鮑 蕓， 權(quán) 靜， 張芃胤， 肖艷群

（上海市臨床檢驗(yàn)中心臨床細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究室，上海 200126）

載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）為一種多態(tài)性蛋白，是低密度脂蛋白受體的配體，在膽固醇和三酰甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存和代謝過程中發(fā)揮著重要作用。ApoE基因分型與人體的血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平密切相關(guān)，不同基因型與高血脂、心血管疾病和阿爾茨海默病的患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，對他汀類藥物的降脂效果也有一定的影響。人體內(nèi)存在的3種ApoE蛋白異構(gòu)體（E2、E3和E4）是由2個(gè)常見的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)rs429358和rs7412共同決定的，這2個(gè)位點(diǎn)的堿基變化產(chǎn)生了ε2、ε3、ε4等位基因型[1]，其對應(yīng)的蛋白異構(gòu)體分別為E2、E3和E4。ε2、ε3和ε4等位基因在中國人群中的分布頻率分別為9.5%、69.9%和15.5%[2]。

有研究結(jié)果表明，E2/E2基因型的高血脂患者服用普伐他汀降脂效果更好[3]。在中國人群中，E2基因型高血脂患者對阿托伐他汀和瑞舒伐他汀更敏感，用藥后血清總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白膽固醇水平下降更明顯[4-6]。E3攜帶者是對他汀類藥物藥效最不敏感的個(gè)體[7]。個(gè)體化藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫PharmGKB（Pharmacogenomics Knowledge for Personalized Medicine）中將ApoE檢測定為2A級，屬于藥物使用前強(qiáng)烈建議檢測的位點(diǎn)[8]。由此可見，ApoE基因分型對指導(dǎo)個(gè)體化用藥有積極的作用。

目前，我國批準(zhǔn)上市的ApoE基因檢測試劑盒有7種，檢測方法主要涉及熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）和基因芯片，臨床實(shí)驗(yàn)室已逐步開展該項(xiàng)目的檢測。檢測過程中涉及到血液基因組DNA純化、特異性PCR擴(kuò)增、片段雜交、結(jié)果分析判定等，任一環(huán)節(jié)均會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。錯(cuò)誤的基因分型結(jié)果會影響臨床正確選擇和使用他汀類藥物，降低療效，甚至危及患者生命。為評估臨床實(shí)驗(yàn)室ApoE基因檢測能力，保證基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究將基因組DNA作為質(zhì)控品，開展ApoE基因分型檢測項(xiàng)目的室間質(zhì)量評價(jià)（簡稱室間質(zhì)評）計(jì)劃，以進(jìn)一步提高臨床實(shí)驗(yàn)室該項(xiàng)目的檢測質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2020年上海市臨床檢驗(yàn)中心ApoE基因檢測室間質(zhì)評計(jì)劃（2次）參評實(shí)驗(yàn)室為36家，其中上海地區(qū)25家（公立醫(yī)療機(jī)構(gòu)16家，第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室9家），其他地區(qū)11家（公立醫(yī)療機(jī)構(gòu)6家，第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室5家）。

1.2 方法

1.2.1 室間質(zhì)評物品盤準(zhǔn)備 用血液基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取人外周血基因組DNA。使用Sanger測序法（由武漢華因康基因科技有限公司完成）檢測ApoE基因rs429358和rs7412位點(diǎn)基因型，確定各基因組DNA相應(yīng)位點(diǎn)的型別（野生型和不同的突變型），盡量涵蓋所有人群基因類型。制備5份能力驗(yàn)證物品，其中2份分型結(jié)果一致，其余3份為不同分型物品。用NanDrop超微量紫外可見光分光光度計(jì)（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測基因組DNA的濃度和純度，用TE緩沖液溶解，濃度約為50 ng/μL，按照每支50 μL分裝成5支后，-20 ℃保存（不超過9個(gè)月）。5支物品隨機(jī)編碼后，通過冷鏈發(fā)送至各參評實(shí)驗(yàn)室。要求參評實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)間內(nèi)按照常規(guī)物品檢測流程進(jìn)行檢測，并將結(jié)果通過網(wǎng)絡(luò)上報(bào)至上海市臨床檢驗(yàn)中心數(shù)據(jù)庫。

1.2.2ApoE基因分型檢測室間質(zhì)評物品性能評價(jià) （1）均一性評價(jià)。參照《CNAS-GL003：2018 能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價(jià)指南》[9]要求，在第1次室間質(zhì)評前，從制備好的能力驗(yàn)證物品中選取1個(gè)批號，隨機(jī)抽取10個(gè)室間質(zhì)評物品，采用ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ThermoFisher Scientific公司）和ApoE基因分型試劑盒（武漢友芝友公司）檢測，每個(gè)物品重復(fù)檢測2次。（2）穩(wěn)定性評價(jià)。在每次室間質(zhì)評物品分發(fā)的同時(shí)，進(jìn)行同步穩(wěn)定性評價(jià)。選取3支同一批號的室間質(zhì)評物品，采用ApoE基因分型試劑盒檢測，每支重復(fù)檢測2次。

1.2.3 室間質(zhì)評結(jié)果評價(jià)與分析 依據(jù)回報(bào)結(jié)果計(jì)算各參評實(shí)驗(yàn)室的得分情況。將2個(gè)SNP位點(diǎn)檢測基因型和根據(jù)基因型判定的分型結(jié)果與預(yù)期相符的百分率計(jì)為該實(shí)驗(yàn)室本次室間質(zhì)評成績。≥80分判定為室間質(zhì)評成績合格。同時(shí)，計(jì)算總體符合率和不同檢測方法的符合率，并與實(shí)驗(yàn)室溝通，分析錯(cuò)誤檢測結(jié)果的原因。

2 結(jié)果

2.1 室間質(zhì)評物品驗(yàn)證結(jié)果

2020年室間質(zhì)評物品2個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型測序結(jié)果見圖1。2次室間質(zhì)評物品盤構(gòu)成及預(yù)期結(jié)果見表1。

圖1 室間質(zhì)評物品Sanger測序檢測圖譜

表1 2020年室間質(zhì)評物品盤構(gòu)成和檢測符合率

采用熒光PCR分析室間質(zhì)評物品的均一性和穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，均一性和穩(wěn)定性檢測結(jié)果與預(yù)期基因分型結(jié)果一致，符合率為100%，室間質(zhì)評物品均一性和同步穩(wěn)定性滿足要求。

2.2 ApoE基因分型檢測總體回報(bào)情況

2020年ApoE基因檢測室間質(zhì)評計(jì)劃參評實(shí)驗(yàn)室為36家，2次室間質(zhì)評收到的有效回報(bào)結(jié)果分別為32份和31份。2次室間質(zhì)評活動中，參評實(shí)驗(yàn)室主要采用熒光PCR法、基因雜交法和Sanger測序法檢測，分別占75%（24/32）和18.75%（6/32）、6.25%（2/32）和67.74%（21/31）、25.81%（8/31）和6.45%（2/31）。

2.3 參評實(shí)驗(yàn)室檢測能力評價(jià)結(jié)果

2020年2次室間質(zhì)評中，結(jié)果回報(bào)完全正確的實(shí)驗(yàn)室分別占93.75%（30/32）和100.00%（31/31），總體檢測符合率分別為99.38%（318/320）和100.00%（310/310），基因分型判定總體符合率分別為97.5%（156/160）和100.00%（155/155）。錯(cuò)誤回報(bào)結(jié)果主要發(fā)生在第1次室間質(zhì)評中，有1家實(shí)驗(yàn)室成績?yōu)?0～99分，1家實(shí)驗(yàn)室成績不合格（＜80分）。錯(cuò)誤結(jié)果包含2個(gè)SNP檢測錯(cuò)誤和4個(gè)基因分型結(jié)果判斷錯(cuò)誤。第2次室間質(zhì)評物品檢測總符合率為100.00%，且分型結(jié)果判斷全部正確。

2次室間質(zhì)評各檢測方法的檢測效能比較結(jié)果顯示，基因雜交法和Sanger測序法檢測符合率均為100.00%，錯(cuò)誤結(jié)果均發(fā)生在使用熒光PCR法的實(shí)驗(yàn)室。2次室間質(zhì)評活動中熒光PCR敏感性分別為98.18%和100.00%，特異性均為100.00%。見表2。

表2 不同檢測方法參評實(shí)驗(yàn)室評價(jià)結(jié)果 家

3 討論

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出和推廣，越來越多的個(gè)體化藥學(xué)基因檢測項(xiàng)目被應(yīng)用于臨床，大大提高了特定藥物的療效，并減少了藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。本研究通過組織實(shí)施ApoE基因分型檢測室間質(zhì)評計(jì)劃，對臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目檢測質(zhì)量進(jìn)行了比較全面的評估，結(jié)果顯示，2次室間質(zhì)評中成績滿分的實(shí)驗(yàn)室分別占93.75%和100.00%，提示參評實(shí)驗(yàn)室總體檢測準(zhǔn)確率較高。2次室間質(zhì)評中，2個(gè)SNP檢測錯(cuò)誤和4個(gè)基因分型結(jié)果判斷錯(cuò)誤均出現(xiàn)在第1次室間質(zhì)評中，分別來自2家實(shí)驗(yàn)室，1家實(shí)驗(yàn)室因2例SNP檢測錯(cuò)誤直接導(dǎo)致2例基因分型結(jié)果判斷錯(cuò)誤，該實(shí)驗(yàn)室所用試劑不是商品化試劑，其使用的熒光PCR是實(shí)驗(yàn)室自建方法（laboratory developed test，LDT）。與實(shí)驗(yàn)室溝通后，分析其錯(cuò)誤原因可能為其LDT所使用的檢測試劑性能不穩(wěn)定，且未完成方法學(xué)確認(rèn)。建議開展LDT檢測的實(shí)驗(yàn)室從準(zhǔn)確性、精確性、參考區(qū)間、可報(bào)告范圍、分析敏感性和特異性等方面完成方法學(xué)性能確認(rèn)[9-10]，日常檢測中嚴(yán)格按照LDT的標(biāo)準(zhǔn)操作程序操作，并做好室內(nèi)質(zhì)控，以保證檢測質(zhì)量；另1家實(shí)驗(yàn)室為2個(gè)SNP檢測均正確，但基因分型結(jié)果判定錯(cuò)誤。

2次室間質(zhì)評不僅可考察了實(shí)驗(yàn)室正確檢測物品中的變異的能力，還評價(jià)了實(shí)驗(yàn)室根據(jù)2個(gè)SNP檢測結(jié)果判斷ApoE分型的遺傳學(xué)分析能力。ApoE基因分型結(jié)果判定是依據(jù)2個(gè)SNP位點(diǎn)（rs429358和rs7412）的檢測結(jié)果，SNP檢測結(jié)果與基因分型對應(yīng)關(guān)系明確，對生物信息學(xué)分析能力的要求相對較低，推測實(shí)驗(yàn)室錯(cuò)誤結(jié)果主要原因是檢測人員對該項(xiàng)目相關(guān)人類遺傳學(xué)理論知識有所欠缺，提示部分實(shí)驗(yàn)室檢測人員遺傳學(xué)分析能力不足，這也是實(shí)驗(yàn)室比較薄弱的環(huán)節(jié)之一。

需要指出的是，在第1次室間質(zhì)評中出現(xiàn)錯(cuò)誤的2家實(shí)驗(yàn)室在后續(xù)室間質(zhì)評中物品檢測和結(jié)果分析全部正確，成績均為滿分。提示實(shí)驗(yàn)室通過參加室間質(zhì)評計(jì)劃能夠發(fā)現(xiàn)日常檢測中的問題，通過有針對性的分析和內(nèi)部整改，達(dá)到改進(jìn)質(zhì)量、提高檢測水平的目的。

上海市臨床檢驗(yàn)中心在我國首次開展了ApoE基因分型檢測室間質(zhì)量評價(jià)計(jì)劃，該計(jì)劃可客觀評價(jià)臨床實(shí)驗(yàn)室ApoE基因檢測質(zhì)量，為幫助臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)和提高基因分型檢測能力，指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥提供了有力的保障。