李名武， 王勤志， 孫法瑞

（鄂東醫(yī)療集團(tuán)市 黃石市中心醫(yī)院 湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，湖北 黃石 435000）

骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年人群，隨著治療方法的不斷改進(jìn)，患者生存率有所提高[1]，但由于骨肉瘤的侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高、易早期發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移，使得患者總體預(yù)后仍然較差[2]。黏蛋白16（mucin 16，MUC16）是黏蛋白家族成員，在上皮保護(hù)和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，與信號(hào)通路傳導(dǎo)調(diào)控及免疫應(yīng)答關(guān)系密切[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，MUC16參與了卵巢癌[4]、膽囊癌[5]、子宮內(nèi)膜癌[6]、肺癌[7]等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。然而，關(guān)于MUC16與骨肉瘤關(guān)系的研究較少。為此，本研究擬探討MUC16對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖和侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS購(gòu)自上海通派生物科技有限公司，McCoy's 5A培養(yǎng)液購(gòu)自上海研生生物技術(shù)科技有限公司，胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。MUC16干擾序列和對(duì)照序列由上海美軒生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和Trizol提取試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，MUC16和內(nèi)參引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成。噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司，二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。兔抗人MUC16單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗人上皮型鈣黏蛋白（epithelial-cadherin，E-Cad）多克隆抗體、兔抗人神經(jīng)型鈣黏蛋白（neuropathic-cadherin，N-Cad）單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。StepOne實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，DP-6100型酶標(biāo)儀購(gòu)自北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)U2OS細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，接種于6孔板，密度為2.5×106/孔，待細(xì)胞融合度為80%以上時(shí)，按Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染。（1）sh-MUC16組：轉(zhuǎn)染MUC16干擾序列sh-1（5'-ACAGCAGCATCAAGAGTTATT-3'）、si-2（5'-GGAGCAAGTCTTTCTAGATAA-3'）；（2）sh-Control組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列（5'-GGAATCTCATTCGATGCATAC-3'）；（3）空白組：不作任何處理。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MUC16 mRNA表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細(xì)胞，胰蛋白酶消化，加入細(xì)胞裂解液，采用Trizol提取試劑提取總RNA，采用UV-1801紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）檢測(cè)純度和濃度，以吸光度（A）260nm/A280nm比值＞1.80為合格。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，36個(gè)循環(huán)；74 ℃延長(zhǎng)3 min。每份樣本設(shè)6個(gè)復(fù)孔。MUC16上游引物為5'-ACATCAACTCCTGCCTTCCCAGAA- 3'，下游引物為5'-ACCAGTGGGCATTCCAGAAAGAGA-3'；β-actin上游引物為5'-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3'，下游引物為5'-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 U2OS細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用MTT法檢測(cè)U2OS細(xì)胞增殖活性。取各組U2OS細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種于96孔板，密度為5 000個(gè)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12、24、48、72和96 h時(shí)每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，充分振蕩5 min，使結(jié)晶充分溶解后，采用DP-6100型酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處的A值。重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細(xì)胞，胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，離心取沉淀，用不含血清的培養(yǎng)液重懸，取200 μL（約1×105個(gè)細(xì)胞）置于Transwell小室的上室，下室加入含血清的完全培養(yǎng)液600 μL，培養(yǎng)24 h，去除散落細(xì)胞，用甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用CKX53型顯微鏡（日本 OLYMPUS公司）觀察，隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取基質(zhì)膠50 μL，稀釋后均勻涂抹在Transwell小室上室，過(guò)夜風(fēng)干備用。其他實(shí)驗(yàn)步驟同“細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)”。

1.2.6 U2OS細(xì)胞MUC16、E-Cad和N-Cad表達(dá) 采用免疫印跡法檢測(cè)U2OS細(xì)胞的蛋白表達(dá)。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U2OS細(xì)胞，胰蛋白酶消化，收集U2OS細(xì)胞并置于裂解液中，提取總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量測(cè)定。取50 μg總蛋白，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉60 min，分別加入兔抗人MUC16單克隆抗體（1∶500稀釋）、兔抗人E-Cad多克隆抗體（1∶1 000稀釋）、兔抗人N-Cad單克隆抗體（1∶800稀釋），4 ℃過(guò)夜孵育，三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液沖洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗（青島捷世康生物科技有限公司），室溫孵育120 min，采用化學(xué)發(fā)光法顯影，采用Image J圖像分析軟件（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）進(jìn)行分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參蛋白，計(jì)算MUC16、E-Cad和N-Cad的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組MUC16 mRNA表達(dá)比較

sh-MUC16組、sh-Control組和空白組之間MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=106.005，P＜0.001）。sh-MUC16組MUC16 mRNA相對(duì)表達(dá)量（0.33±0.09）顯著低于sh-Control組（1.03±0.12）和空白組（1.00±0.07）（P＜0.05），而sh-Control組與空白組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞增殖活性比較

sh-MUC16組培養(yǎng)24、48、72和96 h細(xì)胞增殖活性（A值）低于sh-Control組和空白組（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性（A值）比較

圖1 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖活性（A值）比較

2.3 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較

sh-MUC16組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖2和圖3。

表2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

圖2 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞遷移情況（×200）

圖3 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組細(xì)胞侵襲情況（×200）

2.4 sh-MUC16組、sh-Control組和空白組MUC16、E-Cad和N-Cad表達(dá)比較

sh-MUC16組MUC16和N-Cad相對(duì)表達(dá)量均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），E-Cad相對(duì)表達(dá)量高于sh-Control組和空白組（P＜0.05）。sh-Control組與空白組之間MUC16、E-Cad和N-cad相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3、圖4。

表3 3個(gè)組MUC16、E-Cad和N-Cad相對(duì)表達(dá)量比較

圖4 3個(gè)組MUC16、E-Cad和N-Cad表達(dá)免疫印跡圖

3 討論

骨肉瘤是一種起源于間充質(zhì)細(xì)胞的惡性腫瘤，臨床目前以手術(shù)切除輔以化療的綜合治療方案為主，但復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率高[8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從分子生物學(xué)角度尋找與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的敏感基因，為腫瘤的早期診療及改善預(yù)后提供了新的方向。

黏蛋白作為一種高相對(duì)分子質(zhì)量、高度糖基化的蛋白，參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展，且與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[9]。MUC16蛋白是黏蛋白家族中最大的一種，定位于人染色體19p13.2，其陽(yáng)性表達(dá)可促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生，與膽囊癌的惡性程度和浸潤(rùn)程度密切相關(guān)，可作為膽囊癌的標(biāo)志物[10]。另外，MUC16還與多種腫瘤相關(guān)，可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[11]，也可作為卵巢癌重要的免疫治療靶基因[12]。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染干擾序列的方法特異性沉默U2OS細(xì)胞中MUC16基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，sh-MUC16組MUC16 mRNA和蛋白表達(dá)量均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說(shuō)明sh-MUC16組MUC16表達(dá)被成功抑制。有研究結(jié)果顯示，MUC16過(guò)表達(dá)可賦予上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞抗凋亡的能力[13]。本研究結(jié)果顯示，sh-MUC16組培養(yǎng)24、48、72和96 h細(xì)胞增殖活性低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說(shuō)明沉默U2OS細(xì)胞的MUC16基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖活性，提示MUC16可能參與了骨肉瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程。KANWAL等[14]發(fā)現(xiàn)，MUC16基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，sh-MUC16組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說(shuō)明沉默U2OS細(xì)胞中的MUC16基因表達(dá)可抑制細(xì)胞遷移和侵襲，提示MUC16與骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)。

目前，關(guān)于MUC16參與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究較多。SHEN等[15]的研究結(jié)果顯示，MUC16通過(guò)Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化介導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2表達(dá)增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。李新等[16]的研究結(jié)果表明，MUC16通過(guò)磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路調(diào)節(jié)膽囊癌細(xì)胞的增殖和遷移。MUC16的C'端通過(guò)與β-連環(huán)蛋白的相互作用激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[17]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在骨肉瘤細(xì)胞的增殖、侵襲中發(fā)揮了重要作用[18]，而在這個(gè)過(guò)程中，上皮標(biāo)志物E-Cad表達(dá)減少，間充質(zhì)標(biāo)志物N-Cad表達(dá)增多，從而使骨肉瘤細(xì)胞的遷移能力更強(qiáng)[19]。本研究結(jié)果顯示，sh-MUC16組N-Cad相對(duì)表達(dá)量低于sh-Control組和空白組（P＜0.05），而E-Cad相對(duì)表達(dá)量高于sh-Control組和空白組（P＜0.05），說(shuō)明沉默U2OS細(xì)胞中的MUC16基因表達(dá)可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

本研究尚有不足之處：（1）未設(shè)計(jì)干擾后恢復(fù)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)；（2）僅選用了1株細(xì)胞，未用第2株骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證；（3）未深入探討MUC16的具體作用過(guò)程及涉及的信號(hào)通路。下一階段將開展多株骨肉瘤細(xì)胞的研究，同時(shí)對(duì)可能涉及的機(jī)制開展進(jìn)一步的驗(yàn)證性研究。

綜上所述，沉默U2OS細(xì)胞中的MUC16基因表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖活性，減少細(xì)胞遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。