趨勢，值得臨床推廣和應(yīng)用。