張顯英 仇 華 陳 青 （山東省滕州市中心人民醫(yī)院新生兒科，滕州 277599）

新生兒缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain injury，HIBD）是新生兒在圍產(chǎn)期窒息而出現(xiàn)的腦部缺氧缺血性損傷［1］。HIBD是導(dǎo)致新生兒急性死亡率升高的主要原因，發(fā)達(dá)國家每年每1 000名新生兒中約有5名受此影響［2］。此外，新生兒期HIBD相關(guān)死亡率高達(dá)40%，另有30%的患者可能患有神經(jīng)后遺癥，如智力遲鈍和腦癱，這可能對兒童、其家庭和整個(gè)社會(huì)構(gòu)成沉重負(fù)擔(dān)。新生兒HIBD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種不同因素，由自由基生產(chǎn)、離子不平衡、興奮毒性和炎癥反應(yīng)引起的神經(jīng)元凋亡和自噬在HIBD的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其發(fā)生機(jī)制尚不明確［3-6］。

由于神經(jīng)炎癥反應(yīng)引起的繼發(fā)性腦損傷在HIBD中起著重要作用，抑制炎癥反應(yīng)可能保護(hù)缺氧缺血腦組織［7-9］。TLR4/核因子kappa-B（NF-κB）信號通路在激活中性淋巴瘤和腦缺血缺氧、一氧化碳腦缺血、腦外傷等引起的腦損傷機(jī)制中起著重要作用［10-13］。TLR4可與HMGB1結(jié)合，向上調(diào)節(jié)骨髓分化因子88（MyD88）的表達(dá)，然后激活NF-κB信號通路，最終誘發(fā)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVECs）的炎癥反應(yīng)，組織局部缺血和炎癥后HMGB1表達(dá)水平明顯提高，并且誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡［14］。microRNA（miRNA）是近年的研究熱點(diǎn)，可參與神經(jīng)元細(xì)胞的正常生長發(fā)育［15-16］。已有研究表明，miR-410-3p通過靶向HMGB1抑制骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥［17］。

但目前尚無研究報(bào)道m(xù)iR-410-3p在缺氧缺血性腦損傷中的表達(dá)，以及miR-410-3p、HMGB1/NFκB在缺氧缺血性腦損傷中的調(diào)控機(jī)制。因此，本研究采用PC12細(xì)胞進(jìn)行缺氧缺血處理，并通過相關(guān)轉(zhuǎn)染處理，以探究miR-410-3p通過介導(dǎo)HMGB1/NFκB通路對缺氧缺血性神經(jīng)元細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞PC12細(xì)胞購自通派（上海）生物科技有限公司；胰蛋白酶-EDTA（Gibco，25200072，美國）；Lipofectamin2000試劑盒（Invitrogen，美國）；Trizol（貨號：16096020，賽默飛世爾科技，美國）；TaqMan Micro RNA Assays ReverseTranscription Primer（Thermoscientific公司，美國）；SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒（行知生物科技有限公司，中國）；RIPA裂解液（R0010，Solarbio，中國）；BCA試劑盒（賽默飛公司，美國）；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒（Promega）；PVDF膜（ISEQ00010，Millipore，美 國）；一 抗 兔 抗HMGB1（ab18256）、NF-κB p65（ab16502）、GAPDH（ab8245）（Abcam，英國）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司，中國）；ECL熒光檢測試劑盒（貨號BB-3501，Ameshame公司，英國）；IL-8、IL-6、TNF-α檢測試劑盒（69-21138、69-25328、69-40133，武漢默沙克，中國）；CCK-8（Sigma，美國）；Annexin V-FITC（ab14085，Abcam，美國）。

1.1.2 主要儀器 酶標(biāo)儀（NYW-96M，北京諾亞威儀器儀表有限公司，中國）；Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）；ABIPRISM?7300（型號：Prism?7300，上海坤科儀器設(shè)備有限公司，中國）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCantoⅡ，北京安麥格貿(mào)易有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞系置于含5%胎牛血清、5%馬血清和10 U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2環(huán)境下恒溫培養(yǎng)。

1.2.2 缺氧缺血細(xì)胞模型構(gòu)建PC12細(xì)胞于含10%胎牛血清與二抗（50μg/ml青霉素、鏈霉素）的DMEM中培養(yǎng)，5%CO2、37℃的恒溫孵育箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長至85%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。然后，37℃下，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1 min，500 g離心5 min，將沉淀的細(xì)胞以1∶3的比例進(jìn)行傳代。第3～6代的匯合細(xì)胞用于所有實(shí)驗(yàn)。為了構(gòu)建體外細(xì)胞缺氧缺血模型，將PC12細(xì)胞在95%N2、5%CO2和37℃環(huán)境下的無糖平衡鹽溶液中培養(yǎng)2 h。除去培養(yǎng)基并用PBS沖洗3次。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為6組：Normal組（正常PC12細(xì)胞）、NC組（缺血性處理的PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒）、Model組（缺血性處理的PC12細(xì)胞）、miR-410-3p mimic組（缺血性處理的PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-410-3p過表達(dá)質(zhì)粒）、HMGB1 vector組（缺血性處理的PC12細(xì)胞，轉(zhuǎn)染HMGB1過表達(dá)質(zhì)粒）、miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組（缺血性處理的PC12細(xì)胞，共染miR-410-3p過表達(dá)和HMGB1過表達(dá)質(zhì)粒）。

Normal組細(xì)胞不做缺氧缺血處理。其余組細(xì)胞均進(jìn)行缺氧缺血處理。將細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，細(xì)胞生長密度達(dá)到50%～60%時(shí)即可使用Lipofectamin2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。5μl目的質(zhì)粒（miR-410-3p mimic或HMGB1 vector）稀釋至250μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，另將6μl Lipofectamin2000稀釋至250μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，輕彈混勻。室溫靜置5 min后將兩液體均勻混合，靜置20 min后滴入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕晃培養(yǎng)板混勻之后置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后36 h收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) 經(jīng)過生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站（www.targetscan.org）進(jìn)行miR-410-3p與HMGB1結(jié)合位點(diǎn)的分析。通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-410-3p與HMGB1的靶向關(guān)系。構(gòu)建靶基因HMGB1雙熒光素酶報(bào)告基因載體與miR-410-3p結(jié)合位點(diǎn)突變的突變體：PGL3-HMGB1wt和PGL3-HMGB1mut。將Rellina質(zhì)粒和報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-410-3p mimcs和NC mimcs共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行雙熒光素酶檢測。首先將各組細(xì)胞裂解，裂解后以12 000 r/min離心1 min，去沉淀，收集上清液。按照雙熒光素酶報(bào)告試劑盒說明書測量熒光素酶活性。操作步驟如下：將裂解后的細(xì)胞樣品吸入EP管中，每10μl樣品中螢火蟲熒光素酶工作溶液100μl，測得螢火蟲熒光素酶之后加入海腎熒光素酶工作溶液100μl，測得海腎熒光素酶結(jié)果。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.5 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)Trizol試劑盒提取總RNA。TaqMan MicroRNA Assays Reverse Transcription Primer逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測。依次加入以下組分：25μl SYBR?PremixExTaqTMⅡ（2×），各2μl PCR正反向引物，ROXReferenceDye（50×）1μl，4μl DNA模板，16μl ddH2O。在ABIPRISM?7300系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，循環(huán)32次后72℃延伸1 min。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對照組），miR-19a以U6為內(nèi)參，用2-ΔΔCt表示各目的基因相對表達(dá)量。引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.2.6 Western blot使用含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，去離子水調(diào)整濃度。樣品與加樣緩沖液混合，沸水浴10 min，在各泳道每孔加入30μg蛋白樣品，以80 V恒壓電泳2 h。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電壓110 V，轉(zhuǎn)膜2 h。5%脫脂奶粉4℃封閉PVDF膜2 h。棄去封閉液，TBST洗1次，加入一抗兔抗HMGB1（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min。然后孵育HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（1∶5 000稀釋）。TBST漂洗后，置于干凈的玻璃平板上。取ECL熒光檢測試劑盒中等量的A液和B液，暗室中混勻，將其滴加膜上，放入凝膠成像儀中曝光成像。用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)照相，用Image J軟件分析，以相應(yīng)蛋白條帶的灰度值/GAPDH蛋白條帶的灰度值表示相對蛋白含量。

1.2.7 ELISA參照ELISA檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞因子IL-8、IL-6、TNF-α的水平。

1.2.8 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種至96孔培養(yǎng)板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，每組各設(shè)8孔，每孔100μl，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)48 h時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入10μl CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀450 nm處讀取各孔吸光度值（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 流式檢測凋亡 各組細(xì)胞接種于96孔板（2.0×103個(gè)/孔），PBS溶液洗滌2次后離心將細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液中，加入10μl Annexin VFITC和5μl PI輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長488 nm檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶報(bào)告檢測結(jié)果 通過生信網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)miR-410-3p與HMGB1存在結(jié)合位點(diǎn)（圖1A）。雙熒光素酶報(bào)告檢測發(fā)現(xiàn)，miR-410-3p與突變的HMGB1的3'-UTR共轉(zhuǎn)染后無明顯差異，而miR-410-3p與野生型的HMGB1的3'-UTR共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性明顯降低（圖1B），結(jié)果表明，HMGB1是miR-410-3p的下游靶基因。

圖1 生信預(yù)測與雙熒光素酶報(bào)告檢測結(jié)果Fig.1 Results of biosynthesis prediction and dual luciferase report

2.2 各組PC12細(xì)胞中miR-410-3p表達(dá)情況qRT-PCR檢測各組細(xì)胞miR-410-3p表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Normal組對比，其余各組細(xì)胞miR-410-3p表達(dá)量均顯著降低（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組miR-410-3p表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組miR-410-3p表達(dá) 量顯 著降低（P＜0.05）。Model組、NC組、HMGB1 vector組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組miR-410-3p表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-410-3p表達(dá)情況Fig.2 qRT-PCR detection of miR-410-3p expression in each group of cells

2.3 各組PC12細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)情況qRT-PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Normal組對比，其余各組細(xì)胞HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著升高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組HMGB1 mRNA和蛋白 水 平明顯降低，HMGB1 vector組HMGB1 mRNA和蛋白水平明顯升高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組HMGB1 mRNA和蛋白水平明顯升高（P＜0.05）。Model組、NC組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組HMGB1 mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 qRT-PCR和Western blot檢測各組細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)情況Fig.3 qRT-PCR and Western blot detection of HMGB1 mRNA and protein expression in each group of cells

2.4 各組PC12細(xì)胞增殖情況檢測結(jié)果CCK-8檢測各組細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與Normal組對比，其余各組細(xì)胞OD值均顯著降低（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組OD值顯著升高，HMGB1 vector組OD值顯著降低（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組 相 比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組OD值顯著降低（P＜0.05）。Model組、NC組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-410-3p會(huì)促進(jìn)缺血性PC12細(xì)胞增殖，過表達(dá)HMGB1會(huì)抑制缺血性PC12細(xì)胞增殖，且過表達(dá)HMGB1可抵消miR-410-3p過表達(dá)對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞OD值統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Statistics of OD values of cells in each group

2.5 各組PC12細(xì)胞凋亡情況檢測結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，與Normal組對比，其余各組細(xì)胞凋亡比例均顯著升高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組凋亡比例顯著降低，HMGB1 vector組凋亡比例顯著升高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組 凋亡比例顯著升高（P＜0.05）。Model組、NC組 和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組細(xì)胞凋亡比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Flow cytometry to detect cell apoptosis in each group

2.6 各組PC12細(xì)胞炎癥因子檢測結(jié)果 檢測各組細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與Normal組相對比，其余各組PC12細(xì)胞中IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯較高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯降低，HMGB1 vector組IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯較高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組相比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組IL-8、IL-6、TNFα水平均明顯升高（P＜0.05）。Model組、NC組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組細(xì)胞各指標(biāo)含量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組PC12細(xì)胞炎癥因子檢測結(jié)果Fig.6 Test results of inflammatory factors in PC12 cells of each group

2.7 各組PC12細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)檢測結(jié)果Western blot檢測各組PC12細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與Normal組相對比，其余各組PC12細(xì)胞中NF-κB p65的表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05）。與Model組對比，miR-410-3p mimic組NF-κB p65的表達(dá)量明顯降低，HMGB1 vector組NF-κB p65表達(dá)量明顯升高（均P＜0.05）。與miR-410-3p mimic組 相 比，miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組NF-κB p65的表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。NC組、Model組和miR-410-3p mimic+HMGB1 vector組細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖7。

圖7 Western blot檢測各組細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)水平Fig.7 Western blot detection of NF-κB p65 protein expression level in each group

3 討論

HIBD是一種可誘發(fā)炎癥性腦損傷的疾病，這也是嬰兒和兒童死亡和長期神經(jīng)損傷的主要原因之一。HIBD引起的缺氧性腦病是兒童嚴(yán)重的腦部疾病，但尚無有效治療措施。經(jīng)證實(shí)，HIBD的病理機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等因素有關(guān)［18-24］。然而現(xiàn)有研究對于腦缺血的分子調(diào)控機(jī)制沒有較好的解釋，因此探究腦缺血的具體分子機(jī)制對腦缺血患者有效治療具有積極臨床意義。

目前已有研究表明，NF-κB信號通路的激活會(huì)促進(jìn)IL-6、TNF-α和其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而影響機(jī)體炎癥反應(yīng)［25-26］。由于嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。在腦缺血的大鼠模型中，HMGB1與NF-κB p65的表達(dá)量均明顯增加，且HMGB1表達(dá)與NF-κB p65通路激活對腦脊髓炎有調(diào)控作用［27］。本研究中，HMGB1過表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)造成NF-κB p65蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)炎癥因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均明顯較高，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致［25-27］。

通過文獻(xiàn)了解到miR-410-3p可通過調(diào)控下游靶基因影響多項(xiàng)生命活動(dòng)。同時(shí)，miR-410-3p參與了炎癥、血管生成和腫瘤發(fā)生等多個(gè)過程［28-30］，其影響與HMGB1/NF-κB通路對腦缺血的調(diào)控相似，并且有文獻(xiàn)表明HMGB1是miR-410-3p的下游靶基因，并可通過介導(dǎo)NF-κB通路，從而調(diào)控腦缺血性神經(jīng)細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥損傷［17］。首先，本課題組通過生信網(wǎng)站查到了miR-410-3p與HMGB1之間存在結(jié)合位點(diǎn)，為了進(jìn)一步確認(rèn)miR-410-3p與HMGB1之間的靶向關(guān)系，通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)miR-410-3p可負(fù)向調(diào)控HMGB1的表達(dá)。然后通過在缺血性PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-410-3p mimic序 列、HMGB1 vector載體和共轉(zhuǎn)染miR-410-3p mimic與HMGB1 vector載體。檢測各組細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥因子水平。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-410-3p可促進(jìn)缺血性神經(jīng)元增殖，抑制其細(xì)胞凋亡，并降低炎癥因子IL-8、IL-6、TNF-α水平。且同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-410-3p mimic與HMGB1 vector載體會(huì)抵消過表達(dá)miR-410-3p對缺血性神經(jīng)元細(xì)胞的影響。

本研究再次驗(yàn)證了miR-410-3p與HMGB1的靶向關(guān)系，并證實(shí)在缺血性神經(jīng)元細(xì)胞中miR-410-3p可通過負(fù)向調(diào)控HMGB1的表達(dá)，從而抑制NF-κB p65通路的活化，從而調(diào)控缺血性神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、凋亡和炎癥損傷。然而到目前為止，尚未能明確HMGB1/NF-κB通路對調(diào)控缺血性神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、凋亡和損傷的具體分子網(wǎng)絡(luò)，還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。