楊津先，齊志明，尹夢虹

（1.大連市第二人民醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116000；2.大連市中心醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116000）

骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）屬于骨科的流行病，具有較高的發(fā)病率和患病率，影響全世界億萬老年人的健康生活[1]。白細胞介素-1β（IL-1β）在OA患者軟骨的降解中起著關鍵作用，可減弱凝集素的分泌，從而降解軟骨[2]。同時，它也可以抑制軟骨表達Ⅱ型膠原以及軟骨聚集蛋白聚糖[3]，使軟骨細胞外基質合成不足。原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC）為抗氧化劑，可增加超氧化物歧化酶活性[4]，其抑制軟骨細胞的凋亡的作用已經(jīng)在前期的研究中被證實[5]。本研究主要對OPC抑制的由IL-1β誘導的已凋亡的軟骨細胞mRNA進行相關測序分析。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品與試劑 原花青素（長沙贏潤生物科技有限公司）；原代小鼠軟骨細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；DMEM/F12 （深圳博興生物科技有限公司）；胎牛血清（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）；胰蛋白酶（長沙贏潤生物科技有限公司）；Ⅱ型膠原酶（長沙贏潤生物科技有限公司）；RNAiSO（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）；無水乙醇（長沙贏潤生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺（青島瀚生生物科技股份有限公司）；CO2恒溫箱（上海捷諾生物科技有限公司）；低速臺式離心機（青島瀚生生物科技股份有限公司）；冷凍高速離心機（長沙贏潤生物科技有限公司）；分光光度計（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）；高壓滅菌鍋（長沙贏潤生物科技有限公司）；倒置顯微鏡（珠海市麗拓生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片數(shù)據(jù)來源與分析 以NCBI數(shù)據(jù)平臺GEO作為數(shù)據(jù)庫挖掘對象，共挖掘到6個GSE104793的數(shù)據(jù)樣本，其中3個以尚未經(jīng)過處理的原代小鼠的關節(jié)軟骨細胞作為研究對象，另外3個以加入IL-1β的關節(jié)軟骨細胞作為研究對象，采用R數(shù)據(jù)庫的limma包完成差異表達分析，|log2Fold Change|＞1，采用R數(shù)據(jù)庫的Cluster Profiler包完成KEGG富集分析。

1.2.2 模型的構建 取原代小鼠軟骨細胞，分為對照組和實驗組。對照組中的IL-1β溶液終濃度為10 μg/L；實驗組中IL-1β濃度為10 μg/L、OPC濃度為50 μg/ml；在本研究中，前期表型實驗已經(jīng)初步確定了可用于小鼠IL-1B軟骨細胞凋亡模型的OPC最適合濃度[5]。兩組均放置在37 ℃、5% CO2孵箱中開始培養(yǎng)，1個培養(yǎng)周期為24 h，培養(yǎng)周期結束后提取細胞。

1.2.3 高通量測序 按照說明書使用RNAiSO（青島瀚生生物科技股份有限公司）提取RNA并進行文庫構建，之后使用高通量測序技術，完成pooling任務后，以一邊合成一邊測序的原則來進行Illumina測序，對測序數(shù)據(jù)進行過濾，獲得fastq文件。該部分由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.4 mRNA的表達差異分析 采用fastqc進行質控，采用STAR軟件比對并獲得基因讀數(shù)。實驗組與對照組間的樣品差異化表達檢測為采用R-3.6.2中的DESeq2包對基因的表達進行差異分析（篩選條件：|log2Fold Change|＞1，顯著性P-Value＜0.05）；使用ggplots2繪制火山圖；熱圖可以把實驗中數(shù)據(jù)的相關質量控制以及差異數(shù)據(jù)來進行具像化展示。篩選表達差異倍數(shù)|log2Fold Change|＞8，顯著性P-Value＜0.05。采用pheatmap包來確定并繪制heatmap圖。

1.2.5 功能富集分析 采用GO數(shù)據(jù)庫進行基因功能分類；采用KEGG數(shù)據(jù)庫對代謝途徑、基因產(chǎn)物功能及其相關信號通路進行系統(tǒng)分析。

1.2.6 GSE104793與實驗測序數(shù)據(jù)的差異表達基因比較 GSE104793表達水平的調整及其變化趨勢均進行記錄，同時關注與GSE104793表達水平的調整及其變化趨勢有關的基因，并繪制韋恩圖。

2 結果

2.1 GSE104793數(shù)據(jù)的差異表達基因及KEGG通路富集分析

2.1.1 GSE104793數(shù)據(jù)的mRNA表達量分析 共篩選出843個差異的mRNA，其中496個mRNA表達上調，347個mRNA表達下調，見圖1。

圖1 GSE104793數(shù)據(jù)差異表達基因火山圖

2.1.2 GSE104793數(shù)據(jù)中KEGG信號通路的富集分析 對GSE104793數(shù)據(jù)的KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達mRNA主要集中在細胞因子以及細胞因子受體的相互作用、細胞粘附分子細胞外基質-受體相互作用、細胞周期、Toll樣受體信號通路，還有癌癥的徑等信號通路上，見圖2。

圖2 差異表達基因的KEGG信號通路富集分析圖

2.2 高通量測序結果

2.2.1 mRNA表達量的分析 662個有差異的mRNA從自測的數(shù)據(jù)中被篩選出，與對照組相比，實驗組中mRNA表達上調255個，mRNA表達下調407個，見圖3。

2.2.2 GO富集分析 GO富集分析顯示，差異表達mRNA主要集中在白細胞的遷移、單核細胞遷移等，見圖4A；差異表達的mRNA主要參與在細胞外基質、膜區(qū)、膠原蛋白細胞外基質等，見圖4B。

2.2.3 KEGG信號通路的富集分析 KEGG富集分析結果顯示，差異表達mRNA主要集中在NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路等信號通路上，見圖5。

圖5 差異表達基因KEGG信號通路富集分析圖

2.3 GSE104793差異表達基因比較 差異表達mRNA篩選按以下兩條原則開展：方法A：GSE104793中表達水平下降，但測序數(shù)據(jù)出現(xiàn)中表達水平上升，篩選交集基因9個；方法B：GSE104793中表達水平上升，但測序數(shù)據(jù)中表達水平下降，篩選交集基因29個，見圖6。

圖6 差異表達基因韋恩圖

3 討論

OA的臨床特征是關節(jié)出現(xiàn)疼痛、僵硬、關節(jié)軟骨產(chǎn)生變性、關節(jié)內炎癥伴滑膜炎以及關節(jié)周圍和軟骨下骨的改變，IL-1β與軟骨退化密切相關，在基礎研究開展的過程中，也經(jīng)常被用于各種骨關節(jié)進行性疾病的造模。有研究指出，人體關節(jié)炎發(fā)生病變的滑液中存在IL-1，其中以IL-1β為主，其存在可使得軟骨細胞產(chǎn)生變性，并且對蛋白多糖的合成以及軟骨細胞增值產(chǎn)生抑制。NF-κB也可作為IL-1主要的下游信號相關傳導效應子，IκBα被IκB激酶磷酸化后，NF-κB二聚體將呈現(xiàn)暴露形態(tài)，其核定位也會相對容易，同時結合核內DNA表達特征發(fā)生變化，疼痛骨性關節(jié)炎誘導與其活性息息相關。

研究表明OA軟骨中TLR-2和TLR-4的表達升高，抑制骨關節(jié)炎中TLR-4和NF-κB的活化可減輕炎癥、疼痛和軟骨退變[3]。同時，IL-1β mRNA表達通過TLR-4激活而增加。在OA中，細胞的外基質合成若不足，是導致軟骨變性和凋亡的原因之一。本研究通過對高通量測序結果分析，根據(jù)分析結果推測，OPC下調IL-1β誘導的軟骨細胞模型中相關的差異基因具有各自的生物學特征。PAK是位于人類第18號染色體長臂上的基因片段，編碼具有EGF樣結構域的高度保守蛋白。在PAK相關的研究中發(fā)現(xiàn)，PAK在淋巴系統(tǒng)發(fā)育和血管內皮生成中發(fā)揮重要作用。在軟骨細胞炎癥以及多項惡性炎癥研究發(fā)現(xiàn)，PAK普遍呈低表達趨勢，進一步支持PAK是一種潛在的炎癥抑制因子。作為PAK上游的TLR/NF-κB過表達可抑制MMPs，導致上述炎癥細胞具有更強的侵襲能力。然而，在其他的炎癥反應中，PAK卻表現(xiàn)出相反的作用，可能會促進炎癥的發(fā)生[2]。

PAK的過表達與患者預后不良顯著相關，作者解釋這可能是炎癥起源不同所致。MMPs位于第9號染色體長臂上，其所編碼的多巴胺β羥化酶（DBH），參與機體最重要的兒茶酚胺合成代謝。交感神經(jīng)系統(tǒng)的節(jié)后神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)遞質，包括多巴胺、去甲腎上腺素和腎上腺素。MMPs是多巴胺轉化為去甲腎上腺素的重要催化酶。在DBH缺乏的情況下，多巴胺轉化為去甲腎上腺素路徑受阻，繼而代謝生成高香草酸（HVA）。已有研究證明，高HVA/VMA（香草扁桃酸）比值對侵襲性已凋亡軟骨細胞具有預后價值。

CNTN1位于第12號染色體的長臂上，是一種神經(jīng)細胞粘附分子，屬于免疫球蛋白超家族 （IgSF） 的糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的神經(jīng)細胞粘附分子。目前CNTN1與炎癥的發(fā)生機制尚不明確，但是有研究表明它的異常激活與細胞增殖、侵襲、轉移和預后不良等病理表型有關。CNTN1參與惡性炎癥的各種信號通路，如VEGFC-VEFGR3/Flt4軸、PI3K/AKT通路、Notch通路和上皮間質轉化（EMT）等。

本研究不足之處：本研究屬于回顧性研究，樣本量小，存在數(shù)據(jù)偏移。此外，除了KEGG數(shù)據(jù)庫之外，也有許多的生物信息數(shù)據(jù)庫被廣泛用于基礎醫(yī)學及分子生物學的大數(shù)據(jù)挖掘；如TARGET數(shù)據(jù)庫是由美國國家癌癥研究所（NCI）等組織研究和建立的，它主要是利用分子特征來描述難治性兒童炎癥發(fā)生和進展中基因變化，后續(xù)可以對這些數(shù)據(jù)庫展開進一步挖掘。

綜上所述，OPC對于OA的預防、治療以及緩解機制的作用還需要開展進一步的研究和驗證。