王可娜，張 嬌，徐家云

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽(yáng) 471000）

腎缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）是諸多疾病及醫(yī)療過(guò)程如休克、移植等過(guò)程產(chǎn)生的病理生理過(guò)程，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中腎移植過(guò)程中RIRI難以避免，可對(duì)移植腎的早期及遠(yuǎn)期功能帶來(lái)一定影響，嚴(yán)重影響患者預(yù)后[1]。目前，臨床仍缺乏有效治療手段對(duì)RIRI起到完美保護(hù)作用。因此，探尋有效藥物治療RIRI仍是臨床研究熱點(diǎn)。西地那非是5型磷酸二酯酶抑制劑，對(duì)RIRI具有一定保護(hù)作用[2]，但具體作用機(jī)制尚未闡明。研究[3]表明，RIRI主要病理改變是缺血引起的氧化應(yīng)激損傷及腎小管細(xì)胞凋亡。抑制凋亡相關(guān)因子Fas/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Fas/Caspase-8）通路活化可抑制RIRI大鼠腎小管細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡[4]。目前，有關(guān)西地那非對(duì)RIRI的保護(hù)作用是否與調(diào)控Fas/Caspase-8通路有關(guān)少見(jiàn)報(bào)道，因此本研究基于Fas/Caspase-8通路探究西地那非對(duì)RIRI大鼠氧化應(yīng)激及腎小管細(xì)胞凋亡的影響，以期為臨床有效防治RIRI改善腎移植患者預(yù)后提供一定參考。

1 主要材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)SD雄性大鼠（10周齡），體質(zhì)量180～240 g，平均體質(zhì)量（213±27）g，購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0009。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸西地那非，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143255，購(gòu)自廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山制藥總廠；蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，HE）染色試劑盒，購(gòu)自北京百瑞極生物科技有限公司；原位末端標(biāo)記（TdT-mediateddUTPnickandlabeling，TUNEL）試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒，購(gòu)自上海梵態(tài)生物科技有限公司；兔抗鼠凋亡相關(guān)因子Fas、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）及β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體、山羊抗兔HRP二抗，均購(gòu)自上海研卉生物科技有限公司。

Optima?XPN超速離心機(jī)，購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾生物科技有限公司；BD-SW50光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司；MouseDoppler型小動(dòng)物超聲多普勒血流儀，購(gòu)自技爾（上海）商貿(mào)有限公司；Atellica CH930型全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑，購(gòu)自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及模型建立[5]

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及西地那非低、中、高劑量組，每組8只。模型組及西地那非低、中、高劑量組腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，背部皮膚消毒，切開(kāi)腰背筋膜，分離腎周?chē)M織，暴露雙側(cè)腎臟，以無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂血管，45 min后松動(dòng)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾恢復(fù)血流再灌注（以小動(dòng)物超聲血流儀未監(jiān)測(cè)到血流為缺血標(biāo)志，以監(jiān)測(cè)到血流為再灌注成功標(biāo)志），之后逐層縫合皮膚，假手術(shù)組大鼠除不夾閉腎蒂血管外，其余操作同模型組。再灌注后，西地那非低、中、高劑量組立即腹腔注射25 mg·kg-1·d-1、50 mg·kg-1·d-1、75 mg·kg-1·d-1的鹽酸西地那非溶液[6]，連續(xù)2周；假手術(shù)組和模型組同時(shí)間腹腔注射等量生理鹽水。

2.2 標(biāo)本采集

第2周末收集各組24 h尿液標(biāo)本；于末次腹腔注射給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，收集尾靜脈血2 mL。以上所收集的樣本均離心10 min（3 000 r·min-1，離心半徑8 cm），取上清液，保存于-80℃冰箱，用于測(cè)定24 h尿蛋白及血肌酐水平。各組取血結(jié)束后，斷頸處死并取腎臟組織分為兩部分，一部分采用4%多聚甲醛固定，乙醇脫水、透明、石蠟包埋過(guò)夜，連續(xù)切片，厚6 μm，用于HE染色及TUNEL法檢測(cè)；另一部分保存于液氮中，用于氧化應(yīng)激水平測(cè)定及免疫印跡法蛋白檢測(cè)。

2.3 測(cè)定各組腎功能指標(biāo)水平[7]

取2.2尿液及血清標(biāo)本，采用全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑測(cè)定24 h尿蛋白、血清中血肌酐水平。

2.4 HE染色觀察各組腎組織病理學(xué)變化[8]

取2.2各組部分腎臟組織切片，梯度乙醇脫蠟、復(fù)水，之后進(jìn)行HE染色，以中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化，并拍照。

2.5 TUNEL技術(shù)檢測(cè)各組腎小管細(xì)胞凋亡情況[9]

取2.2剩余腎臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS洗滌2遍后，加入末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液處理10 min，37℃加入末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)混合物反應(yīng)1 h，最后加入3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）反應(yīng)顯色，蘇木精復(fù)染，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，細(xì)胞核呈棕色或棕褐色為凋亡細(xì)胞。每高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞數(shù)和腎小管細(xì)胞總數(shù)，取平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），AI=凋亡細(xì)胞數(shù)÷腎小管細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.6 檢測(cè)各組腎組織中氧化應(yīng)激水平[10]

取2.2部分腎臟組織，并制備組織勻漿，離心10 min（3 000 r·min-1，離心半徑8 cm），取上清液，采用比色法測(cè)定SOD活性、MDA含量，采用ELISA法檢測(cè)GSH-px含量，以上操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.7 免疫印跡法檢測(cè)各組腎組織中Fas/Caspase-8通路蛋白水平[11]

取2.2大鼠剩余腎臟組織，制備組織勻漿，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，離心10 min（10 000 r·min-1，離心半徑8 cm）取上清，測(cè)定蛋白總量并取20 μg與等量上樣緩沖液混勻，變性、電泳、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗，之后加入Fas、Caspase-8內(nèi)參及β-actin作為一抗（1:500），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗（1:1 000），37℃ 1.5 h，顯影、定影，按照各基因蛋白條帶灰度值計(jì)算各目標(biāo)基因蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組腎功能指標(biāo)水平比較

見(jiàn)表1。

表1 各組腎功能指標(biāo)水平比較（±s，n= 8）

表1 各組腎功能指標(biāo)水平比較（±s，n= 8）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（mg·kg-1）血肌酐/（μmol·L-1）假手術(shù)組 - 0.28±0.05 35.03±5.26模型組 - 3.95±0.60# 81.59±12.25#西地那非低劑量組 25 2.88±0.45#△ 62.08±9.32#△西地那非中劑量組 50 1.32±0.19#△ 51.17±7.69#△▲西地那非高劑量組 75 0.85±0.13#△▲ 42.37±6.36#△▲□尿蛋白/（mg·d-1）

3.2 各組腎組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組腎臟組織腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組腎臟組織間質(zhì)充血、水腫，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管腫脹且小管上皮細(xì)胞形態(tài)異常，刷狀緣紊亂消失，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的小管上皮細(xì)胞；相比于模型組，西地那非低、中、高劑量組病理?yè)p傷有所減輕，間質(zhì)出血減少，水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，且西地那非劑量越高則上述病理變化越有所改善。見(jiàn)圖1。

圖1 各組腎組織病理學(xué)變化（HE染色，×200）

3.3 各組腎小管細(xì)胞凋亡情況比較

見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組腎小管細(xì)胞凋亡情況比較（HE染色，×200）

表2 各組腎小管細(xì)胞凋亡情況比較（±s，n= 8）

表2 各組腎小管細(xì)胞凋亡情況比較（±s，n= 8）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（mg·kg-1） 細(xì)胞凋亡率/%假手術(shù)組 - 1.91±0.25模型組 - 7.26±1.09#西地那非低劑量組 25 6.01±0.91#△西地那非中劑量組 50 4.97±0.75#△▲西地那非高劑量組 75 2.85±0.43#△▲□

3.4 各組腎組織氧化應(yīng)激水平比較

見(jiàn)表3。

表3 各組腎組織氧化應(yīng)激水平比較（±s，n= 8）

表3 各組腎組織氧化應(yīng)激水平比較（±s，n= 8）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（mg·kg-1） SOD/（mg·L-1） MDA/（nmoL·L-1） GSH-px/（U·L-1）假手術(shù)組 - 7.36±1.11 2.15±0.31 9.27±1.39模型組 - 2.05±0.31# 6.79±1.08# 3.90±0.59#西地那非低劑量組 25 3.16±0.47#△ 5.11±0.77#△ 5.12±0.78#△西地那非中劑量組 50 4.59±0.68#△▲ 4.02±0.60#△▲ 6.85±1.03#△▲西地那非高劑量組 75 6.03±0.91#△▲□ 2.91±0.45#△▲□ 7.95±1.18#△▲□

3.5 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較

見(jiàn)圖3、表4。

表4 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較（±s，n= 8）

表4 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較（±s，n= 8）

注：與假手術(shù)組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西地那非低劑量組比較，▲P＜0.05；與西地那非中劑量組比較，□P＜0.05

組別 Dose/（μg·mL-1） Fas Caspase-8假手術(shù)組 - 0.19±0.03 0.33±0.05模型組 - 1.06±0.16# 1.15±0.18#西地那非低劑量組 25 0.87±0.14#△ 0.87±0.15#△西地那非中劑量組 50 0.53±0.08#△▲ 0.65±0.09#△▲西地那非高劑量組 75 0.28±0.05#△▲□0.43±0.07#△▲□

圖3 各組腎組織Fas/Caspase-8通路蛋白水平比較

4 討論

血肌酐是人體肌肉代謝產(chǎn)物，其濃度變化能反映腎小球?yàn)V過(guò)率，濾過(guò)能力下降，則血肌酐濃度升高。腎功能損傷的關(guān)鍵因素之一是分泌大量尿蛋白，其中24 h尿蛋白檢測(cè)是測(cè)驗(yàn)?zāi)虻鞍椎挠行Х绞絒12]。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平均升高，但經(jīng)低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠24 h尿蛋白、血肌酐水平降低。說(shuō)明西地那非對(duì)RIRI腎功能具有一定保護(hù)作用。

病理狀態(tài)下氧自由基生成-清除平衡被破壞，細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低，細(xì)胞結(jié)構(gòu)收到破壞，生成大量MDA，檢測(cè)細(xì)胞外SOD活性和MDA含量可以反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度[13-14]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎組織SOD、GSH-px水平降低，MDA水平升高，當(dāng)經(jīng)低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠腎組織SOD、GSH-px水平升高，MDA水平降低。說(shuō)明西地那非能夠?qū)IRI發(fā)揮保護(hù)作用，可能與抑制腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

腎小管細(xì)胞凋亡在RIRI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎小管細(xì)胞AI水平升高，當(dāng)經(jīng)低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠腎小管細(xì)胞AI水平降低。說(shuō)明西地那非能夠?qū)IRI發(fā)揮保護(hù)作用，可能與抑制腎小管細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

氧化應(yīng)激在細(xì)胞凋亡中有重要作用，研究[15]表明，活性氧簇可以促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Fas，進(jìn)而激活Caspase-8，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。抑制Fas/Caspase-8通路活化可對(duì)RIRI發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組腎組織Fas、Caspase-8蛋白水平升高，但經(jīng)低、中、高劑量西地那非藥物處理后，大鼠腎組織Fas、Caspase-8蛋白水平降低。說(shuō)明西地那非可能通過(guò)抑制RIRI大鼠腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制Fas/Caspase-8通路活化，進(jìn)而抑制腎小管細(xì)胞凋亡，對(duì)RIRI發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，西地那非對(duì)RIRI大鼠腎臟發(fā)揮保護(hù)作用，可能是通過(guò)抑制RIRI大鼠腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制Fas/Caspase-8通路活化，進(jìn)而抑制腎小管細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。本研究可為有效防治RIRI并改善腎移植患者預(yù)后提供一定理論依據(jù)，然而本研究并未能明確西地那非對(duì)Fas/Caspase-8通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進(jìn)行深入探討。