尹晨亮,張庶民 綜述,徐穎華,倪現(xiàn)樸 審校
1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110000;2.北京成大天和生物科技有限公司,北京 102600;3.中國(guó)食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102629
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)是一種革蘭陰性、專性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物,是引起性傳播感染(sexually transmitted infection,STI)的重要病原體,可引發(fā)眼部、生殖道等多個(gè)系統(tǒng)疾病。2019 年,我國(guó)103 個(gè)性病監(jiān)測(cè)點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,每10萬(wàn)人中,有5.532 萬(wàn)人感染CT[1]。截至2016 年,WHO 統(tǒng)計(jì)全球CT 感染者約1.272 億人[2],嚴(yán)重影響人類(lèi)生活健康。根據(jù)CT 表面外膜蛋白不同,分為19 種血清型,其中A ~C 血清型引起沙眼;D ~K 血清型主要引起泌尿生殖系統(tǒng)感染,包括男性的非淋菌性尿道炎和附睪炎及女性嚴(yán)重的并發(fā)癥(如不孕不育、異位妊娠和慢性盆腔疼痛);L1 ~L3 血清型引起直腸感染[3]。CT 與人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染和傳播率的顯著增加有關(guān)[4]。一項(xiàng)來(lái)自印度的研究表明,在不孕癥患者中,大部分感染E 型CT,其次是變異體D 和F 型[5]。
目前,對(duì)抗CT 感染的主要方法是采用抗生素及對(duì)癥治療,但隨著抗生素耐藥菌株的出現(xiàn),以及抗生素治療可能會(huì)降低機(jī)體對(duì)CT 免疫反應(yīng)的持久性和產(chǎn)生抗體的能力,導(dǎo)致再感染率上升[6],因此,安全、有效的CT 疫苗可能成為預(yù)防和控制CT 感染最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)易感人群的長(zhǎng)期保護(hù),減少傳播并抑制繼發(fā)性感染。前期,由于CT 自身的免疫逃避機(jī)制及獨(dú)特的雙相發(fā)育周期使CT 疫苗的研發(fā)受到限制[7]。近年,隨著生物技術(shù)的發(fā)展及對(duì)CT 免疫保護(hù)機(jī)制研究的深入,重組CT 疫苗取得了較大進(jìn)展,重組CT 疫苗CTH522 已獲批進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn),結(jié)果表明具有良好的安全耐受性和免疫原性。本文就CT 誘導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)、相關(guān)重組疫苗臨床前和臨床試驗(yàn)研究進(jìn)展及面臨的挑戰(zhàn)作一綜述,以期為我國(guó)CT 疫苗的開(kāi)發(fā)提供參考。
1.1細(xì)胞免疫 抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells,APC),如巨噬細(xì)胞(macrophages)和樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)等,在機(jī)體抗CT 感染免疫中發(fā)揮重要作用[8]。TLR2、STING 和NLR 等活性分子在DC 內(nèi)攝取CT 時(shí)被激活,并產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子,如IL-1α、IL-6、IL-12、TNF-α、CCR7 和CXCL10,促使DC 抗原呈遞,抗原被攝取后DC 可通過(guò)優(yōu)先產(chǎn)生IL-12,誘導(dǎo)未成熟的CD4+T 淋巴細(xì)胞活化和分化為主要的Th1 亞群,刺激機(jī)體免疫保護(hù)機(jī)制,形成針對(duì)CT 感染的主要保護(hù)[9]。
CD4+和CD8+T 細(xì)胞在CT 感染期間聚集至感染部位,表達(dá)上調(diào),該結(jié)論已在小鼠和非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物模型中證實(shí),激活CD4+和CD8+T 細(xì)胞免疫反應(yīng)是抵抗CT 感染反應(yīng)所必需的[10]。INFγ 也是對(duì)抗CT感染的最關(guān)鍵細(xì)胞因子之一,能夠激活許多與清除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌相關(guān)的重要效應(yīng)途徑,如IFNγ 激活吲哚-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO),下調(diào)細(xì)胞的色氨酸水平,抑制CT 的生長(zhǎng);IFNγ 還可誘導(dǎo)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)上調(diào),生成NO[11]。NO 是一種抗菌因子,可破壞CT 的DNA,具有細(xì)胞毒性[12]。另外,IFNγ 抑制轉(zhuǎn)鐵蛋白受體分子在宿主細(xì)胞表面的表達(dá),導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)鐵濃度的下降,影響CT 的生長(zhǎng)。
1.2體液免疫 CT 感染能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體,包括IgG、IgE 和SIgA 等,且能提供一定的保護(hù)作用。但研究發(fā)現(xiàn),這些抗體單獨(dú)并不能阻止CT 感染及其病情的惡化,可能與再次感染B 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)與初次感染的CD4+T 細(xì)胞變化有關(guān)[13]。另外,MORRISON 等[14]研究發(fā)現(xiàn),在動(dòng)物模型體內(nèi)CD4+T細(xì)胞消耗完后,缺乏B 細(xì)胞的小鼠也并不能清除繼發(fā)感染;同樣在缺乏B 細(xì)胞條件下,機(jī)體刺激CD4+T 細(xì)胞的能力減弱。因此,在抗CT 感染免疫反應(yīng)中,B細(xì)胞對(duì)啟動(dòng)T 細(xì)胞免疫反應(yīng)是必需的,其中抗體可阻斷CT 對(duì)黏膜上皮細(xì)胞的黏附,阻斷CT 的進(jìn)一步感染;抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷CT 的活性[15]。
隨著多種組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)了一些對(duì)CT 感染潛在免疫保護(hù)的候選抗原,如多態(tài)性膜蛋白(polymorphic membrane proteins,Pmps)、蛋白酶樣活性因子(chlamydial protease-like activity factor,CPAF)和主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)等,其中基于MOMP 為主要抗原組分的候選疫苗CTH522 已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn),而其他候選抗原蛋白還主要集中在臨床前研究。
2.1Pmps Pmps 是一組暴露于CT 表面的膜蛋白,通過(guò)黏附,在CT 感染的初始階段發(fā)揮重要作用。共發(fā)現(xiàn)CT 有9 種Pmps 亞型(A ~ I)[16],其中PmpG 亞型能夠結(jié)合其他的抗原蛋白,輔以有效的佐劑可誘導(dǎo)強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)[17]。PmpD 亞型作為一種泛中和抗原,能與不同CT 血清型產(chǎn)生交叉保護(hù)[18]。另外,研究證實(shí),Pmps 能通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,誘導(dǎo)受感染細(xì)胞免疫功能反應(yīng),產(chǎn)生IL-8、IL-6 等活性分子[16]。
ROSHAN 等[19]用rVCG-PmpD / PorB 重組候選疫苗免疫小鼠,可誘導(dǎo)強(qiáng)烈細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的CT 特異性CD4+T 細(xì)胞,分泌IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17 及抗PmpD 特異性IgG2c 和IgA 抗體,并保護(hù)免疫動(dòng)物抵抗CT 感染攻擊;同時(shí)也證實(shí),免疫接種rVCG-PmpD / PorB 可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫記憶反應(yīng),即在再次CT 感染攻擊后更快地清除病原體感染。另外,研究還發(fā)現(xiàn),小鼠肌內(nèi)和鼻內(nèi)免疫rVCG-PmpD / PorB 后,兩種免疫途徑均可誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分泌相對(duì)較高水平的Th1 相關(guān)IFNγ 和較低水平的Th2 相關(guān)IL-4 細(xì)胞因子,誘導(dǎo)刺激CD4+T 細(xì)胞增殖[20]。rVCG-PmpD / PorB 在體內(nèi)與Fms 樣酪氨酸激酶受體Flt3 / Flk2 結(jié)合,刺激各種免疫細(xì)胞的增殖和分化,產(chǎn)生高滴度抗體。上述研究表明,PmpD 可被抗原呈遞細(xì)胞識(shí)別、降解、加工并呈遞給CD4+T 細(xì)胞,建議可作為CT 疫苗的候選抗原蛋白。
2.2CPAF CPAF 是CT 分泌的一種絲氨酸蛋白酶[21],一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì),可作為毒力因子,通過(guò)降解宿主抗微生物相關(guān)多肽物質(zhì),助力CT 侵襲感染宿主。另外,研究還發(fā)現(xiàn),CPAF 能夠降解宿主轉(zhuǎn)錄因子,如USF-1 和RFX-5,同時(shí),促凋亡蛋白BH3也被CPAF 降解,阻斷了CT 凋亡[22]。
通過(guò)CT 感染患者陽(yáng)性血清譜分析發(fā)現(xiàn),CPAF具有潛在免疫原性,同時(shí),在動(dòng)物模型中也證實(shí),CPAF誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)為依賴IFNγ 的細(xì)胞免疫,而非產(chǎn)生抗體的體液免疫[23]。MURTHY 等[24]用重組CPAF(rCPAF)經(jīng)小鼠鼻黏膜接種,可在體內(nèi)引起強(qiáng)烈的Th1 細(xì)胞免疫反應(yīng),產(chǎn)生INFγ;當(dāng)輔以IL-12 作為佐劑時(shí),可顯著提高CPAF 誘導(dǎo)免疫應(yīng)答,并產(chǎn)生黏膜IgA 應(yīng)答;隨后該研究還構(gòu)建了一種新的CPAF 融合蛋白(rCPAFep),即由5 個(gè)CPAF 的T 細(xì)胞反應(yīng)性表位多肽(Cep1-5)融合表達(dá)而成,發(fā)現(xiàn)具有與全長(zhǎng)的CPAF 相同的免疫原性和保護(hù)效果,表明這5 個(gè)多肽是CPAF 主要的抗原性保護(hù)表位,可作為潛在疫苗抗原成分,同時(shí)又可避免CPAF 中其他多肽可能引起不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
MOMP 是一種相對(duì)分值質(zhì)量約40 000 的跨膜蛋白,約占CT 外膜的60%。作為一種優(yōu)勢(shì)膜蛋白抗原,MOMP 表面有眾多的B 和T 細(xì)胞表位,可刺激產(chǎn)生抗體和引發(fā)細(xì)胞免疫。GUIFENG 等[25]對(duì)天然MOMP(nMOMP)和重組MOMP(rMOMP)輔以佐劑CpG-1826 免疫小鼠后,結(jié)果發(fā)現(xiàn),rMOMP 在動(dòng)物模型中僅誘導(dǎo)產(chǎn)生部分免疫保護(hù),而nMOMP 的免疫保護(hù)效力更強(qiáng),表明MOMP 免疫保護(hù)性可能高度依賴重組蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)。另外,OLSEN 等[26]基于MOMP上可變域VD4 多聚體研發(fā)了一種新rMOMP 候選疫苗,VD4 含有B 細(xì)胞表位,該候選疫苗能產(chǎn)生中和D、E、F 和G 型CT 的高滴度的抗體,并能誘導(dǎo)較強(qiáng)的T 細(xì)胞反應(yīng),保護(hù)小鼠模型中由CT 感染引起的生殖道病變。
ABRAHAM 等[27]將rMOMP 中所有Cys 殘基用Ser 取代,并融合至4 個(gè)血清型D ~G 的可變域上,以此MOMP 為基礎(chǔ)的CTH522 疫苗進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn),該疫苗以CAF01 脂質(zhì)體或氫氧化鋁作為佐劑,受試者(19 ~45 歲的健康女性)分別于4 個(gè)月內(nèi)接種3 次結(jié)合佐劑的85 μg CTH522 疫苗,隨后1 個(gè)月內(nèi)分別接受2 次30 μg 未結(jié)合佐劑的疫苗,結(jié)果表明,受試者未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng),88% ~93%受試者發(fā)生局部不良反應(yīng)(包括注射部位疼痛、壓痛和運(yùn)動(dòng)障礙)和全身不良反應(yīng)(包括頭痛、疲勞、不適和肌痛),與目前已批準(zhǔn)上市許可的其他重組亞單位疫苗(如乙肝疫苗)的安全性相當(dāng)[28]。免疫原性分析結(jié)果顯示,兩種結(jié)合不同佐劑疫苗在第1 次接種后均產(chǎn)生了免疫反應(yīng),第3 次免疫后,CTH522 ∶CAF01 誘導(dǎo)的IgG 滴度比CTH522 ∶Al(OH)3顯著提高了5 ~6 倍(P= 0.009 1),且在整個(gè)研究周期中其誘導(dǎo)中和抗體和黏膜IgA 水平及介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)要優(yōu)于CTH522 ∶Al(OH)3組[27]。表明候選疫苗具有良好的安全耐受性和免疫原性,具有較廣闊應(yīng)用前景。
4.1覆蓋CT 血清型廣的候選重組抗原選擇 重組蛋白疫苗的首要問(wèn)題是選擇廣泛覆蓋、高度保守、具備強(qiáng)免疫原性的靶抗原成分。盡管目前已發(fā)現(xiàn)了許多對(duì)不同血清型CT 感染具有一定保護(hù)性作用的毒力蛋白,但尚未發(fā)現(xiàn)一種具有激發(fā)機(jī)體針對(duì)所有血清型CT 定殖、黏附和侵襲全過(guò)程免疫保護(hù)效能的蛋白。因此,將不同優(yōu)勢(shì)抗原組合,盡量覆蓋所有CT 致病性血清型,通過(guò)協(xié)同激發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫或許是重組CT 疫苗抗原組分最佳選擇。近年得到突破性進(jìn)展、獲批上市重組疫苗包括B 群流腦疫苗、幽門(mén)螺旋桿菌疫苗等,均包含了多種重組抗原組分。
4.2適宜免疫佐劑的使用 單獨(dú)的重組疫苗抗原組分通常免疫原性較低,需輔以佐劑增強(qiáng)免疫原性。如乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV),在相應(yīng)疫苗配方中加入多種佐劑能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[29]。HONG 等[30]組合3 種不同佐劑(CpG-ODN1826、AbISco-100 或CAF01)配制了重組PmpG-1、PmpE/F-2和MOMP 疫苗,小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),CAF01 作為佐劑可最有效保護(hù)BALB / c 小鼠免受CT 感染。CAF01是一種陽(yáng)離子佐劑,由二甲基雙十八烷基胺(Dimethyldioctadecylammonium,DDA)和海藻糖二霉菌酸酯的合成類(lèi)似物(trehaloseD-(+)-trehalose 6,6'-dibehenate,TDB)組成,DDA 具有增強(qiáng)抗原遞呈和攝取的能力,確??乖某掷m(xù)釋放;TDB 作為一種免疫增強(qiáng)劑,保護(hù)Th1 和Th17 免疫。DDA 與TDB 的結(jié)合能刺激CD4+T 細(xì)胞共表達(dá)IFNγ 和TNF-α,引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[31]。
另外,黏膜免疫能夠有效控制CT 的侵入,黏膜佐劑是在感染部位增強(qiáng)免疫的理想選擇。目前,最常用的實(shí)驗(yàn)黏膜佐劑有基于毒素的佐劑,如LT 等。LT 是強(qiáng)效但有毒的黏膜佐劑,使用定點(diǎn)突變的新一代LT佐劑可減輕毒性。LTK63 是一種突變體,在無(wú)酶活性和毒性的情況下保持佐劑活性。ORETTA 等[32]使用LTK63 / CpG 佐劑與新發(fā)現(xiàn)的T 和B 細(xì)胞聯(lián)合給藥,以評(píng)估針對(duì)CT 疫苗效力,結(jié)果表明,LTK / CpG 疫苗佐劑產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1 免疫反應(yīng),其特征是誘導(dǎo)由TNF-α 或IL-2 共同表達(dá)的抗原特異性IFNγ。
4.3有效疫苗評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型 適宜的動(dòng)物模型對(duì)CT 感染的研究及候選疫苗的開(kāi)發(fā)和評(píng)估是必不可少的,目前常用的動(dòng)物模型包括小鼠、豚鼠、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物等[33]。小鼠是研究生殖器CT 感染和評(píng)估候選疫苗最廣泛使用的動(dòng)物,具有體積小、易于處理、豐富的免疫抗原等優(yōu)勢(shì),目前已報(bào)道的有C.trachomatis和C.muridarum兩種小鼠模型。豚鼠模型在CT 感染后的病理、生殖激素對(duì)感染的影響及感染的性傳播途徑更接近于人類(lèi)感染CT 病理變化。豚鼠對(duì)再感染的免疫力持續(xù)時(shí)間較短,與人類(lèi)相似,適用于評(píng)估潛在的候選疫苗[34]。
由于人類(lèi)和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物之間具有密切的進(jìn)化關(guān)系,基因相似度高,因此,使用靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物研究由CT 引起的生殖道疾病最具有可比性。其中研究最多的是獼猴,豬尾獼猴的雌性生殖道的解剖結(jié)構(gòu)和生理特性與人類(lèi)相似,在自然界也易受人類(lèi)CT變種的生殖道感染,不需進(jìn)行預(yù)處理[35-36]。另外,VANROMPAY 等[37]將豬作為研究CT 生殖道感染的大型動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)雌性豬生殖組織中表達(dá)的大多數(shù)基因均在人類(lèi)生殖器組織中普遍表達(dá),且豬自然易感CT。豬動(dòng)物模型也用于CT DNA 疫苗的評(píng)價(jià)研究,結(jié)果表明,接種該DNA 疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)CT 攻擊的免疫保護(hù)[37]。但豬模型不適合需要大量動(dòng)物的基礎(chǔ)研究,是否能作為有效動(dòng)物模型還有待進(jìn)一步研究。
CT 感染是全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一,其獨(dú)特又復(fù)雜的雙相發(fā)育機(jī)制,使其在感染初始階段可通過(guò)黏膜中和抗體進(jìn)行有效控制[38-39],包括IgA 和IgG 抗體均可在初始階段阻斷CT 的細(xì)胞附著;CT 被內(nèi)化后,分泌Th1 的干擾素IFNγ 細(xì)胞在機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)發(fā)揮重要作用[40]。因此候選疫苗需要能同時(shí)激發(fā)Th1 和Th2 免疫反應(yīng),可能產(chǎn)生更好的保護(hù)效果?;诋?dāng)前的研究成果,單個(gè)CT 抗原蛋白的免疫作用偏弱,且CT 有多種血清型分類(lèi),需要多種保護(hù)性蛋白組分的共同作用,通過(guò)協(xié)同激發(fā)機(jī)體保護(hù)性免疫或許是重組CT 疫苗抗原組分的最佳選擇。
新型強(qiáng)有力的佐劑和遞送系統(tǒng)在重組疫苗研發(fā)中也是非常重要的,能夠克服重組蛋白質(zhì)折疊的問(wèn)題[41]。雖然黏膜佐劑是CT 疫苗開(kāi)發(fā)的一個(gè)新突破,但其制備復(fù)雜,其向人類(lèi)生殖器黏膜的遞送存在問(wèn)題,需要進(jìn)一步的改進(jìn)和完善。另外,應(yīng)需要選擇除小鼠以外的動(dòng)物模型進(jìn)行候選疫苗評(píng)價(jià)研究,如獼猴和豚鼠等動(dòng)物模型評(píng)估有效的疫苗配方。通過(guò)在合適的動(dòng)物模型中優(yōu)化疫苗配方、佐劑和遞送系統(tǒng),并產(chǎn)生合適的候選CT 疫苗,用于后續(xù)臨床試驗(yàn)。隨著疫苗研制技術(shù)的不斷進(jìn)步,對(duì)感染宿主細(xì)胞機(jī)制的了解及候選抗原的篩選,有望研制出高效的重組CT 疫苗。