焦楊波，趙 潔

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

許多細(xì)菌作為病原菌與疾病密切相關(guān)，主要通過接觸、呼吸道、消化道及蚊蟲叮咬等途徑在健康人體間傳播疾病。細(xì)菌也在發(fā)酵食品[1-2]、環(huán)境處理[3-4]及醫(yī)藥[5]等多個(gè)領(lǐng)域被人類廣泛利用，例如，利用乳酸菌發(fā)酵酸乳、酵母菌釀酒，利用細(xì)菌進(jìn)行污水處理及部分抗生素的制造等。

對(duì)DNA、RNA、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控的DNA甲基化、RNA干擾、組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑等是表觀遺傳學(xué)的主要調(diào)控方式[6-7]。表觀遺傳廣泛存在于所有生命體中，原核生物因其結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，因此，DNA甲基化是原核生物表觀遺傳的主要調(diào)控手段。在不改變核苷酸序列的前提下，DNA甲基化不但可以幫助細(xì)菌構(gòu)建限制修飾系統(tǒng)來抵御外源DNA的入侵，而且可以控制基因的表達(dá)，是細(xì)菌進(jìn)化和繁衍過程的重要部分[8]。

本文主要結(jié)合已有細(xì)菌甲基化研究，介紹甲基化及測(cè)序技術(shù)在病原菌、乳酸菌DNA甲基化等方面的研究。

1 甲基化組學(xué)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，測(cè)序技術(shù)與生物信息學(xué)分析日趨成熟。因此，從基因組層面了解細(xì)菌愈發(fā)便利。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾可能是造成不同菌株間基因型相似而表型存在差異的原因[9-10]。表觀遺傳學(xué)調(diào)控是指由于化學(xué)修飾等原因?qū)е禄虮磉_(dá)發(fā)生可遺傳的變化。DNA甲基化是研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，其機(jī)制是由于甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，MTase）將S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）上的甲基基團(tuán)（—CH3）轉(zhuǎn)移至腺嘌呤和胞嘧啶而形成的[8]，其特點(diǎn)是不改變基因序列。在細(xì)菌基因組中存在3 種DNA甲基化形式[11-13]：N6-甲基腺嘌呤（6mA）、N4-甲基胞嘧啶（4mC）和5-甲基胞嘧啶（5mC），研究最多的是6mA和4mC。真核生物中主要存在5mC，動(dòng)物基因組甲基化主要是CG堿基的甲基化[14]；高等植物中通常存在于CG、CHG和CHH（H為A、T或C堿基）3 個(gè)序列中，且在不同植物中觀察到的甲基化程度不同[15]；脊椎動(dòng)物DNA甲基化的分布范圍具有全局性[16]。以細(xì)菌為代表的原核生物中，SAM在MTase的作用下將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第4位碳上形成4mC，轉(zhuǎn)移到胞嘧啶第5位碳上形成5mC，轉(zhuǎn)移到腺嘌呤的第6位碳上形成6mA[17]。

1.1 MTase

細(xì)菌以SAM作為甲基供體，通過與限制修飾系統(tǒng)相關(guān)的MTase和孤兒MTase兩類酶實(shí)現(xiàn)6mA、5mC和4mC甲基化修飾；6mA在細(xì)菌中出現(xiàn)的頻率最高，它在原核生物中對(duì)于調(diào)控DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞防御起著重要作用[18]。4mC在細(xì)菌中出現(xiàn)的頻率低于6mA，嗜熱菌的甲基化修飾以4mC為主[19]。細(xì)菌之所以能保持自身的穩(wěn)定遺傳，是由于其擁有一種免疫系統(tǒng)或防御機(jī)制[20]，這種機(jī)制或系統(tǒng)被稱為限制性修復(fù)系統(tǒng)，它的作用包括阻止細(xì)菌內(nèi)源DNA降解以及阻擋外源DNA入侵，從而保護(hù)細(xì)菌。

與限制性修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)的MTase，可以識(shí)別出發(fā)生甲基化的基因位點(diǎn)和限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)一致的DNA序列，從而阻止胞內(nèi)產(chǎn)生DNA致死性切割[21]。而在細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)發(fā)揮作用的孤兒MTase，與限制性修復(fù)系統(tǒng)相關(guān)的MTase不同的是，它沒有與之對(duì)應(yīng)有功能的限制性核酸內(nèi)切酶[22]。孤兒MTase主要分為3 種：DNA腺嘌呤MTase（DNA adenine MTase，Dam）、細(xì)胞周期調(diào)控MTase（cell cycle-regulated MTase，CcrM）和DNA胞嘧啶MTase（DNA cytosine MTase，Dcm）[23]。與限制修飾系統(tǒng)相關(guān)的MTase和孤兒MTase這2 種酶對(duì)于細(xì)菌除了具有防御功能外，還在細(xì)菌的其他方面起著重要作用，例如，細(xì)菌的進(jìn)化及基因表達(dá)調(diào)控[24]。表1呈現(xiàn)了不同甲基化類型細(xì)菌MTase及識(shí)別基序。

表1 不同甲基化類型細(xì)菌MTase及識(shí)別基序Table 1 Bacterial MTase and recognition motifs of different methylation types

1.2 甲基化組學(xué)在細(xì)菌病原菌方面的應(yīng)用

基于噬菌體侵染細(xì)菌的研究開啟了原核生物DNA甲基化的研究。由于噬菌體侵染細(xì)菌宿主，呈現(xiàn)出不同的甲基化模式，也正是因?yàn)檫@種不同的模式保護(hù)宿主的基因免受同源性限制性內(nèi)切酶的消化，并能防止宿主免受外源噬菌體DNA的侵染[30]。

在原核生物中，DNA甲基化參與防止外來DNA入侵、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA錯(cuò)配修復(fù)和基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)細(xì)胞過程[24]。Blow等[30]通過對(duì)200余種不同細(xì)菌和古細(xì)菌等的研究發(fā)現(xiàn)，超過180 種（高于90%）的生物體中存在DNA甲基化，并在生物體的毒力調(diào)節(jié)、抗生素耐藥性、氧化適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)匱乏等生理生化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。5mC和4mC甲基化修飾信號(hào)對(duì)幽門螺桿菌的生命活動(dòng)起著重要作用。Kumar等[31]研究發(fā)現(xiàn)，5mC參與幽門螺桿菌調(diào)控基因的表達(dá)，在其運(yùn)動(dòng)性、黏附和毒力中起著重要作用。隨后，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有全局性的表觀調(diào)控因子4mC參與幽門螺桿菌致病機(jī)制，與4mC修飾相比，缺失4mC修飾的菌株中102 個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，主要體現(xiàn)在菌株自然轉(zhuǎn)化能力、編碼毒力基因、核糖體組裝和細(xì)胞成分等方面[12]。此外，Cohen等[32]研究抗生素脅迫對(duì)大腸桿菌表型的影響，從基因組角度解釋其存活情況，結(jié)果表明，基序GATC發(fā)生6mA甲基化的菌株會(huì)對(duì)其存活有促進(jìn)作用，而未發(fā)生6mA甲基化的菌株，整個(gè)細(xì)胞會(huì)發(fā)生毒性DNA斷裂。Nye等[33]利用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序（single molecule real time sequencing，SMRT）技術(shù)對(duì)化膿性鏈球菌MEW123進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果共測(cè)出6mA甲基化位點(diǎn)412 個(gè)，發(fā)生在基因組的基因編碼區(qū)（92%）的6mA甲基化位點(diǎn)占比很大，且正是這些甲基化修飾的存在影響毒力基因Mga的表達(dá)。

1.3 乳酸菌甲基化組學(xué)

目前，有關(guān)甲基化的研究主要是針對(duì)致病菌，而極少有優(yōu)良發(fā)酵劑乳酸菌的甲基化研究。世界上第1株和中國(guó)第1株全基因組測(cè)序的乳酸菌分別于2001年和2008年完成[34-35]，至此標(biāo)志著乳酸菌基因組時(shí)代的來臨?；诨蚯贸MRT等技術(shù)手段對(duì)益生菌干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus caseiZhang）的LCAZH_2056（pglX）和LCAZH_20542 種基因MTase的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株基因組上的6mA甲基化表型不僅可以調(diào)控菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響菌株生長(zhǎng)，還有利于菌株的抗氧脅迫能力[36]。鄭慧娟等[26]通過對(duì)2 株乳酸乳球菌乳酸亞種IMAU10978和BL19的研究發(fā)現(xiàn)，2 株乳酸菌在發(fā)酵表型上存在差異。例如，發(fā)酵速率、蛋白質(zhì)水解與產(chǎn)生香氣物質(zhì)等方面，這些發(fā)酵特性差異有可能與6mA甲基化密切相關(guān)。此外，結(jié)合基因組學(xué)和甲基化組學(xué)對(duì)嗜熱鏈球菌的基因型和生產(chǎn)功能特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多個(gè)差異甲基化基因富集于嘌呤代謝和萜類化合物骨架生物合成等代謝通路，而這些代謝通路有可能是調(diào)控嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸特性的因素[37]，揭示了甲基化對(duì)嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸特性可能的調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，在不改變遺傳信息的情況下，DNA甲基化同樣對(duì)乳酸菌的基因表達(dá)和表觀特性產(chǎn)生影響。甲基化現(xiàn)象與乳酸菌的重要生理過程密切相關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)乳酸菌甲基化修飾及其生物學(xué)效應(yīng)的系統(tǒng)報(bào)道較少。解密乳酸菌基因組上的DNA甲基化“遺傳密碼”能夠?yàn)槿樗峋δ芑蚪M學(xué)和生物特性研究以及優(yōu)良乳酸菌菌種篩選及其應(yīng)用開發(fā)提供理論參考。

2 甲基化組學(xué)研究技術(shù)

過去幾十年，由于測(cè)序技術(shù)迅速發(fā)展，使得測(cè)序成本不斷降低，為基因組研究帶來極大利好。Zhao Jie等[38]對(duì)分離自中國(guó)和蒙古國(guó)不同地區(qū)發(fā)酵乳中的185 株嗜熱鏈球菌進(jìn)行基因組重測(cè)序，從群體遺傳學(xué)角度解析嗜熱鏈球菌基因型與表型之間的關(guān)系，定位與產(chǎn)酸能力相關(guān)的功能基因。在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步在表觀遺傳學(xué)上探索嗜熱鏈球菌表型特征差異產(chǎn)生的本質(zhì)。將基因組測(cè)序技術(shù)運(yùn)用到DNA甲基化修飾研究中，可以在全基因組層面獲得更全面的DNA甲基化信息。

2.1 傳統(tǒng)甲基化檢測(cè)技術(shù)

傳統(tǒng)的甲基化檢測(cè)方法由于自身存在一定的局限性，只能對(duì)發(fā)生甲基化修飾的DNA含量和類型進(jìn)行定量和鑒別，未能對(duì)特定的序列和單核苷酸水平上的全基因組甲基化進(jìn)行分析，從而無(wú)法找到新的甲基化位點(diǎn)[39]。隨著重亞硫酸鹽測(cè)序的出現(xiàn)，解決了這一難題，因此該測(cè)序的發(fā)現(xiàn)被譽(yù)為是DNA甲基化研究中的里程碑[40]。利用重亞硫酸鹽法處理DNA，可以將沒有發(fā)生甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，從而可以從單個(gè)核苷酸檢測(cè)的水平檢測(cè)到胞嘧啶甲基化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)胞嘧啶甲基化的全基因組分析。與未發(fā)生甲基化的DNA相比，DNA中發(fā)生的甲基化產(chǎn)生了不同堿基組成，這種差異容易使用常規(guī)的測(cè)序技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定量分析。而對(duì)于腺嘌呤甲基化的研究則起步較晚，在20余年以后才隨著SMRT的發(fā)展達(dá)到了單堿基的分辨率[36]。

根據(jù)原理，目前DNA甲基化檢測(cè)方法可分為3 類。第1類是鑒定DNA序列甲基化狀態(tài)，這類方法主要是使用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶鑒定[41-42]。再結(jié)合Southern印跡區(qū)分非甲基化與甲基化相關(guān)序列，此法僅對(duì)已知限制性酶切作用位點(diǎn)情況下適用。第2類是以重亞硫酸鹽修飾DNA為基礎(chǔ)而發(fā)展的多種檢測(cè)方法[43-44]，例如，用亞硫酸鈉處理甲基化DNA，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及測(cè)序技術(shù)鑒定序列差異性的甲基化特異PCR法等，對(duì)胞嘧啶甲基化具有很高的靈敏性，但是對(duì)于4mA和6mA不適用。第3類是一些其他方法[45-47]，例如，將DNA降解為單核苷酸后再利用液相色譜或氣相色譜等精密儀器檢測(cè)、利用特異性識(shí)別甲基化修飾DNA的蛋白或抗體等，從而可以更精確、靈敏地檢測(cè)甲基化信號(hào)，但是仍無(wú)法確定發(fā)生甲基化的具體位點(diǎn)。其中以重亞硫酸鹽修飾DNA是甲基化分析研究的重要方法，重亞硫酸鹽測(cè)序主要應(yīng)用于真核生物的甲基化檢測(cè)，步驟是基于2代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)預(yù)先重亞硫酸鹽處理的DNA再PCR擴(kuò)增基因模板進(jìn)行測(cè)序，后續(xù)結(jié)合生物信息學(xué)分析甲基基團(tuán)的修飾及修飾的定位[40,48-50]。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有很多局限性。例如，操作過程耗時(shí)、繁瑣、對(duì)儀器要求嚴(yán)格、成本高等缺點(diǎn)。不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且無(wú)法分析整個(gè)基因組的甲基化，很難找到新的甲基化位點(diǎn)[51]。

2.2 SMRT技術(shù)在細(xì)菌甲基化修飾中的應(yīng)用

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和革新，以SMRT為代表的第3代測(cè)序技術(shù)已漸漸趨于成熟，并且獲得研究人員的青睞。SMRT是先用熒光標(biāo)記樣品核苷酸實(shí)時(shí)成像，與此同時(shí)沿著單個(gè)DNA模板進(jìn)行合成的一種測(cè)序技術(shù)，零模波導(dǎo)（zero-mode waveguides，ZMW）孔是一種直徑20～50 nm的圓形納米孔，是SMRT技術(shù)的核心，對(duì)于SMRT技術(shù)實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵因素之一的DNA聚合酶被固定在ZMW底部[52]。DNA聚合酶除了實(shí)現(xiàn)DNA的合成速率外，同時(shí)還能保持測(cè)序延續(xù)性。本研究團(tuán)隊(duì)利用SMRT技術(shù)和2代測(cè)序技術(shù)對(duì)植物乳桿菌P-8（Lactobacillus plantarumP-8）進(jìn)行基因組測(cè)序比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMRT技術(shù)多檢測(cè)出1 個(gè)GC含量為39.7%、長(zhǎng)度為15.174 kb的質(zhì)粒[53]。

由于SMRT測(cè)序成本低、超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、精準(zhǔn)性高、速度快等突出優(yōu)點(diǎn)被迅速應(yīng)用到DNA甲基化研究中[54-55]，全基因組水平上分析DNA甲基化圖譜得以實(shí)現(xiàn)，它能夠快速、高效地識(shí)別甲基化，并且可以直接對(duì)6mA、5mC和4mC 3 種甲基化類型同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并且利用生物信息學(xué)分析可以得到多種不同種類的甲基化基序[37,55]。SMRT技術(shù)在其測(cè)序過程中會(huì)出現(xiàn)脈沖記錄峰，在檢測(cè)過程中若檢測(cè)到有修飾的堿基時(shí)，脈沖峰會(huì)發(fā)生變化[19]。這一技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)在于能夠使整個(gè)基因組產(chǎn)生6mA、5mC等檢測(cè)信號(hào)，且對(duì)于不同甲基化修飾的檢測(cè)靈敏度由高到低依次為6mA、5mC和4mC[19,56]。利用“邊合成邊測(cè)序”的第3代測(cè)序技術(shù)，使得從單分子水平對(duì)生物分子的實(shí)時(shí)分析得以實(shí)現(xiàn)，無(wú)需PCR擴(kuò)增[57]。

在牛結(jié)核分枝桿菌無(wú)毒株卡介苗BCG的研究中，采用第3代測(cè)序技術(shù)對(duì)BCG菌株測(cè)序分析，結(jié)果顯示，BCG菌株含有3 種DNA甲基化基序位點(diǎn)，且均為6mA修飾[58]。Murray等[59]對(duì)硫還原泥土桿菌（Geobacter metallireducens）、需鹽色鹽桿菌（Chromohalobacter salexigen）、布羅加尼弧菌（Vibrio breoganii）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）的2 個(gè)亞種，共6 株細(xì)菌采用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，得到這些細(xì)菌的甲基化信息，與以往的研究方法結(jié)果不同，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新的6mA和4mC甲基化模式，并鑒別出不同甲基化模式相應(yīng)的DNA MTase。Krebes等[60]對(duì)2 株幽門螺桿菌的甲基化組進(jìn)行研究，不同菌株間甲基化模式有很大區(qū)別，高度甲基化存在于幽門螺桿菌基因組中，且對(duì)基因表達(dá)、宿主間相互作用及菌株致病性有影響，豐富了幽門螺桿菌的遺傳多樣性。此外，Cooper等[61]也采用PacBio SMRT測(cè)序技術(shù)對(duì)4 株不同血清型的大腸埃希氏菌（Escherichia coli）基因組進(jìn)行測(cè)定。該研究表明，有一部分菌株毒力產(chǎn)生與其DNA的甲基化相關(guān)，這4 株不同血清型菌株的祖先都是能夠致使胃腸道感染的腸道致病性大腸桿菌，但也有一部分菌株的毒力產(chǎn)生是由于獲得產(chǎn)志賀毒素的原噬菌體而逐漸轉(zhuǎn)化為毒力型菌株。以上研究均已表明，SMRT技術(shù)在原核細(xì)菌（尤其是致病菌）中由于不同DNA甲基化模式，導(dǎo)致菌株間毒力產(chǎn)生、基因表達(dá)及生命活動(dòng)發(fā)生差異中已有應(yīng)用，且被越來越多的學(xué)者研究。對(duì)于乳酸菌甲基化研究，目前正處于起步階段。

2.3 SMRT技術(shù)在乳酸菌甲基化修飾中的應(yīng)用

Zhang Wenyi等[62]利用SMRT測(cè)序?qū).caseiZhang和L.plantarumP-8進(jìn)行甲基化組分析，在L.caseiZhang基因組中鑒定識(shí)別到一種6mA甲基化修飾，而L.plantarumP-8中未發(fā)現(xiàn)。宋宇琴[63]利用SMRT方法，在9 株保加利亞乳桿菌的基因組中發(fā)現(xiàn)了6mA和4mC甲基化修飾及37 個(gè)甲基化基序，構(gòu)建出德氏乳桿菌保加利亞亞種的甲基化位點(diǎn)圖譜；菌株的發(fā)酵特性與發(fā)生甲基化修飾有關(guān)，或是參與菌株對(duì)于外來入侵的防御機(jī)制和功能基因的調(diào)控；此外，利用SMRT對(duì)產(chǎn)酸性能差異較大的22 株代表性嗜熱鏈球菌進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，被劃分為快產(chǎn)酸和慢產(chǎn)酸的2 個(gè)類群菌株存在多個(gè)4mC和6mA差異甲基化基因。上述研究均已顯示出基于SMRT技術(shù)的DNA甲基化分析在乳酸菌中得到應(yīng)用，而且會(huì)應(yīng)用越來越廣泛，并逐漸發(fā)展為探索乳酸菌基因型與表型特征相關(guān)性的一種技術(shù)手段。從甲基化修飾角度對(duì)乳酸菌進(jìn)行研究，極大豐富了人們對(duì)乳酸菌的認(rèn)識(shí)，為深入解析乳酸菌的遺傳進(jìn)化歷程、乳酸菌資源的利用和優(yōu)良發(fā)酵劑的研究提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

3 結(jié) 語(yǔ)

DNA甲基化是非常重要的基因表達(dá)調(diào)控之一，其在細(xì)菌疾病的研究中越來越占據(jù)重要的地位，而對(duì)于發(fā)酵食品乳酸菌的研究正處于起步階段。DNA甲基化的發(fā)生有利于細(xì)菌高水平基因表達(dá)的實(shí)現(xiàn)，對(duì)于細(xì)菌適應(yīng)各種不同的生活環(huán)境提供了獨(dú)立于DNA序列變化的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，因此其可以成為微生物耐藥性、抗逆性和致病性等諸多菌種特殊性能研究以及微生物與環(huán)境相互作用研究的熱點(diǎn)前沿。不同的檢測(cè)方法具有其獨(dú)特的優(yōu)越性和局限性。SMRT為DNA甲基化研究提供了新的平臺(tái)，由于其成本低、超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、精準(zhǔn)性高、速度快等突出優(yōu)點(diǎn)被迅速應(yīng)用到DNA甲基化研究中。將乳酸菌的甲基化組學(xué)研究與SMRT技術(shù)相結(jié)合，有助于獲得甲基化位點(diǎn)的特征和在乳酸菌中整個(gè)基因組的準(zhǔn)確分布，以及特定MTase相關(guān)基因的表達(dá)，更有助于理解甲基化修飾在乳酸菌中的發(fā)生和在乳酸菌發(fā)酵機(jī)制中的作用。此外，它可以成為研究乳酸菌基因型和表型相關(guān)性的一種方法，豐富對(duì)于乳酸菌的認(rèn)識(shí)，從基因水平揭示乳酸菌在發(fā)酵食品方面的機(jī)理，從而可以為發(fā)酵工業(yè)優(yōu)良乳酸菌的篩選和應(yīng)用提供理論參考。