劉鳳森 平 玉 張 毅（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州 450052）

相關(guān)研究表明，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展、化療及免疫治療耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）作為肺癌基質(zhì)中較關(guān)鍵的細(xì)胞成分，通過分泌多種細(xì)胞因子等方式參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑以及形成免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移［2-4］。然而，由于肺癌患者中CAFs起源于不同的祖細(xì)胞，腫瘤中的CAFs亞群可能具有較大的異質(zhì)性，導(dǎo)致其功能及作用機(jī)制具有一定的差異性。近期，LAMBRECHTS等［5］在自然醫(yī)學(xué)雜志發(fā)表的文章揭示CAFs主要由7種不同的成纖維細(xì)胞亞群組成。單細(xì)胞測序分析顯示其中6種成纖維細(xì)胞亞群表達(dá)特征性基因標(biāo)志物。盡管目前多項(xiàng)研究表明成纖維細(xì)胞在化療及免疫治療耐藥中發(fā)揮重要作用，然而肺腺癌中不同成纖維細(xì)胞亞群的臨床意義及其對應(yīng)的免疫學(xué)效應(yīng)尚未明確［3］。本文結(jié)合單細(xì)胞測序得到6種成纖維細(xì)胞亞群的基因標(biāo)志物，探究不同成纖維細(xì)胞亞群對應(yīng)的臨床意義及免疫學(xué)效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)不同成纖維細(xì)胞亞群介導(dǎo)了不同的免疫效應(yīng)及臨床效應(yīng)。因此，本研究很可能為肺腺癌的免疫治療及精準(zhǔn)治療提供新的切入點(diǎn)［6］。

1 資料與方法

1.1 資料本研究納入的肺腺癌患者樣本均來自TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//cancerge-nome.Nih.gov/），TCGA是目前最大的癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫，是由美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute）和美國人類基因組研究所（National Human Genome Research Institute）共同監(jiān)督的一個(gè)項(xiàng)目。本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中提取了肺腺癌患者的數(shù)據(jù)信息，包括513例患者的遺傳信息數(shù)據(jù)（mRNA）和對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)（性別、轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤分期、吸煙史、生存狀態(tài)、隨訪時(shí)間）。

1.2 方法

1.2.1 成纖維細(xì)胞亞群浸潤分析結(jié)合LAMBRECHTS等［5］分析得到的6種成纖維細(xì)胞亞群的標(biāo)志基因，利用R軟件對TCGA中的肺腺癌患者的mRNAseq數(shù)據(jù)（TPM格式）進(jìn)行了ssGSEA分析，由此得到了6種成纖維細(xì)胞在腫瘤中浸潤的相對比例。ssGSEA在原理上與GSEA是類似的，是根據(jù)表達(dá)譜文件計(jì)算每個(gè)基因的排序值，再進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。通過此方法，能夠得到每個(gè)樣本的某種細(xì)胞或者某種通路的相對活性值。

1.2.2 細(xì)胞浸潤分析利用R軟件對TCGA中的肺腺癌患者的mRNAseq數(shù)據(jù)（TPM格式）進(jìn)行了xCell分析（64種細(xì)胞浸潤分析），由此得到了64種免疫相關(guān)細(xì)胞在腫瘤中浸潤的相對豐度。肺腺癌患者的細(xì)胞毒性因子評分和nTreg細(xì)胞浸潤評分由ImmuneCellAI數(shù)據(jù)庫（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/web/ImmuCellAI/）下載得到。

1.2.3 預(yù)測免疫治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物通過腫瘤突變負(fù)荷（TMB）、新抗原數(shù)目、PD-L1蛋白表達(dá)水平、腫瘤免疫功能障礙與排斥（TIDE）評分和腫瘤干性評分評估不同成纖維細(xì)胞亞群的免疫學(xué)相關(guān)效應(yīng)。肺腺癌患者的TMB和新抗原數(shù)據(jù)是從癌癥免疫圖譜數(shù)據(jù)庫（https：//tcia.at/home）中下載得到的。PD-L1蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)是從生物信息學(xué)門戶網(wǎng)站（http：//www.cbioportal.org）中下載得到的。TIDE評分已被證明在預(yù)測黑色素瘤和肺癌患者的免疫治療反應(yīng)方面優(yōu)于已知的免疫治療生物標(biāo)志物。從TIDE網(wǎng)站（http：//tide.dfci.harvard.edu）下載了肺腺癌患者的TIDE評分、T細(xì)胞功能障礙評分和T細(xì)胞排斥評分等。干性評分由干性基因集，經(jīng)ssGSEA分析計(jì)算得到［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Kaplan-Meier曲線和Logrank檢驗(yàn)，計(jì)算高危組和低危組成纖維細(xì)胞亞群的預(yù)后意義。根據(jù)“Survminer”R包的“surv_cutpoint”函數(shù)，將肺腺癌患者中的所有患者按最佳截?cái)帱c(diǎn)分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。Wilcoxon檢驗(yàn)比較不同成纖維細(xì)胞亞群的組間差異。Spearman分析計(jì)算連續(xù)變量間的相關(guān)性。在所有統(tǒng)計(jì)方法中，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。R軟件版本3.6.1（https：//www.r-project.org）用于上述數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床病理資料的分布特征下載TCGA肺腺癌患者表達(dá)譜數(shù)據(jù)，得到513份樣本數(shù)據(jù)。排除臨床特征缺失值較多的患者后，納入下游分析507例TCGA肺腺癌患者，其中T1（171例）、T2（268例）及M0（335例）期患者較多，多數(shù)患者有吸煙史，并大致呈正態(tài)分布。患者臨床特征數(shù)據(jù)，見表1。

表1 TCGA肺腺癌患者的臨床特征Tab.1 Clinical characteristics of TCGA patients with lung adenocarcinoma

2.2 不同成纖維細(xì)胞亞群的基因標(biāo)志物及其在TCGA肺腺癌患者中的浸潤分布特征成纖維細(xì)胞亞群的浸潤分布特征，見圖1?？梢园l(fā)現(xiàn)，不同患者的各成纖維細(xì)胞分布比例具有較大異質(zhì)性，較多患者的整體成纖維細(xì)胞豐度相對較高，較少患者的整體成纖維細(xì)胞豐度相對較低。成纖維細(xì)胞亞群的標(biāo)志基因，見表2。

表2 成纖維細(xì)胞亞群的標(biāo)志性基因Tab.2 Marker genes of fibroblast subpopulations

圖1 6種成纖維細(xì)胞亞群在513例肺腺癌患者中的浸潤分布Fig.1 Infiltration distribution of 6 kinds of fibroblast subpopulations in 513 patients with lung adenocarcinoma

2.3 成纖維細(xì)胞亞群和臨床指標(biāo)的相關(guān)性如圖2，與男性患者相比，第5、6亞群成纖維細(xì)胞更多富集在女性患者（第5亞群P=0.004 6，第6亞群P=0.002 9），這提示不同的激素對成纖維細(xì)胞的浸潤可能有一定的影響。此外，隨著吸煙時(shí)間的延長，腫瘤內(nèi)第6亞群的比例呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢（P＜0.05）。第6亞群的浸潤豐度在早期腫瘤中更高，這表明第6亞群可能抑制了腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展（P＜0.05）。另外，與腫瘤轉(zhuǎn)移患者相比，第1、2亞群顯著富集在未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者（第1亞群P=0.029，第2亞群P=0.021），提示成纖維細(xì)胞可能在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮“柵欄”作用，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖2 成纖維細(xì)胞亞群和臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性Fig.2 Correlation between fibroblast subpopulations and clinicopathological indicators

2.4 成纖維細(xì)胞亞群的預(yù)后價(jià)值 不同成纖維細(xì)胞亞群對患者的預(yù)后影響均不相同，其中第5、7亞群是患者的風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)后因子（第5亞群P＜0.001，第7亞群P＜0.001），第6亞群是患者的保護(hù)性預(yù)后因子（第6亞群P=0.001 4），其他亞群無顯著性差異，無預(yù)后意義，見圖3。

圖3 6種成纖維細(xì)胞亞群在513例肺腺癌患者中的生存曲線Fig.3 Survival curves of 6 kinds of fibroblast subpopulations in 513 patients with lung adenocarcinoma

2.5 第6亞群成纖維細(xì)胞和多種免疫相關(guān)細(xì)胞成分的相關(guān)性第6亞群成纖維細(xì)胞與免疫浸潤評分（r=0.347）、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞評分（r=0.539）、內(nèi)皮細(xì)胞評分（r=0.583）、細(xì)胞毒性因子評分（r=0.131）、中心記憶CD8+T細(xì)胞評分（r=0.104）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（r=-0.489）呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見圖4。

圖4 第6亞群成纖維細(xì)胞和免疫相關(guān)標(biāo)志物的比較Fig.4 Comparison between sixth subgroup fibroblasts and immune-related markers

2.6 成纖維細(xì)胞亞群和免疫治療反應(yīng)標(biāo)志物的相關(guān)性成纖維細(xì)胞亞群和抗原提呈及免疫檢查點(diǎn)標(biāo)志物呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，圖5A、B）。第1亞群和TMB及新抗原克隆數(shù)量呈正相關(guān)（P＜0.05），而第2、6亞群和TMB及新抗原克隆數(shù)量呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；除第2、6亞群外，其他4群和PDL1蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)（P＜0.05，圖5C）。這意味著成纖維細(xì)胞亞群在腫瘤微環(huán)境中的多種免疫過程中發(fā)揮重要作用。

圖5 成纖維細(xì)胞亞群和免疫治療反應(yīng)標(biāo)志物的相關(guān)性Fig.5 Correlation between fibroblast subpopulations and immunotherapy response markers

2.7 成纖維細(xì)胞亞群和免疫治療耐藥評分及腫瘤干性評分的相關(guān)性如圖6，比較了TIDE系統(tǒng)評分及腫瘤干性評分和各個(gè)成纖維細(xì)胞亞群的相關(guān)性。除第6亞群外，其他5群均與免疫治療耐藥評分（P＜0.01）和腫瘤干性評分（P＜0.05）呈正相關(guān)，表明成纖維細(xì)胞亞群可能參與形成了免疫抑制微環(huán)境，以及參與維持腫瘤干性環(huán)境，而第6亞群可能抑制了腫瘤干性微環(huán)境的形成。

圖6 成纖維細(xì)胞亞群和免疫治療耐藥評分及腫瘤干性評分的相關(guān)性Fig.6 Correlation of fibroblast subpopulations with immunotherapy resistance score and tumor stemness score

3 討論

從TCGA數(shù)據(jù)庫下載了肺腺癌患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床病理數(shù)據(jù)，共納入513例患者進(jìn)行分析。在進(jìn)行病理指標(biāo)分析時(shí)，排除了6例含缺失值較多的患者進(jìn)行下游分析。本課題組發(fā)現(xiàn)，肺腺癌中成纖維細(xì)胞亞群參與了腫瘤微環(huán)境中的多種免疫過程［8-9］。不同亞群的成纖維細(xì)胞介導(dǎo)了不同的免疫學(xué)效應(yīng)和腫瘤學(xué)效應(yīng)，具有不同的預(yù)后意義［10］。其中第6亞群（標(biāo)志基因：FIGF、PDPN和PROX1等）與腫瘤的T分期及患者吸煙時(shí)長密切相關(guān)，具有良好的預(yù)后意義。進(jìn)一步結(jié)合免疫相關(guān)細(xì)胞浸潤分析，發(fā)現(xiàn)第6亞群成纖維細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的脈管系統(tǒng)相關(guān)免疫評分（免疫浸潤評分、淋巴內(nèi)皮細(xì)胞評分、內(nèi)皮細(xì)胞評分和中心記憶CD8T細(xì)胞評分）具有顯著正相關(guān)，這意味著它可能促進(jìn)并維持腫瘤免疫微環(huán)境。這促使探究成纖維細(xì)胞亞群是否參與維持了免疫治療耐藥和腫瘤干性［11］。第6亞群細(xì)胞未參與免疫治療耐藥，但是可能抑制了腫瘤干性微環(huán)境的形成，而其他亞群成纖維細(xì)胞均不同程度地介導(dǎo)了免疫治療耐藥并參與維持腫瘤干性微環(huán)境。

既往研究普遍認(rèn)為成纖維細(xì)胞促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的形成，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移［12-13］。然而分析結(jié)果提示肺腺癌中成纖維細(xì)胞亞群有著不同的臨床意義，如第6亞群的高浸潤提示患者預(yù)后更好。鑒于第6亞群成纖維細(xì)胞的特殊臨床意義，發(fā)現(xiàn)它特征性地表達(dá)FIGF基因，即血管內(nèi)皮生長因子D。該生長因子常高表達(dá)于血管生成、淋巴管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長階段，促進(jìn)淋巴管、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并對血管通透性及淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的維持有一定影響［14］。然而血管及淋巴管的生成對腫瘤免疫微環(huán)境的形成有重要作用［15］。進(jìn)一步來說，腫瘤相關(guān)脈管系統(tǒng)的存在促進(jìn)了免疫細(xì)胞的浸潤，為化療及免疫治療的藥物遞送提供途徑，這很可能是癌癥治療新的切入點(diǎn)［16］。結(jié)合第6亞群成纖維細(xì)胞和細(xì)胞毒CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性結(jié)果，可以認(rèn)為第6亞群成纖維細(xì)胞很可能促進(jìn)并維持了瘤內(nèi)脈管系統(tǒng)的功能，其為抗瘤免疫細(xì)胞及藥物進(jìn)入瘤內(nèi)鋪平道路。另外，第6亞群成纖維細(xì)胞和腫瘤干性評分的相關(guān)性結(jié)果提示，腫瘤脈管系統(tǒng)的活躍很可能抑制了腫瘤干性微環(huán)境的形成及維持。而對于其他亞群的成纖維細(xì)胞，類似于既往的研究，結(jié)果表明他們更多地參與了免疫治療耐藥及腫瘤干性的特征維持［17-18］。

總之，本研究強(qiáng)調(diào)了肺腺癌中成纖維細(xì)胞亞群的異質(zhì)性組成，不同類型的成纖維細(xì)胞對患者的預(yù)后及免疫治療效果的影響不同［2］。這突出了精準(zhǔn)治療的必要性：一方面，對于免疫抑制性的成纖維細(xì)胞，通過精準(zhǔn)靶向消除，可以解除它們的免疫抑制作用；另一方面，對于免疫促進(jìn)性的成纖維細(xì)胞，積極采取多種方法提高其在腫瘤微環(huán)境中的權(quán)重，可以為抗瘤免疫細(xì)胞浸潤及藥物遞送開辟途徑?；蛟S促使免疫抑制性的成纖維細(xì)胞向免疫促進(jìn)性的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，是未來的腫瘤治療方向。