張鋒華

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司，上海 200436）

巴氏殺菌乳是重要的乳制品之一，近些年國內(nèi)市場在不斷增長，至2021年市場規(guī)模已超過400 億元人民幣[1]。乳含有豐富的營養(yǎng)成分[2-4]，還含有數(shù)百種生物活性物質(zhì)[5-7]。近些年，國內(nèi)外科研機構(gòu)對乳中各類活性物質(zhì)展開了研究[8-10]，其中免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是乳中最重要的生物活性蛋白之一，在增強機體的免疫能力、防止細菌和病毒入侵、活化補體、中和毒素、殺死腫瘤細胞等方面發(fā)揮重要作用[11-12]。乳中Ig包括IgG、IgA和IgM等[13]，其中IgG含量最高，占Ig總含量的80%以上。另外，乳過氧化物酶也是乳中一種重要的生物活性物質(zhì)，它是過氧化物酶家族的成員之一，是天然存在于乳汁中的一種血紅素蛋白[14]。乳過氧化物酶系統(tǒng)對多重耐藥的大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及單核細胞增生李斯特菌等病原菌的生長具有較強的抑制作用[15]。

巴氏殺菌工藝是為了避免人們受到生乳中病原微生物帶來的危害風險，使用特定的設(shè)備、規(guī)范的操作，對生乳采用的一種相對溫和的熱處理方法[16]。巴氏殺菌能最大限度保留牛乳中的生物活性物質(zhì)[17-18]，相比乳鐵蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等，IgG和乳過氧化物酶是熱敏性更高的2 類活性物質(zhì)[19-20]，相比于乳中其他酶類，乳過氧化物酶熱穩(wěn)定性較好[21]。歐盟曾將乳過氧化物酶作為巴氏殺菌工藝評價的指標之一，當巴氏殺菌乳中乳過氧化物酶陰性時，則判定為“熱處理過度”。另外，有研究發(fā)現(xiàn)無機微濾膜除菌可脫除99.8%～99.9%菌體，濾膜除菌結(jié)合較溫和巴氏殺菌工藝可以有效降低對巴氏殺菌的強度要求，從而保留更多的活性成分[22]。在國內(nèi)，巴氏殺菌的溫度-時間組合一直未被充分明確，GB 19645—2010《食品安全國家標準 巴氏殺菌乳》中未對“巴氏殺菌”有明確的要求，GB/T 27342—2009《危害分析與關(guān)鍵控制點體系 乳制品生產(chǎn)企業(yè)要求》中規(guī)定巴氏殺菌乳的殺菌溫度與時間組合分別為63～65 ℃、30 min或72～85 ℃、15～20 s，這個要求比較寬泛，所以實踐中許多國內(nèi)企業(yè)偏好于85 ℃殺菌，近些年由于優(yōu)質(zhì)乳工程的實施，乳企開始采用較低的殺菌強度。

本研究選用IgG和乳過氧化物酶2 種生物活性物質(zhì)，研究巴氏殺菌乳加工過程及貨架期內(nèi)含量和活性變化，旨在為行業(yè)開發(fā)更高品質(zhì)的巴氏殺菌乳及制定相關(guān)更為先進的標準提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳來自上海金山廊下牧場和江蘇射陽銀寶牧場，0～4 ℃保存，24 h內(nèi)使用。

Evergreen乳過氧化物酶活性檢測試劑盒 北京中檢葆泰生物技術(shù)有限公司；IgG標準品（純度≥95%）美國Sigma公司；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaOH、HCl、NaCl、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；實驗室用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

APV 2000均質(zhì)機、TP37SE中試殺菌機 美國APV公司；Micron SCT 19-P37-30GP50-23陶瓷膜過濾設(shè)備（1.4 μm） 美國Pall公司；1100高效液相色譜儀（配備紫外檢測器） 美國安捷倫公司；SelectCore Protein G親和柱、BioCore TMSEC-300液相色譜柱 納譜分析技術(shù)（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 IgG含量的測定

采用T/SSFS 0002—2021《乳及乳制品中免疫球蛋白IgG的測定 高效液相色譜法》分析牛乳樣品中IgG的含量變化：根據(jù)高效親和色譜原理，在磷酸鹽緩沖液條件下IgG與配基親和結(jié)合，在pH 3.0冰乙酸條件下洗脫IgG，通過凝膠過濾色譜進行檢測，外標法定量。

1.3.2 乳過氧化物酶活性的測定

將樣品或標準品加入微孔板中，隨后加入底物及終止液，溶液由藍色變?yōu)辄S色，在450 nm波長處測定吸光度；樣品中乳過氧化物酶活性與吸光度呈反比。具體測定方法參考T/CIFST 008—2022《乳中乳過氧化物酶活性的測定 比色法》[23]。

1.3.3 巴氏殺菌乳生產(chǎn)工藝流程

工藝流程1：生牛乳→均質(zhì)→殺菌→冷卻→灌裝

工藝流程2：生牛乳→脫脂→微濾膜除菌→標準化→均質(zhì)→殺菌→冷卻→灌裝

1.3.4 不同均質(zhì)工藝對牛乳中生物活性物質(zhì)的影響

將生牛乳分別預熱到60、65、70 ℃，采用20 MPa的壓力進行均質(zhì)，測定牛乳均質(zhì)前后IgG含量及乳過氧化物酶活性。

將生牛乳預熱到65 ℃，分別采用15、20、25 MPa的壓力進行均質(zhì)，測定牛乳均質(zhì)前后IgG含量及乳過氧化物酶活性。

1.3.5 不同殺菌工藝對巴氏殺菌乳中生物活性物質(zhì)的影響

取生牛乳，分別在72、73、74、75、76、78、80、85 ℃保持15 s，冷卻灌裝，冷藏備用。測定牛乳殺菌前后IgG含量及乳過氧化物酶活性。

1.3.6 不同工藝流程對巴氏殺菌乳中生物活性物質(zhì)的影響

取生牛乳，分別經(jīng)1.3.3節(jié)2 種工藝流程加工，測定巴氏殺菌乳IgG含量及乳過氧化物酶活性。其中工藝流程1采用75 ℃、15 s殺菌，工藝流程2采用膜濾除菌結(jié)合72 ℃、15 s殺菌。

1.3.7 不同貯存條件對巴氏殺菌乳中生物活性物質(zhì)的影響

將采用工藝流程1且使用75 ℃、15 s殺菌處理的巴氏殺菌乳置于屋頂盒中5 ℃保存7 d，分別在0、1、2、4、7 d測定IgG含量及乳過氧化物酶活性。

將采用工藝流程1且使用75 ℃、15 s殺菌處理的巴氏殺菌乳采用透明玻璃瓶灌裝，分別置于室內(nèi)日光燈照射和避光環(huán)境中，5 ℃保存，分別在0、1、2、3、4、5 d測定乳過氧化物酶活性。

1.3.8 牛乳中IgG含量剩余率及乳過氧化物酶活性剩余率計算

牛乳中IgG含量剩余率按式（1）計算。

式中：ρ1為生牛乳中IgG含量/（mg/L）；ρ2為不同工藝加工后牛乳或巴氏殺菌乳IgG含量/（mg/L）。

牛乳中乳過氧化物酶活性剩余率按式（2）計算。

式中：B1為生牛乳中乳過氧化物酶活力/（U/L）；B2為不同工藝加工后牛乳或巴氏殺菌乳中乳過氧化物酶活力/（U/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)兩兩比較采用t檢驗（成對雙樣本均值分析），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同均質(zhì)工藝對牛乳中生物活性物質(zhì)的影響

由圖1可知，生牛乳在65 ℃及以下的均質(zhì)溫度下，采用20 MPa的均質(zhì)壓力處理，對牛乳中IgG含量剩余率的影響較小，而同等壓力下當均質(zhì)溫度為70 ℃時，牛乳中IgG含量剩余率有了較為明顯的變化（P＜0.05）。而同樣在70 ℃、20 MPa的條件下，牛乳中乳過氧化物酶活性剩余率也顯著下降（P＜0.05）。所以在滿足均質(zhì)效果的前提下，采用65 ℃及以下的均質(zhì)溫度更有利于牛乳中生物活性物質(zhì)的保留。

圖1 不同均質(zhì)溫度下牛乳中IgG含量及乳過氧化物酶活性剩余率Fig.1 Residual levels of IgG content and lactoperoxidase activity in milk at different homogenization temperatures

由圖2可知，生牛乳在65 ℃的均質(zhì)溫度下，無論采用15、20 MPa還是25 MPa的均質(zhì)壓力處理，牛乳中IgG含量剩余率及乳過氧化物酶活性剩余率均差異不顯著。Pinho等[24]研究發(fā)現(xiàn)，采用100 MPa及以上的均質(zhì)壓力處理牛乳，其乳過氧化物酶的活性先降低，壓力升至150 MPa再升高，后又降低，壓力升至300 MPa完全失活。本研究采用的均質(zhì)壓力相對較小，能保證乳脂肪等的分散性，同時又不會對活性物質(zhì)產(chǎn)生太大影響。在實際應(yīng)用中應(yīng)同時考慮均質(zhì)效果及能耗進行工藝選擇。

圖2 不同均質(zhì)壓力下牛乳中IgG含量及乳過氧化物酶活性剩余率Fig.2 Residual levels of IgG content and lactoperoxidase activity in milk at different homogenization pressures

2.2 不同殺菌工藝對巴氏殺菌乳中生物活性物質(zhì)的影響

由圖3可知，當采用72 ℃、15 s的殺菌工藝時，巴氏殺菌乳中IgG含量及乳過氧化物酶活性剩余率最高，分別達86%和65%。隨著殺菌溫度的不斷提高，IgG含量及乳過氧化物酶活性剩余率不斷下降。當殺菌溫度超過76 ℃時，IgG含量剩余率急速下降，至80 ℃時已不足5%，此時乳過氧化物酶活性剩余率為0%。從72 ℃、15 s到76 ℃、15 s這一過程中，IgG含量剩余率下降幅度不大；在經(jīng)過76 ℃、15 s殺菌后，巴氏殺菌乳中IgG含量剩余率仍能保留在60%左右這一較高水平，乳過氧化物酶活性剩余率也能維持在20%左右。此殺菌強度下，乳鐵蛋白等其他多種活性成分也較好保留[25]。72～76 ℃、15 s可作為優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳的殺菌工藝參數(shù)，該殺菌溫度-時間組合除能保留更多生物活性物質(zhì)，同時也能有效殺滅病原菌，而且相比于GB/T 27342—2009的殺菌要求更加精確。另外，《美國優(yōu)質(zhì)乳條例》提到，如果某種乳制品的脂肪含量超出基礎(chǔ)產(chǎn)品10%或乳固體總量超出18%，應(yīng)將殺菌溫度提高3 ℃，這有助于對病原菌的殺滅[26]。近些年隨著我國生牛乳中蛋白、脂肪及總固體含量的不斷升高，市場上出現(xiàn)了較多固形物含量較高的巴氏殺菌乳產(chǎn)品，建議此類產(chǎn)品采用75 ℃、15 s的殺菌方式，國內(nèi)也有一些報道推薦該溫度條件，潘永勝[27]研究認為，75 ℃、15 s熱處理可推薦為優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳的生產(chǎn)條件。

圖3 不同殺菌工藝下巴氏殺菌乳中IgG含量及乳過氧化物酶活性剩余率Fig.3 Residual levels of IgG content and lactoperoxidase activity in milk with different sterilization processes

2.3 不同工藝流程對巴氏殺菌乳中生物活性物質(zhì)的影響

依據(jù)1.3.3節(jié)工藝流程1，殺菌強度采用75 ℃、15 s，工藝流程2，殺菌強度采用72 ℃、15 s，分別處理31 個生牛乳樣品。

由圖4可知，2 種工藝流程均能檢測出較高含量的IgG，分布在192～281 mg/L，而采用膜過濾方式的工藝流程制得的巴氏殺菌乳IgG含量總體相對稍高，IgG含量出現(xiàn)一定的波動可能是由于生牛乳中含量差異導致。

圖4 不同工藝流程下巴氏殺菌乳中IgG含量Fig.4 IgG content in milk under different pasteurization conditions

由圖5可知，2 種工藝流程均能檢測出較高的乳過氧化物酶活性，分布在3 824～8 341 U/L，采用膜過濾方式的工藝流程制得的巴氏殺菌乳乳過氧化物酶活性明顯更高。

圖5 不同工藝流程下巴氏殺菌乳中乳過氧化物酶活性Fig.5 Lactoperoxidase activity in milk under different pasteurization conditions

花榜清[28]研究濃縮、脫脂等工藝處理后乳過氧化物酶活性損失率的變化，本研究中工藝流程2包含脫脂、膜濾除菌等步驟，工序較為復雜，但膜濾除菌過程采用的溫度較低，基本不會對乳過氧化物酶活性造成大的影響。結(jié)果表明，殺菌強度對生物活性物質(zhì)含量的影響大于其他加工工序的影響。國際上，采用膜濾除菌結(jié)合巴氏殺菌處理牛乳也被推薦用于牛乳，以延長貨架期[29]。

2.4 不同貯存條件對巴氏殺菌乳中生物活性物質(zhì)的影響

巴氏殺菌乳一般置于2～6 ℃條件下冷藏保存。由圖6可知，在5 ℃條件下保存7 d，屋頂盒包裝巴氏殺菌乳IgG含量剩余率變化不明顯，而乳過氧化物酶活性剩余率有小幅下降，至第7天乳過氧化物酶活性剩余率在30%左右，還保留了一部分活性。所以在正常保質(zhì)期內(nèi)，巴氏殺菌乳中的生物活性物質(zhì)含量或活性不會隨著保存時間的延長而大幅降低。

圖6 不同貯藏時間下牛乳中IgG含量及乳過氧化物酶活性剩余率Fig.6 Residual levels of IgG content and lactoperoxidase activity in milk at different storage periods

乳過氧化物酶是一種光敏感性物質(zhì)，在光照下較易失活[30]。由圖7可知，透明材質(zhì)包裝的巴氏殺菌乳產(chǎn)品長時間處于光照下乳過氧化物酶活性剩余率會出現(xiàn)一定程度的下降，但并沒有完全失去活性，這可能是因為巴氏殺菌乳成分較為復雜，脂肪、蛋白等大分子的包裹對乳過氧化物酶產(chǎn)生了一定的保護作用。

圖7 不同光照條件下牛乳中乳過氧化物酶活性剩余率Fig.7 Residual levels of lactoperoxidase activity in milk under different light conditions

3 結(jié) 論

通過研究發(fā)現(xiàn)，采用65 ℃以下的均質(zhì)溫度及15～25 MPa的均質(zhì)壓力處理牛乳對其IgG含量和乳過氧化物酶活性的影響較小，可結(jié)合均質(zhì)效果選擇合適的均質(zhì)條件。相對于78～85 ℃、15 s的巴氏殺菌溫度-時間組合，72～76 ℃、15 s處理對2 種生物活性物質(zhì)影響較小，加工優(yōu)質(zhì)巴氏殺菌乳宜采用此組溫度-時間組合；采用膜濾除菌結(jié)合72 ℃、15 s殺菌可以在保證食品安全的前提下，更好地保留2 種生物活性物質(zhì)。在正常的保質(zhì)期內(nèi)，巴氏殺菌乳中的IgG含量和乳過氧化物酶活性不會隨著保存時間的延長而顯著降低，但采用透明包裝的產(chǎn)品長期暴露在光照下會造成乳過氧化物酶部分失活。