米 偉 徐斐翀 宋雨亭 唐 晴 劉 月

（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院血液透析中心，成都 610000）

腎小球系膜細胞位于腎小球毛細血管之間，鄰近內(nèi)皮細胞或基底膜，具有分泌細胞基質(zhì)，支撐腎小球毛細血管叢，產(chǎn)生細胞因子，吞噬或清除大分子物質(zhì)等功能［1-2］。研究表明，腎小球系膜細胞在高糖、過氧化氫、活性氧、炎癥等多種因素刺激下，均可發(fā)生氧化應(yīng)激、免疫應(yīng)答、纖維化等損傷［3-5］。冬凌草甲素是從唇形科香茶菜屬植物碎米亞椏中分離出的一種具有生物活性的天然物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗炎癥、抗組織纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性［6］。研究表明，冬凌草甲素通過其生物活性在多種腫瘤和細胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，例如，冬凌草甲素通過下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6表達抑制人角質(zhì)形成細胞增殖、凋亡和遷移［7］；通過降低TGF-β受體表達調(diào)節(jié)T細胞的免疫抑制能力，從而抑制乳腺癌細胞生長［8］；通過減弱IL-1β的活化作用抑制人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的炎癥發(fā)生等［9］。但冬凌草甲素在人腎小球系膜細胞（human glomerular mesangial cells，HGMCs）中的研究鮮見報道，因此，本研究通過建立高糖誘導(dǎo)的HGMCs模型，探究冬凌草甲素對HGMCs異常增殖、炎癥反應(yīng)和纖維化的影響，并初步探索其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球系膜細胞系購自上海細胞生物研究所。冬凌草甲素（純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司（貨號：B20310-20 mg）；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司（貨號：0030034DJ、H0101、A40009）；CCK8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、ELISA試劑盒、RT-PCR試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；單克隆抗體及HRP標記的對應(yīng)二抗均購自美國Abcam公司。臺式高速離心機（大龍，D3024R）；成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-1600R）；光學(xué)顯微鏡（日本尼康，Nikon Eclipse E100）；酶標儀（Rayto，RT6100）；RT-PCR儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，東勝龍ETC811）；流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及培養(yǎng) 將細胞分為健康對照組、模型組、模型+5μg/ml冬凌草甲素組、模型+10μg/ml冬凌草甲素組、模型+20μg/ml冬凌草甲素組，模型處理和劑量依據(jù)參考文獻［10-11］。健康對照組細胞培養(yǎng)于含5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，模型組細胞培養(yǎng)于含35 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，模型+5、10、20μg/ml冬凌草甲素組細胞分別培養(yǎng)于含35 mmol/L葡糖糖、10%胎牛血清和5、10、20μg/ml冬凌草甲素的DMEM培養(yǎng)基中，各組細胞均在37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8檢測細胞增殖倍數(shù) 細胞經(jīng)胰酶消化后，嚴格按照CCK8試劑盒說明書操作，以5×104個/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，并分別于第0、1、2、3、4天向細胞孔內(nèi)加入20μl CCK8溶液。酶標儀測各孔450 nm處吸光度值。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 收集對數(shù)生長期的HGMCs，制備細胞懸液，取100μl細胞懸液于1.5 ml離心管，加入5μl Annexin V-FITC混勻后室溫避光孵育10 min，加入10μl 20μg/ml的PI溶液，采用流式細胞儀進行分析。以Annexin V-FITC為橫坐標，PI為縱坐標，B2象限為晚期凋亡細胞，B3象限為正常細胞，B4象限為早期凋亡細胞。

1.2.4 RT-PCR檢測TNF-α、IL-6、IL-1β、TGF-β、纖維粘連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA水平 收集對數(shù)生長期的HGMCs，制備細胞懸液并以4℃、3 000 r/min離心15 min，采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定RNA濃度和純度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，然后按照RT-PCR試劑盒配制反應(yīng)體系，于PCR擴增儀進行擴增（95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸2 min，循環(huán)40次后，72℃延伸5 min）。以目的基因和內(nèi)參比值表示mRNA相對表達水平，采用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。TNF-α正 向 引 物：5'-AACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAATG-3'，反向引物：5'-CTCCGCTTGGTGGTTTGCTA-3'；IL-6正向引物：5'-GACTGATGTTGCTGACAGCCACTGC-3'，反向引物：5'-TAGCCACTGCTTCTGTGACTCTAACT-3'；IL-1β正向引物：5'-GTCTTTCCCGTGACCTTC-3'，反向引物：5'-ATCTCGGAGCCTGTTAGTGC-3'；TGF-β正向引物：5'-GGCTACTTTGCCAACTACTGC-3'，反向引物：5'-GACGAGGTGGAACACAACG-3'；FN正向引物：5'-CATTCAACAAGAAACCACT-3'，反向引物：5'-TCTGTCACTTCCACAAACT-3'；α-SMA正向引物：5'-AACCACACCTAAAAGAAAAC-3'，反向引物：5'-CTGACCAAATGGCAGAACAT-3'；β-actin正 向 引物：5'-CCCATCTACGAGGGCTAT-3'，反向引物：5'-TTGCACGCACGATTTCC-3'。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-6和IL-1β含量 取對數(shù)生長期的HGMCs，制備細胞懸液并以4℃、3 000 r/min離心15 min取上清液，設(shè)置空白對照孔，反應(yīng)孔加入樣品液，37℃孵育40 min，洗滌液洗滌3次，每次2 min，然后加入生物素標記的抗體，37℃避光孵育30 min，洗滌3次后加入鏈霉親和素混勻，37℃避光孵育30 min，最后加入顯色劑避光顯色10～15 min，滴加終止液終止反應(yīng)，終止反應(yīng)后5 min內(nèi)采用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

1.2.6 免疫熒光和試劑盒檢測ROS、SOD和MDA含量 將對數(shù)期的HGMCs制成細胞懸液，接種于12孔板，每孔接種5×104個細胞，待細胞貼壁融合至90%時，取出蓋片，PBS洗滌3次，每次5 min。4%多聚甲醛固定細胞，常溫下靜置15 min，PBS洗3次，每次5 min，常溫下靜置15 min，后用山羊血清封閉于37℃孵育60 min；濾紙吸凈封閉液，加入ROS一抗4℃孵育過夜。第2天于37℃下再孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min。于暗室中加入FITC二抗，37℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，每次5 min。以0.5μg/μl的DAPI覆 蓋 細 胞，常 溫 下 避 光 靜 置5 min，PBS洗滌3次，每次5 min，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。常溫下按試劑盒說明測定SOD和MDA含量。

1.2.7 Western blot檢測TGF-β、FN、α-SMA、TLR4、MyD88和p-P65蛋白水平 收集對數(shù)生長期的HGMCs，胰酶消化細胞。RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定細胞蛋白濃度，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入TGF-β（1∶200）、FN（1∶200）、α-SMA（1∶400）、TLR4（1∶200）、MyD88（1∶200）和p-P65（1∶400）抗體，4℃下?lián)u床孵育過夜。加入按比例稀釋HRP標記的對應(yīng)二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法于暗室下曝光顯影（β-actin作內(nèi)參）。將膠片進行掃描存檔，Photoshop整理去色，Alpha軟件分享光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗獨立重復(fù)3次，取平均值，數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件進行分析，正態(tài)分布的計量資料表示為±s。采用單因素方差分析，若方差齊則兩兩比較采用LSD法，若方差不齊則兩兩比較采用Dunnettt法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對HGMCs增殖和凋亡的影響 與健康對照組相比，模型組細胞增殖倍數(shù)增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組相比，5μg/ml冬凌草甲素組細胞增殖倍數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，10μg/ml和20μg/ml冬凌草甲素組細胞增殖倍數(shù)顯著降低（P＜0.05），見圖1A。流式細胞術(shù)檢測HGMCs凋亡率，與健康對照組［（4.6±0.5）%］相比，模型組［（5.0±0.8）%］細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組相比，5μg/ml冬凌草甲素組［（5.0±1.2）%］細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10μg/ml［（28.6±3.6）%］和20μg/ml［（39.0±4.1）%］冬凌草甲素組細胞凋亡率顯著提高（P＜0.05），見圖1B、C。

圖1 CCK8和流式細胞術(shù)檢測細胞增殖和凋亡率Fig.1 CCK8 and flow cytometry to detect cell proliferation and apoptosis rate

2.2 冬凌草甲素對HGMCs炎癥因子含量的影響與健康對照組相比，模型組細胞上清液中TNF-α mRNA［（4.3±0.5）pg/ml］和蛋白［（15±4）pg/ml］水平均顯著升高（P＜0.05），IL-6 mRNA［（2.7±0.4）pg/ml］和蛋白［（9±7）pg/ml］水平均顯著升高（P＜0.05），IL-1βmRNA［（3.8±0.2）pg/ml］和蛋白［（18±6）pg/ml］水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，5μg/ml冬凌草甲素組TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA和蛋白含水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10μg/ml和20μg/ml冬凌草甲素組細胞上清液中TNF-αmRNA［（2.8±0.4）pg/ml和（1.5±0.1）pg/ml］和蛋白［（57±7）pg/ml和（23±12）pg/ml］水平顯著降低（P＜0.05），IL-6 mRNA［（1.8±0.6）pg/ml和（1.2±0.3）pg/ml］和蛋白［（27±9）pg/ml和（14±5）pg/ml］水平均顯著降低（P＜0.05），IL-1βmRNA［（2.9±0.4）pg/ml和（1.4±0.2）pg/ml］和蛋白［（59±6）pg/ml和（31±7）pg/ml］水平均顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 RT-PCR和ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平和蛋白含量Fig.2 RT-PCR and ELISA to detect TNF-α，IL-6，IL-1β mRNA levels and protein contents

2.3 冬凌草甲素對HGMCs氧化應(yīng)激指標的影響與健康對照組相比，模型組ROS［（2±1）U/ml］含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，SOD［（2.4±0.4）U/ml］含量顯著減少（P＜0.05），MDA［（4.5±0.3）U/ml］含量顯著增多（P＜0.05）。與模型組相比，5μg/ml冬凌草甲素組ROS、SOD和MDA含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10μg/ml和20μg/ml冬凌草甲素組ROS［（9±3）U/ml和（19±4）U/ml］含量和SOD［（3.5±0.5）U/ml和（4.2±0.4）U/ml］含量顯著增多（P＜0.05），MDA［（3.6±0.4）U/ml和（2.5±0.6）U/ml］含量顯著減少（P＜0.05），見圖3。

圖3 免疫熒光和試劑盒檢測ROS、SOD和MDA含量Fig.3 Immunofluorescence and kits to detect ROS，SOD and MDA contents

2.4 冬凌草甲素對HGMCs纖維化水平的影響 與健康對照組相比，模型組TGF-βmRNA（3.44±0.32）和蛋白（0.92±0.06）水平顯著上調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)N mRNA（3.65±0.44）和蛋白（0.38±0.08）水平顯著上調(diào)，α-SMA mRNA（4.23±0.38）和蛋白（0.43±0.05）水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，5μg/ml冬凌草甲素組TGF-β、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10μg/ml和20μg/ml冬 凌 草 甲 素 組TGF-βmRNA（2.46±0.26、1.32±0.16）和蛋白（0.48±0.06、0.07±0.03）水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)N mRNA（2.28±0.33、1.58±0.28）和蛋白（0.09±0.02、0.03±0.01）水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），α-SMA mRNA（2.53±0.38、1.64±0.22）和蛋白（0.13±0.05、0.05±0.02）水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖4。

圖4 RT-PCR和Western blot檢測TGF-β、FN和α-SMA mRNA和蛋白水平Fig.4 RT-PCR and Western blot detection of TGF-β，F(xiàn)N andα-SMA mRNA and protein levels

2.5 冬凌草甲素對HGMCs TLR4/MyD88和P65磷酸化的影響 與健康對照組相比，模型組TLR4（0.38±0.08）、MyD88（0.68±0.07）和p-P65（0.16±0.05）蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。與模型組相比，5μg/ml冬凌草甲素組TLR4、MyD88和p-P65水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），10μg/ml和20μg/ml冬凌草甲素組TLR4（0.07±0.03、0.03±0.02）、MyD88（0.23±0.06、0.06±0.04）和p-P65（0.06±0.03、0.02±0.01）蛋白水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），見圖5。

圖5 Western blot檢測TLR4/MyD88和p-P65蛋白水平Fig.5 Western blot detection of TLR4/MyD88 and p-P65 protein levels

3 討論

冬凌草甲素的主要成分是四環(huán)二萜類有機化合物，常用于消熱解毒、消炎止痛、活血化瘀等［12-13］。研究表明，冬凌草甲素通過TLR4/MyD88/NF-κB通路在多種腫瘤和細胞炎癥、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮調(diào)控作用［14］。本研究通過高糖誘導(dǎo)HGMCs模型，探究冬凌草甲素在HGMCs增殖、凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和纖維化中的調(diào)節(jié)作用及其作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素能夠抑制高糖誘導(dǎo)的HGMCs增殖、炎癥因子表達和纖維化，促進細胞凋亡和氧化應(yīng)激，并下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白水平。提示冬凌草甲素在高糖誘導(dǎo)的HGMCs中具有調(diào)節(jié)作用。

HGMCs異常增殖是引起系膜增生性腎小球腎炎的主要病理因素，高糖可抑制腎小球系膜細胞功能，引起系膜細胞自噬能力降低，導(dǎo)致細胞中損傷的大分子和細胞器不能被清除造成腎臟損傷，隨著病程進一步加重最終發(fā)生終末期腎?。?5］。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導(dǎo)的HGMCs增殖能力明顯被抑制，細胞凋亡率顯著增加。提示冬凌草甲素通過抑制HGMCs增殖并促進細胞凋亡在多種腎病中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是腎小球系膜細胞發(fā)生病變的主要因素，TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞分泌的促炎細胞因子，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IL-6是由活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的淋巴因子，參與調(diào)節(jié)細胞免疫應(yīng)答，同時，IL-6在多種炎癥性疾病中也發(fā)揮重要作用［16］。IL-1β是由活化的巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生的淋巴細胞刺激因子，其通過結(jié)合細胞表面的受體參與調(diào)控細胞免疫和炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6、IL-1β在HGMCs中的高表達與細胞炎癥和免疫紊亂相關(guān)［17］。高糖環(huán)境會誘導(dǎo)腎小球系膜細胞活化，激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)腎小球系膜細胞內(nèi)ROS和MDA過量產(chǎn)生及SOD失活，使得腎小球系膜細胞抗氧化能力下降［18］。TGF-β、FN和α-SMA是細胞纖維化的重要指標，在腎小球系膜細胞病變過程中起到促進作用［19］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)冬凌草甲素處理后，高糖誘導(dǎo)的HGMCs炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β顯著降低，氧化應(yīng)激水平明顯降低，纖維化水平也顯著降低。提示冬凌草甲素可能通過降低高糖誘導(dǎo)的HGMCs炎癥因子水平、氧化應(yīng)激指標和纖維化水平調(diào)節(jié)細胞損傷。

為進一步明確冬凌草甲素調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的HGMCs異常增殖、氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化的作用機制，本研究還初步檢測了TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達情況及纖維化水平，Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）是天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR信號通路中的關(guān)鍵接頭分子，調(diào)節(jié)傳遞上游信息和疾病發(fā)生發(fā)展。NF-κB在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程中起關(guān)鍵作用。TLR4/MyD88/NF-κB通路在多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，TLR4通過與相應(yīng)配體的結(jié)合觸發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（如MyD88）導(dǎo)致NF-κB活化從而調(diào)節(jié)細胞因子分泌和炎癥反應(yīng)發(fā)生［20-21］。郝健等［22］發(fā)現(xiàn)，TLR4/MyD88/NF-κB在腎小球系膜細胞中表達顯著增加，經(jīng)給藥處理后，TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白及炎癥細胞因子IL-6和IL-1β表達顯著降低。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)冬凌草甲素處理后，高糖誘導(dǎo)的HGMCs中TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達顯著降低，纖維化水平也顯著降低。

綜上所述，冬凌草甲素在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細胞增殖、炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化中具有調(diào)節(jié)作用，其作用機制可能與下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達有關(guān)，后續(xù)課題組將進一步探究冬凌草甲素通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路調(diào)控HGMCs異常增殖、炎癥、氧化應(yīng)激和纖維化的具體作用機制。