陳曉梅, 李小林, 丁婷, 趙桃娟, 陳炙, 黃振*

1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081；2. 森林和濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川重點實驗室，四川 成都 610081；3. 雅安市雨城區(qū)林業(yè)局，四川 雅安 625000

紫薇（Lagerstroemia indicaL.）為千屈菜科紫薇屬灌木或小喬木，共有55種，自然分布于亞洲和大洋洲。目前我國紫薇屬共有25個種[1]，是紫薇屬植物的世界分布中心和起源中心，是中國夏季重要的傳統(tǒng)觀賞花木，具有花期長、花色艷麗等優(yōu)點，在我國有近1600年栽培史，美國亦有兩百余年紫薇引種栽培史[2]，并形成了近百個專利品種[3]。因此，在紫薇種質(zhì)引種的基礎(chǔ)上，開展物候特別是花期觀察，以及花粉活性、花粉萌發(fā)和柱頭互作等研究，是紫薇雜交創(chuàng)制新種質(zhì)的前期必備研究[4]。

2008年，四川省林科院從湖南省林科院引入多個品種的美國紫薇開展引種試驗，試驗地位于四川省樂至縣東山鎮(zhèn)孔雀鄉(xiāng)的樂至國家林業(yè)科技示范園區(qū)（以下簡稱：樂至園區(qū)），2016年選擇生長正常，未發(fā)生嚴(yán)重病蟲害品種的穗條，扦插繁殖后建立紫薇收集圃。本研究從收集圃中選擇了花葉具有特色、同時花期可遇的3個品種，在物候觀測的同時，研究了各品種花粉活力和萌發(fā)情況，并采用熒光顯微技術(shù)研究花粉在柱頭上萌發(fā)規(guī)律，為3種美國紫薇的雜交組合設(shè)計提供花粉和柱頭互作時效方面的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地點概況

試驗于2019年7月開始，供試紫薇位于樂至園區(qū)紫薇收集圃。收集圃海拔446 m，日均氣溫16.7℃，年均日照1 330 h，年均降水量900 mm，但分布不均，夏季雨量占全年降雨量的半數(shù)。屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候[5]。

1.2 試驗材料

2016年分別采集Red Rocket、E. Ember、Delta Blush的嫩枝扦插建立紫薇收集圃，從每個品種各選取3株5年生無病蟲害、生長狀態(tài)良好的植株為試驗材料。

1.3 試驗方法

（1）花期觀察。以第一朵花開放為始花期，以開花量達(dá)到一半總花蕾數(shù)時為盛花期，以最后一朵花凋落為末花期。定株定朵觀察授粉后花瓣、花萼、柱頭、子房狀態(tài)。

（2）花粉采集。各品種進(jìn)入盛花期后，于早上9:00—11:00選擇盛開的花朵，用鑷子將長短花藥分別撥入培養(yǎng)皿內(nèi)帶回實驗室，把花藥轉(zhuǎn)入由100目細(xì)胞篩、硫酸紙和5 cm厚干燥劑的組成的密封干燥盒中靜置4 h，待花粉和花藥完全干燥后，花粉掉落至硫酸紙上，可收集至離心管中備用。

（3）花粉活力測定。用鑷子從離心管中取少許干燥花粉，敲落在載玻片上，滴1滴0.5% TTC溶液，25℃暗培養(yǎng)10 min，在顯微鏡下觀察花粉染色情況，每個品種的長、短花藥隨機(jī)選擇3個視野，統(tǒng)計花粉數(shù)量、染色花粉數(shù)量，計算花粉活力[6]；同時把花粉撒在萌發(fā)培養(yǎng)基上（150 g·L-1蔗糖+60 mg·L-1硼酸+20 mg·L-1CaCl2）[7]，25℃暗培養(yǎng)2 h，每個品種的長、短花藥隨機(jī)選擇3個視野，統(tǒng)計花粉數(shù)量、萌發(fā)花粉數(shù)量。

（4）花粉在柱頭上萌發(fā)比較。在參考顧翠花[8]、曾慧杰[6]的熒光染色法的基礎(chǔ)上，增加DAPI復(fù)染，具體操作步驟為：分別給3個紫薇品種柱頭進(jìn)行授粉并套袋，每隔2 h取3個柱頭，共取10次。柱頭放入FAA固定液固定保存24 h，倒去FAA固定液，用1 M NaOH溶液清洗并軟化8h，用50 mM偏磷酸鉀溶液清洗3次后，用鑷子夾出柱頭，放置在載玻片上，用濾紙吸凈溶液，滴1滴現(xiàn)配0.1%苯胺藍(lán)染色液和1滴10 ug·mL-1DAPI溶液，靜置10 min后，輕輕放上蓋玻片后，沿與柱頭垂直方向輕壓蓋玻片，使柱頭橫向平鋪。用奧林巴斯BX51顯微鏡（CCD：DP73）觀察并拍照，記錄各柱頭上花藥和花粉管的萌發(fā)和生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 花期觀察

花期是表征觀賞植物最重要的性狀之一，紫薇是炎炎夏日少見的開花喬木，素有“百日紅”的美稱。樂至園區(qū)引種紫薇定株觀察發(fā)現(xiàn)（見表1），引種的3個品種紫薇均在7月底或8月上旬進(jìn)入開花期，其中紅火箭初花期最早，Delta Blush初花期比紅火箭晚5 d，而E. Ember則在8月10日開始開花。

紅火箭和E. Ember初花后1個月進(jìn)入盛花期，即為最佳觀花期，而Delta Blush初花期后40 d進(jìn)入盛花期（見圖1）。3個美國紫薇花期均在2個月左右，其中紅火箭花期最長，可達(dá)70 d；Delta Blush花期次之，為63 d；E. Ember花期最短，為52 d。紅火箭花色為中度紅（RHS N45），E. Ember花色為濃紅色（RHS 53B），Delta Blush紅紫色（RHS 68A）。其中紅火箭花色與王曉明等評價的紅火箭花色一致。

在授粉后，紫薇品種間表現(xiàn)迥異，紅火箭授粉后2 d花絲收攏、彎曲蜷縮，3 d花瓣開始萎蔫花萼較為收攏，4 d花萼收攏至一半花瓣凋謝，5 d柱頭彎曲萎蔫花瓣完全掉落，10 d后可見子房開始膨大，果實顏色由綠色變黃直至變黑。E. Ember葉紫色，授粉后2 d花絲收攏、彎曲蜷縮、花萼較為收攏，3 d花瓣萎蔫掉落花萼收攏，4 d花萼完全收攏，柱頭彎曲萎蔫，12 d后可見子房開始膨大，果實顏色由綠色變綠色帶暗紅色條紋狀。Delta Blush授粉后2 d花絲收攏、彎曲蜷縮，花瓣開始掉落，3 d花萼較為收攏，4 d花萼收攏花瓣完全凋謝，5 d柱頭彎曲萎蔫，6 d后可見子房開始膨大，果實顏色由綠色變黃直至變黑。

表 1 三個品種美國紫薇花期比較Tab. 1 Comparison of flowering period of three American Lagerstroemia indica varieties

2.2 花粉活力測定

花粉活力研究發(fā)現(xiàn)，3個品種的美國紫薇花粉均具有較強(qiáng)活力（見圖2），活力值介于76%～83%（見表2），方差分析結(jié)果表明品種間活力差異不顯著。說明3個品種的紫薇花粉均為正?；ǚ哿?，未出現(xiàn)2 n大花粉等異?；ǚ?。來源于長花絲花藥中的花粉粒平均活力均高于來源于短花絲花藥中花粉粒，但差異不顯著。兩類花粉粒在顏色上稍有差異，短花絲花藥上的花粉粒顏色偏黃，而長花絲花藥上的花粉粒顏色偏綠。

干燥花粉萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，3個品種的美國紫薇花粉均能正常萌發(fā)（見圖2），萌發(fā)率為27.13%～40.25%，來源于長花絲花藥中的花粉的萌發(fā)率均高于同一品種的短花絲花藥中的花粉，其中，紅火箭達(dá)到了差異顯著水平，E. Ember和Delta Blush均未達(dá)到顯著性水平。3個品種間的長花絲花藥中的花粉平均萌發(fā)率相互之間無顯著性差異，Delta Blush短花絲花藥中的花粉平均萌發(fā)率顯著高于紅火箭，紅火箭和E.Ember的短花絲花藥中的花粉平均萌發(fā)率差異不顯著（見表2）。

圖 1 美國紫薇定植與花特寫。A-C：紅火箭；D-F：E. Ember；G-I：Delta BlushFig. 1 Planting map of American Lagerstroemia indica and the closeup of flowers.

圖 2 美國紫薇花粉活力測定與萌發(fā)。A：紅火箭短花絲花藥中的花粉粒；B：E. Ember短花絲花藥中的花粉粒；C：Delta Blush短花絲花藥中的花粉粒；D：紅火箭長花絲花藥中的花粉粒；E：E. Ember長花絲花藥中的花粉粒；F：Delta Blush長花絲花藥中的花粉粒。標(biāo)尺=20 umFig. 2 Determination of pollen vitality and germination of American Lagerstroemia indica. A: Pollen of Red Rocket from short capillament anther,B: Pollen of E. Ember from short capillament anther, C: Pollen of Delta Blush from short capillament anther, D: Pollen of Red Rocket from long capillament anther, E: Pollen of E. Ember from long capillament anther, F: Pollen of Delta Blush from long capillament anther. Bar=20 um

2.3 花粉在柱頭上萌發(fā)比較

細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，采用干燥花粉授粉后，3個美國紫薇上柱頭上花粉的萌發(fā)過程基本一致，花粉和花粉管發(fā)育至各階段的時間不同，3個美國紫薇均自交親和，且自交花粉所需的萌發(fā)時間少于異交花粉，自交并完成授粉的時間均為12 h（見表3）。

表 2 三個品種美國紫薇花粉活力比較Tab. 2 Comparison of pollen vitality of three American Lagerstroemia indica varieties

表 3 紫薇授粉后各個可觀察標(biāo)志性事件發(fā)生的時期Tab. 3 Time length of the observable landmark events after the pollination of Lagerstroemia indica

紅火箭和E. Ember正反交時，在花粉萌發(fā)時間和花粉管運動速度上基本一致，因此各個可觀察到的標(biāo)志性事件發(fā)生的時間是一致的。紅火箭與Delta Blush正反交時，花粉萌發(fā)時間上一致，在花粉管運動速度上，Delta Blush花粉管比紅火箭花粉管要快，到達(dá)花柱中部所需的時間比快4 h，到達(dá)子房的時間快6 h。

E. Ember和Delta Blush正反交時，花粉萌發(fā)時間均較長，需要6 h，后續(xù)各個可觀察到的標(biāo)志性事件基本一致，最終柱頭花粉管消失時間均為18 h。

由此可知，3個美國紫薇品種均可進(jìn)行自交和異交，并在24 h內(nèi)完成雙受精過程，柱頭表面熒光信號彌散，表明花粉管程序性死亡（見圖3B、G/H相比），柱頭可授性消失，新授的花粉不會萌發(fā)。因此，這些品種雜交24 h后去掉套袋，并不會影響雜交效果，還能降低夏季高溫季節(jié)雜交時的落果率。

以E. Ember花粉粒在紅火箭柱頭上的萌發(fā)為例。授粉后，E. Ember花粉粒被柱頭頂端的乳突細(xì)胞頂端捕獲，或陷于乳突細(xì)胞之間（見圖3A），2 h后，花粉粒開始萌發(fā)，部分乳突細(xì)胞與花粉相交處出現(xiàn)胼胝質(zhì)，熒光信號顯著強(qiáng)于乳突細(xì)胞原有熒光信號（見圖3B曲線箭頭），說明乳突細(xì)胞與花粉粒之間正進(jìn)行識別信號互作，而完成了識別工作的花粉粒則萌發(fā)出花粉管并往柱頭內(nèi)部伸展（見圖3B直線箭頭）。

授粉10 h后發(fā)現(xiàn)大量花粉管生長至花柱中央（見圖3D，圖4A），圖3D點狀熒光為精細(xì)胞，花粉管在花柱內(nèi)順著維管束伸展，彼此呈平行線狀（見圖4），此時花柱末端未發(fā)現(xiàn)精細(xì)胞和花粉管（見圖3E），表明此時花粉管尚未發(fā)展至此。

授粉14 h時，柱頭和花粉管熒光信號逐漸彌散（見圖3G），柱頭信號呈毛玻璃狀（見圖3H），表明此時柱頭內(nèi)花粉管解體，花粉管內(nèi)精細(xì)胞已進(jìn)入子房，完成雙受精。

圖 4 E. Ember花粉管和精細(xì)胞在紅火箭花柱中部的移動軌跡。A：明場圖；B：綠激發(fā)熒光圖；C：藍(lán)激光熒光圖；D：紫外激發(fā)熒光圖Fig. 4 Moving track of E. Ember pollen tubes and sperm cells in the middle of Red Rocket stigma. A: Bright field image; B: Green excitation fluorescence image; C: Blue laser fluorescence image; D: Ultraviolet excitation fluorescence image

3 結(jié)論與討論

引種的3種美國紫薇花期和花粉萌發(fā)特性研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個品種紫薇均在7月底或8月上旬進(jìn)入開花期，其中紅火箭初花期最早，Delta Blush初花期比紅火箭晚5 d，而E. Ember則在8月10日開始開花。

3個美國紫薇花期均在2個月左右，其中紅火箭花期為70 d，低于該品種在湖南4個月的花期[9,10]。花期長短與生境息息相關(guān)，研究當(dāng)年綿延的陰雨天是導(dǎo)致花期提前結(jié)束的主要原因，降雨和高濕天氣，不僅易打落花瓣，還導(dǎo)致花苞消苞凋零，同時，試驗地堿性土的環(huán)境也對花期有一定的影響。

花期的可遇為雜交育種提供了可能，隨后開展了3個美國紫薇的花粉活力和萌發(fā)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個品種的花粉均具有較強(qiáng)活力，花粉萌發(fā)試驗中蔗糖提供碳源和滲透壓，多項研究表明蔗糖濃度在100 g·L-1～200 g·L-1為宜[11-15]，本研究在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，采用了150 g·L-1的蔗糖濃度，取得了較好的萌發(fā)效果。來源于長/短花絲花藥中的花粉粒均能正常萌發(fā)，來源于長花絲花藥中的花粉萌發(fā)率高于短花絲花藥中的花粉萌發(fā)率，其中紅火箭的花粉萌發(fā)率達(dá)到了顯著性水平；品種間短花絲花藥中的花粉萌發(fā)率存在顯著性差異，而品種間長花絲花藥中的花粉平均萌發(fā)率相互之間無顯著性差異。

因此，3個美國紫薇的采集花藥的時候，無需單獨分部位采集。與張秦英等認(rèn)為長花絲花藥和短花絲花藥中的花粉育性沒差別的判斷是一致的[16]，與顧翠花等認(rèn)為長、短花絲萌發(fā)力存在差異，“紫爪銀薇”和“紅蝶飛舞”短花絲的花粉萌發(fā)力高于長花絲的判斷不一致[7]。由此推測紫薇花上兩個部位的花粉差異的情況與品種息息相關(guān)。

花粉柱頭萌發(fā)表明，3個美國紫薇均可進(jìn)行自交和異交，自交萌發(fā)和完成授粉時間均為12 h。與張秦英等研究結(jié)論一致[16]。異交組合花粉管達(dá)到子房在14～18 h，所需時間比自交長，原因是紫薇柱頭對花粉粒的萌發(fā)具有選擇性，只有能和紫薇柱頭的生理生化作用相協(xié)調(diào)的花粉粒才能萌發(fā)[6]，如紫薇和大花紫薇的雜交中，Dynamite花粉在大花紫薇的柱頭上授粉后需要48 h才能進(jìn)入胚珠[17]?！安氏紳M天”花粉在“紅紅火火”柱頭上萌發(fā)需要6 h，12 h后花粉管發(fā)育至花柱中部，24 h后，花粉管進(jìn)入子房[18]。相關(guān)研究可為雜交取袋時間提供細(xì)胞學(xué)參考。

研究表明，川中丘陵區(qū)特有的氣候特征，不僅導(dǎo)致紫薇花期縮短，還容易誘發(fā)白粉病和灰霉病等病害，以及尺蠖、紫薇絨蚧、蚧殼蟲等蟲害，因此，加強(qiáng)引種紫薇和本地紫薇品種的物候研究，從花期可遇品種中篩選具有一定病蟲害抗性的品種，開展抗病、抗蟲紫薇研究，是下一步工作的重點。本研究建立的花粉收集、活力測定和柱頭萌發(fā)等方法，可為新種質(zhì)的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。