龍光文 張 謙 楊秀林 吉春玲 董裕康（貴州省人民醫(yī)院急診內科，貴陽 550002）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床上常見的急危重癥，以頑固性低氧血癥、呼吸窘迫為臨床表現(xiàn)，肺泡毛細血管通透性增加、透明膜形成為病理生理改變的臨床綜合征［1］。隨著對ARDS病理生理改變的再認識，右心功能在ARDS發(fā)生發(fā)展中的變化引起了關注，學者們發(fā)現(xiàn)ARDS患者不僅會出現(xiàn)肺損傷，還會出現(xiàn)循環(huán)損傷，導致右心功能不全以及急性肺源性心臟病的發(fā)生［2-3］。近年來報道m(xù)iR-126參與多種疾病的炎癥、免疫及肺臟損傷的調控，其在ARDS相關患者中低表達，高表達可以改善ARDS相關肺損傷，可作為ARDS診斷和預后的潛在生物標志物［4-6］。同時研究也顯示，miR-126還具有改善心功能的作用［7-8］，但miR-126對ARDS相關心功能障礙是否有改善作用目前尚未有文獻報道。本研究擬通過氣道內滴注脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）制備ARDS相關右心功能障礙大鼠模型，探討miR-126在ARDS模型大鼠心肌組織中的表達變化及過表達miR-126對模型大鼠右心功能的保護作用及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物60只SPF級雄性SD大鼠，鼠齡6～7周，體質量（220±10）g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK（黔）2018-0001。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃、濕度40%～70%，自由進食飲水，每日光照12 h。

1.1.2 實驗試劑與儀器miR-126激動劑（agomir）及其陰性對照（agomir NC）購自廣州銳博生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒購自上海碧云天公司；心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、肌紅蛋白（Mb）、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）、半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、凋亡相關的斑點樣蛋白（ASC）和GAPDH抗體購自Proteintech公司。血氣分析儀（Rapidlab 348）購自德國BD公司；多功能酶標儀（SpectraMax Paradigm）購自上海美谷分子儀器；超聲診斷儀（Vivid Dimension 7）購自美國通用公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模與分組60只SD大鼠隨機分成假手術組（Sham組）、模型組（Model組）、agomir陰性對照組（agomir-NC組）和miR-126 agomir組（agomir組），每組15只。其中agomir-NC組和agomir組在造模前24 h，經尾靜脈注射agomir-NC或miR-126 agomir（10 nmol/只，200μl），Sham組和Model組注射等量生理鹽水。采用頸部氣管滴注10 mg/kg LPS建立ARDS模型［9］，以動脈血液氧合指數(shù)（OI）＜200 mmHg為造模成功標準［10］。

1.2.2 超聲心動圖檢查評估右心功能 造模成功后24 h，采用超聲心動圖于大鼠胸前右心長軸上測量三尖瓣環(huán)收縮期位移（TAPSE）、右心面積變化分數(shù)（FAC）、肺動脈加速時間（PAAT）和肺動脈收縮壓（PASP），均測量3次后取均值。

1.2.3 動脈血氧分壓（PaO2）及氧合指數(shù)（OI）測定 造模成功后24 h，分離大鼠股動脈，取股動脈血1 ml，立即進行血氣分析，記錄動脈血氧分壓（PaO2），根據(jù)吸入氣中的氧濃度分數(shù)（FiO2）計算OI，OI=PaO2/FiO2。

1.2.4 HE染色觀察肺及右心組織病理學變化取大鼠右肺中葉和心臟右心室，10%多聚甲醛固定24 h，經脫水、透明、浸蠟、包埋，制備4μm石蠟切片進行HE染色。于光鏡下觀察肺組織和右心組織病理學改變。

1.2.5 ELISA法檢測血清中心肌損傷標志物及心肌組織中炎癥因子水平 收集大鼠下腔靜脈血，3 000 r/min離心15 min取血清；同時收集心肌組織，用玻璃勻漿器上下、旋轉充分碾磨制備心肌組織勻漿，充分裂解后10 000 r/min離心20 min取上清。按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，采用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，根據(jù)標準曲線計算血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb以及心肌組織中IL-1β和IL-18含量。

1.2.6 qRT-PCR檢測心肌組織中miR-126表達水平以及NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA水平 取適量心肌組織，采用Trizol法提取各樣本總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，用逆轉錄試劑盒將得到的RNA合成為cDNA，然后以cDNA為模板，取10μl逆轉錄產物進行PCR反應，引物序列見表1。反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)。以U6和GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7 Western blot檢測心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表達水平 取各組心肌組織100 mg，加入預冷的組織裂解液1 ml，在冰浴中超聲破碎勻漿后離心取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。向SDS-PAGE通道中加入等體積蛋白質，并將蛋白質轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBS洗滌3次，加入一抗NLRP3、ASC、caspase-1和GAPDH（1∶1 000）一起孵育過夜。再用TBST漂洗40 min，分為3次漂洗，加入HRP標記二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析，以GAPDH為內參計算各蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過表達miR-126對ARDS大鼠超聲心動圖指標的影響 如表2所示，與Sham組比較，Model組大鼠TAPSE、FAC和PAAT顯著減少，PASP顯著升高（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠TAPSE、FAC和PAAT顯著升高，PASP顯著減少（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠右心功能參數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of functional parameters of right heart among groups（±s）

表2 各組大鼠右心功能參數(shù)比較（±s）Tab.2 Comparison of functional parameters of right heart among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups TAPSE/mm FAC（%）PAAT/ms PASP/mmHg Sham Model Agomir-NC Agomir 3.44±0.32 2.28±0.201）2.21±0.16 3.14±0.262）57.73±5.03 32.88±2.341）33.00±1.71 52.90±3.452）32.55±3.07 22.43±1.171）21.01±1.00 29.65±1.342）28.66±1.79 64.07±3.221）65.00±2.63 35.54±1.402）

2.2 過表達miR-126對ARDS大鼠動脈血氧分壓和氧合指數(shù)的影響 如表3所示，與Sham組比較，Model組大鼠動脈PaO2和OI值顯著降低（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠PaO2和OI值顯著增加（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠動脈PaO2和OI比較（±s）Tab.3 Comparison of PaO2 and OI in arteries among groups（±s）

表3 各組大鼠動脈PaO2和OI比較（±s）Tab.3 Comparison of PaO2 and OI in arteries among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model agomir-NC agomir PaO2/mmHg 103.00±7.01 60.49±2.681）61.22±3.07 93.55±4.462）OI/mmHg 503.00±12.77 168.00±8.451）172.00±6.00 377.86±10.932）

2.3 過表達miR-126對ARDS大鼠心肌組織中miRNA-126表達水平的影響 如圖1所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中miRNA-126表達水平顯著降低（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠心肌組織中miRNA-126表達水平顯著增加（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織中miR-126表達水平比較Fig.1 Comparison of miR-126 expression levels in myocardial tissue of rats among groups

2.4 過表達miR-126對ARDS大鼠肺組織和右心肌組織病理學的影響 如圖2所示，Sham組大鼠肺組織結構形態(tài)完整，未見明顯異常；Model組和agomir-NC組大鼠肺部充血水腫、形態(tài)紊亂，肺泡間質增厚，肺不張且有透明膜形成，同時伴有大量炎癥細胞浸潤；agomir組大鼠肺組織結構形態(tài)明顯恢復，肺泡出血減少，肺泡腔內可見少量炎癥細胞浸潤。Sham組大鼠右心肌組織細胞結構正常，排列整齊，未見炎癥細胞浸潤；Model組和agomir-NC組大鼠心肌細胞結構被破壞，排列紊亂，可見大量炎癥細胞浸潤；agomir組大鼠心肌細胞損傷程度減輕，細胞排列大致有序，伴有少量炎癥細胞浸潤。

圖2 各組大鼠肺組織和心肌組織病理學觀察（HE染色，×200）Fig.2 Histopathological observation of lung tissue and myocardial tissue among groups（HE staining，×200）

2.5 過表達miR-126對ARDS大鼠血清中心肌損傷標志物含量的影響 如表4所示，與Sham組比較，Model組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著增加（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量顯著減少（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比較（±s）Tab.4 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum among groups（±s）

表4 各組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB和Mb含量比較（±s）Tab.4 Comparison of contents of cTnⅠ，CK-MB and Mb in serum among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model Agomir-NC Agomir cTnⅠ/（ng·ml-1）0.66±0.02 2.58±0.101）2.53±0.11 1.04±0.092）CK-MB/（U·L-1）26.50±4.61 128.46±9.501）124.33±8.60 56.66±3.062）Mb/（ng·ml-1）37.57±3.44 166.40±7.761）164.34±6.89 65.57±2.562）

2.6 過表達miR-126對ARDS大鼠心肌組織中炎癥因子含量的影響 如表5所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含量顯著增加（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含 量顯著減少（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含量比較（±s）Tab.5 Comparison of contents of IL-1βand IL-18 in myocardial tissue among groups（±s）

表5 各組大鼠心肌組織中IL-1β和IL-18含量比較（±s）Tab.5 Comparison of contents of IL-1βand IL-18 in myocardial tissue among groups（±s）

Note：1）P＜0.01 vs Sham group；2）P＜0.01 vs Model group.

Groups Sham Model Agomir-NC Agomir IL-1β/（pg·ml-1）18.83±2.56 90.65±5.501）87.64±4.00 34.99±2.932）IL-18/（pg·ml-1）36.60±2.39 119.46±6.781）115.06±5.30 65.49±2.002）

2.7 過表達miR-126對ARDS大鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1表達水平的影響 如圖3所示，與Sham組比較，Model組大鼠心肌組織中NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表達水平顯著增加（P＜0.01）；與Model組比較，agomir組NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA和蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），而agomir-NC組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 各組大鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA及蛋白表達水平比較Fig.3 Comparison of mRNA and protein expression levels of NLRP3，ASC and caspase-1 of myocardial tissue among groups

3 討論

miRNAs是一類進化上高度保守的非編碼小分子RNA，早期對其研究主要集中在機體發(fā)育的調控及腫瘤形成方面，但近些年來的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，部分miRNAs能特異性表達于心肌細胞，參與心肌重塑、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程［11］。miR-126是一種內皮細胞特異性表達miRNA，存在于哺乳動物內血管豐富的組織中，調控內皮細胞的生物合成、血管發(fā)育和維持血管的完整性，是血管生成的關鍵調節(jié)因子，具有改善心功能的作用。成力等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-126可能通過調控血管內皮生長因子A參與先天性心臟病相關性肺動脈高壓發(fā)??；譚順林等［13］研究指出，慢性心力衰竭患者血清miR-126水平異常表達，其可能參與了慢性心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展；高威等［14］提出，過表達miR-126能顯著抑制急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡。但miR-126對ARDS相關心功能障礙是否有改善作用目前未知，本研究通過頸部氣管滴注LPS構建ARDS大鼠模型，經尾靜脈注射miR-126激動劑探討miR-126對ARDS大鼠右心功能的保護作用及具體機制，研究結果顯示，miR-126在ARDS模型大鼠心肌組織中低表達，過表達miR-126可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化來改善ARDS大鼠右心功能障礙。

本研究通過氣管滴注LPS的方法建立大鼠ARDS模型，結果顯示，模型大鼠動脈OI＜200 mmHg，同時HE染色結果顯示大鼠肺部充血水腫、形態(tài)紊亂，有大量炎癥細胞浸潤，伴有肺不張、透明膜形成等ARDS的典型病理學改變，提示ARDS模型制備成功，與馬紹磊等［15］研究結果相符。超聲心動圖是評估右心功能的良好手段，本實驗的研究重點是探討出現(xiàn)ARDS時心功能的變化情況，并觀察過表達miR-126對ARDS時心臟功能的影響。肺動脈高壓是右心功能障礙最常見的原因，PASP越高，提示肺動脈壓力越高，PAAT縮短則提示肺血管阻力增加，肺動脈壓力增高；TAPSE和FAC是反映右心室收縮功能的主要指標，其值降低提示右室收縮功能減退。本研究結果顯示，ARDS大鼠的TAPSE、FAC和PAAT顯著減小，而PASP顯著增加，心肌組織HE染色結果也顯示，大鼠心肌細胞增大、排列紊亂，間質有炎癥細胞聚集，說明ARDS在引起肺功能損傷的同時，還會導致右心功能不全，與相關研究一致［15］。進一步通過qRT-PCR法檢測各組大鼠心肌組織中miR-126的表達情況，發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌組織中miR-126表達水平明顯降低，初步提示miR-126在ARDS相關心功能障礙方面可能發(fā)揮重要作用。為進一步驗證其具體作用，本研究通過尾靜脈注射的方式給模型大鼠注射miR-126激動劑，結果顯示模型大鼠心肌組織中miR-126表達水平明顯上調，動脈OI值回升，右心功能指標得到明顯改善，同時心肌組織和肺組織病理性改變明顯減輕，提示過表達miR-126可改善ARDS大鼠心功能。

NOD樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是機體固有免疫應答的重要組成部分，通常情況下機體NLRP3活性處于抑制狀態(tài)，當NLRP3受外界刺激被激活時，活化的效應蛋白caspase-1可促進IL-1β和IL-18的成熟與釋放，造成組織損傷并加劇炎性疾病的發(fā)展。心肌組織的炎癥反應是導致右心功能障礙的主要原因之一，這可能是右心功能障礙的基礎［16］。cTnⅠ、CK-MB和Mb為心肌損傷特異性標志物，當心肌細胞受損時其在血液中的含量會異常升高［17］。為進一步探究miR-126改善ARDS大鼠心功能的作用機制，本研究對大鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體通路相關蛋白表達水平、炎癥因子以及心肌損傷標志物含量進行檢測，研究結果顯示，模型大鼠心肌組織中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA和蛋白表達水平以及IL-1β、IL-18、cTnⅠ、CK-MB和Mb含量均顯著增加，過表達miR-126可顯著降低以上指標在心肌組織中的含量，提示miR-126可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化，抑制炎癥因子釋放，從而減輕ARDS大鼠心肌損傷，發(fā)揮其心功能保護作用。

綜上所述，本研究從超聲心動圖、心肌組織病理學改變、蛋白分子水平及心肌組織炎癥指標等不同層面，證實過表達miR-126可通過抑制NLRP3炎癥小體活化、減輕炎癥反應對ARDS相關右心功能障礙發(fā)揮保護作用。