孫江漫， 孟祥兆， 李 敏， 邵 燕， 于洪遠(yuǎn)

（北京航天總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100076）

尿酸作為抗氧化劑，占人體生物體液總抗氧化能力的50%。當(dāng)存在于細(xì)胞質(zhì)或動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的酸性/疏水環(huán)境中時(shí)，尿酸會(huì)轉(zhuǎn)化為促氧化劑，促進(jìn)氧化應(yīng)激，并通過(guò)這種機(jī)制參與人類(lèi)疾病的病理生理過(guò)程。尿酸對(duì)腎臟的影響包括腎結(jié)石和腫瘤溶解情況下的急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。有研究發(fā)現(xiàn)，血清尿酸水平升高與心血管疾病之間也存在關(guān)聯(lián)，包括冠心?。╟oronary heart disease，CHD）、中風(fēng)、充血性心力衰竭、動(dòng)脈高血壓、心房顫動(dòng)，以及因心血管疾病導(dǎo)致的死亡風(fēng)險(xiǎn)增加；尿酸升高與心血管疾病、代謝綜合征、胰島素抵抗、肥胖、非酒精性脂肪肝和慢性腎病也存在關(guān)聯(lián)[1]。尿酸的測(cè)定方法有磷鎢酸法、尿酸酶法、高效液相色譜-質(zhì)譜法。目前，臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)定尿酸主要采用酶法，特異性高、操作較簡(jiǎn)單。酶法又分為紫外分光光度法和酶偶聯(lián)法。本研究擬對(duì)美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)會(huì)（American Association for Clinical Chemistry，AACC）推薦的血清尿酸參考測(cè)量程序（簡(jiǎn)稱(chēng)參考方法）進(jìn)行優(yōu)化，以期為尿酸常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)的建立和溯源提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本

收集4 0份無(wú)溶血、黃疸、乳糜的臨床剩余單人份血清（尿酸濃度為166.81～1 089.61 μmol/L），用于方法學(xué)比較。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)品SRM 913b（99.8%±0.2%），正確度驗(yàn)證采用標(biāo)準(zhǔn)品SRM 909C[（278.57±5.95）μmol/L]和國(guó)際比對(duì)樣本RELA20B、RELA21A。

1.2 主要儀器和試劑

carry100紫外可見(jiàn)分光光度儀（美國(guó)安捷倫公司）、ARCHITECT c16000全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)雅培公司）及配套尿酸檢測(cè)試劑（16043UN20）、校準(zhǔn)品（50078FD01）和多項(xiàng)定標(biāo)液（50078FD01）；美國(guó)sigma公司Trisbase（T1503）、Tris-HCl（T3253）、三氯乙酸（T9159）、碳酸鋰（62470），北京阿匹斯公司牛血清白蛋白（AC0012B）、瑞士Roche公司尿酸酶（10828475）。

1.3 方法

1.3.1 尿酸參考方法的建立 按照AACC推薦的尿酸酶法，并參考文獻(xiàn)[2-3]建立血清尿酸測(cè)定參考方法，其原理是尿酸酶可特異性地水解尿酸，生成尿囊素，尿酸在293 nm處有特征性的吸收峰，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度的變化測(cè)量樣本中的尿酸含量。操作流程：（1）將0.5 mL樣本、2.5 mL Tris-buffer置于15 mL離心管，在測(cè)試管中加入1 mL 0.1 U/L尿酸酶，（37±1）℃水浴60 min；（2）在測(cè)試管中加入2 mL 10%三氯乙酸，空白管中加入3 mL 10%三氯乙酸-尿酸酶，放置45 min；（3）將測(cè)試管和空白管以1 200×g離心40 min，取上清液，測(cè)定293 nm處吸光度值。

1.3.2 尿酸參考方法的優(yōu)化 對(duì)建立的尿酸參考方法進(jìn)行優(yōu)化，將最終的反應(yīng)液以1 200 ×g離心40 min，收集上清，移至新的離心管，再次離心15 min，以更徹底地去除干擾。

1.3.3 正確度驗(yàn)證 采用SRM909C和國(guó)際比對(duì)樣本RELA20B、RELA21A進(jìn)行正確度驗(yàn)證。

1.3.4 精密度驗(yàn)證 留取高值（701.45 μmol/L）、中值（424.22 μmol/L）、低值（221.34 μmol/L）臨床剩余血清樣本，每個(gè)濃度值每天測(cè)定5次，連續(xù)5 d。

1.3.5 線性評(píng)估 參考方法的線性范圍為119.05～1 190.48 μmol/L，留取接近線性范圍的高值（1 091.67 μmol/L）、低值（144.05 μmol/L）臨床混合血清樣本，按照1L、0.8L∶0.2H、0.6L∶0.4H、0.4L∶0.6H、0.2L∶0.8H、1H的方式配置6個(gè)濃度梯度，計(jì)算各濃度梯度的理論濃度。

1.3.6 方法學(xué)比對(duì) 采用優(yōu)化后的參考方法和臨床常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)[c16000全自動(dòng)生化分析儀及配套尿酸檢測(cè)試劑（16043UN20）、校準(zhǔn)品]同時(shí)測(cè)量40份單人份臨床剩余血清樣本。比較2種方法檢測(cè)結(jié)果。（1）參考美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP9-A3文件[4]，將參考方法作為參比方法，計(jì)算常規(guī)方法與參考方法的偏差，以參考方法測(cè)定結(jié)果為X軸，以2種方法的偏差為Y軸，繪制偏差圖，觀察2種方法偏差趨勢(shì)。（2）根據(jù)CLSI EP9-A3文件，采用廣義極端學(xué)生化偏差（extreme studentized deviate，ESD）法進(jìn)行離群值檢驗(yàn)。（3）根據(jù)偏差圖建立回歸分析模型，計(jì)算斜率、截距、相關(guān)系數(shù)、95%可信區(qū)間（confidence interval，CI），預(yù)估醫(yī)學(xué)決定水平處的偏移，觀察其是否在臨床可接受范圍內(nèi)。

1.3.7 互換性評(píng)價(jià) 根據(jù)CLSI EP14-A3文件要求[5]，采用參考方法和臨床常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)同時(shí)測(cè)量40份單人份臨床剩余血清樣本，常規(guī)方法使用的校準(zhǔn)品穿插其中，繪制偏差圖，若2種方法測(cè)定結(jié)果的偏差恒定，則進(jìn)行Deming回歸；若偏差隨濃度增加，則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。以參考方法為參比系統(tǒng)，95%預(yù)測(cè)區(qū)間為判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，對(duì)常規(guī)方法使用的校準(zhǔn)品進(jìn)行互換性分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MedCalc軟件進(jìn)行離群值檢測(cè)和passing-bablok回歸分析，采用Excel 2019軟件進(jìn)行Deming回歸分析和配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 正確度驗(yàn)證結(jié)果

尿酸參考方法優(yōu)化前后測(cè)定SRM 909C、RELA20B、RELA21A的結(jié)果均在國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）等效限范圍內(nèi)（±3.25%），且SRM909C優(yōu)化前后的測(cè)量結(jié)果均在證書(shū)范圍內(nèi)[（278.57±5.95）μmol/L]。見(jiàn)表1。

表1 正確度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 精密度驗(yàn)證結(jié)果

優(yōu)化后的尿酸參考方法的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度均有所提高，優(yōu)化前的重復(fù)性[變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為0.19%～1.46%，優(yōu)化前低值樣本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性精密度＞2%。優(yōu)化后的重復(fù)性（CV）明顯提高（0.05%～0.31%）。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度雖然改善不明顯，但其低值精密度有很大改善，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)室對(duì)精密度的要求（CV＜2%）。見(jiàn)表2、表3。

表2 優(yōu)化前后重復(fù)性（CV）結(jié)果 %

表3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.3 線性評(píng)估結(jié)果

優(yōu)化前后的測(cè)量結(jié)果無(wú)明顯差異（P=0.76）。優(yōu)化前的線性相關(guān)方程為Y=1.01X-0.08（R2=0.999 6），優(yōu)化后的線性相關(guān)方程為Y=1.00X+0.01（R2=0.999 9），優(yōu)化后的線性相關(guān)性更好，斜率更接近1，截距更接近0。

2.4 方法學(xué)比對(duì)結(jié)果

2.4.1 常規(guī)方法與參考方法的偏差 常規(guī)方法與參考方法之間差異的變化與濃度成比例，即2種方法間的差異為恒定CV，需對(duì)常規(guī)方法和參考方法進(jìn)行passing-bablok回歸分析。2種方法偏差圖見(jiàn)圖1。

圖1 常規(guī)方法與參考方法的偏差圖

2.4.2 離群值檢測(cè)結(jié)果 采用MedCalc軟件對(duì)2種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，結(jié)果顯示無(wú)離群值，且服從正態(tài)分布。見(jiàn)圖2。

圖2 常規(guī)方法和參考方法百分比差值正態(tài)分布圖

2.4.3 回歸分析結(jié)果 常規(guī)方法和參考方法passing-bablok回歸分析結(jié)果顯示，常規(guī)方法在醫(yī)學(xué)決定水平110、480、640 μmol/L處的預(yù)期偏移分別是-15.86%、-2.03%、-1.01%，其中110 μmol/L處的偏移超過(guò)臨床可接受范圍（4.50%）[7]，且隨樣本濃度的增大而減小。見(jiàn)圖3。

圖3 常規(guī)方法與參考方法的Passing- bablok回歸分析

2.5 互換性評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)CLSI EP14-A3文件要求，通過(guò)40份單人份臨床剩余血清樣本對(duì)常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)中使用的校準(zhǔn)品進(jìn)行互換性分析，結(jié)果顯示，2種方法測(cè)定結(jié)果的偏差為恒定CV，即差異隨濃度而變化，需對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行互換性分析。校準(zhǔn)品1和2均超出95%可信區(qū)間，其在參考方法和常規(guī)方法中沒(méi)有互換性。見(jiàn)圖4。

圖4 常規(guī)方法校準(zhǔn)品互換性分析

3 討論

隨著全自動(dòng)化生化分析儀和相關(guān)檢測(cè)試劑的多樣化發(fā)展，臨床實(shí)驗(yàn)室相關(guān)項(xiàng)目的檢測(cè)效率和精密度都有所提高。但是由于系統(tǒng)的多樣性、系統(tǒng)組合的隨意性，以及部分臨床實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有注意校準(zhǔn)的溯源性，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的差異越來(lái)越大。檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化是實(shí)現(xiàn)不同實(shí)驗(yàn)室相同項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可比的最有效的措施，量值溯源是實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的重要方法之一。國(guó)際組織一般通過(guò)建立參考方法、研制參考物質(zhì)和一致性方案來(lái)解決量值溯源的問(wèn)題[8]。本研究通過(guò)優(yōu)化血清尿酸參考方法，并與常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)，為尿酸常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)的建立和溯源提供參考。

本研究分析了國(guó)際一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM909C和國(guó)際比對(duì)樣本RELA20B、RELA21A的尿酸測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的尿酸參考方法不會(huì)導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不正確，且優(yōu)化后的重復(fù)性有明顯提高，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度也有所改善，其中低值樣本的精密度達(dá)到了實(shí)驗(yàn)室的要求（CV＜2%）；優(yōu)化后的線性相關(guān)性更好；提示優(yōu)化后的尿酸參考方法對(duì)正確度無(wú)影響，且有更好的精密度和線性相關(guān)性。

CLSI推出的新版EP9-A3文件是臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)和偏移評(píng)估的重要指南。本研究參考CLSI EP9-A3文件對(duì)優(yōu)化后的參考方法與常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行方法學(xué)比對(duì)，結(jié)果顯示，在110 μmol/L處的預(yù)期偏移為-15.86%，明顯超過(guò)尿酸的臨床可接受范圍（4.5%），原因可能是參考方法的線性范圍為119～1 190 μmol/L，無(wú)法與常規(guī)方法線性范圍（55.92～1 970.24 μmol/L）重疊，即沒(méi)有覆蓋醫(yī)學(xué)決定水平低值（110 μmol/L），無(wú)法對(duì)常規(guī)測(cè)量系統(tǒng)低值樣本進(jìn)行比較。另外，本研究參考EP14-A3文件對(duì)常規(guī)方法使用的校準(zhǔn)品進(jìn)行了互換性分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)濃度水平的校準(zhǔn)品在2種方法之間沒(méi)有互換性，這可能也是醫(yī)學(xué)決定水平低值樣本的預(yù)期偏移較大的原因；還有可能是2種方法的檢測(cè)原理略有不同，參考方法的原理是尿酸酶可特異性地將尿酸水解，生成尿囊素，尿酸在293 nm處有特征吸收峰，而尿囊素沒(méi)有，根據(jù)反應(yīng)前后吸光度的變化可定量樣本中尿酸的含量；而常規(guī)方法的原理是尿酸經(jīng)尿酸酶氧化生成尿囊素，同時(shí)生成過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶的作用下與4-氨基安替比林和N-（3-磺丙基）-3-甲氧基-5-甲基苯胺反應(yīng)生成一種醌亞胺染料，604 nm處吸光度的改變與樣本中尿酸的濃度成正比。

綜上所述，優(yōu)化后的血清尿酸參考方法精密度和線性更好，可以為臨床常規(guī)方法的建立和溯源提供一定的參考。臨床實(shí)驗(yàn)室在建立尿酸常規(guī)方法時(shí)需重視測(cè)量方法的原理和校準(zhǔn)品的溯源。