袁麗欣，劉泓江，王書晗，關(guān)又芳，臧德躍，林柏佑，王爾一

（深圳市醫(yī)療器械檢測中心，廣東 深圳 518000）

優(yōu)化精子是在人工授精過程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，能有效提升男性精子活力和質(zhì)量，提高受精成功率，降低畸形胚胎的形成，從而達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的[1，2]。而人工授精中使用的洗精液是《醫(yī)療器械分類目錄》中風(fēng)險(xiǎn)程度最高的第三類醫(yī)療器械[3，4]，本研究對該產(chǎn)品進(jìn)行體外鼠胚試驗(yàn)及囊胚細(xì)胞染色和計(jì)數(shù)良好囊胚數(shù)。常用的體外鼠胚試驗(yàn)的基本指標(biāo)是囊胚形成率，然而這一指標(biāo)已不能完全符合輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的要求[5-7]。大量研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，胚胎細(xì)胞數(shù)及囊胚細(xì)胞系分類計(jì)數(shù)是一種簡單實(shí)用的試驗(yàn)方法，該方法是在原有的鼠胚試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加了兩個(gè)檢測指標(biāo)，分別為胚胎的細(xì)胞總數(shù)和囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的總數(shù)。本研究通過試驗(yàn)對該洗精液進(jìn)行評價(jià)，以期為該產(chǎn)品的發(fā)展及其在生物臨床應(yīng)用中提供安全可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品 洗精液：主要由氨基酸、葡萄糖、丙酮酸鹽、人血清白蛋白等組成。

1.2 試驗(yàn)體系 6～8周齡B6D2F1雌鼠及性成熟B6D2F1雄鼠各10只，動(dòng)物來源：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2021-0006。動(dòng)物管理：飼養(yǎng)：按照ISO 10993-2的規(guī)定進(jìn)行；食物：使用由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供的飼料；飲水：供給經(jīng)滅菌的城市生活用水；環(huán)境：每日監(jiān)測室溫及環(huán)境濕度，將溫度范圍控制在20 ℃～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%。

1.3 主要儀器 熒光倒置顯微鏡（Leica，型號：DMi8 automated）、體視顯微鏡（Leica，型號：S8APO）、蜂巢式CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，型號：FORMA STERI-CYCLE i250）、生物安全柜（Thermo，型號：MSC Advantage 1.8）、顯微鏡透明熱臺（Tokai Hit，型號：MAST-SZ2）。

1.4 主要試劑 孕馬血清促性腺激素（PMSG）（寧波第二激素廠，批號：2 1 0 7 2 7）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）（寧波第二激素廠，批號：210804）、M2操作液（Sigma，批號：SLCH1397）、Triton X-100（Sigma，批號：SLCF5969）、透明質(zhì)酸酶（Sigma，批號：SLBS2130V）、礦物油（Sigma，批號：MKCM5905）、PBS緩沖液（Gibco，批號：2412439）、PI染色液（Sigma，批號：WXBD3718V）、Anti-UTF1（一抗）（Abcam，批號：GR3212508-2）、AF488（二抗）（全式金，批號：P20610）、30%山羊血清（Scientific Phygene，批號：20211203）、多聚甲醛（PFA）（Biosharp，批號：71050405）、牛血清白蛋白（Sigma，批號：WXBD4426V）。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 體外鼠胚試驗(yàn) 超數(shù)排卵：選擇6～8周齡B6D2F1雌鼠，經(jīng)腹腔注射PMSG 10 IU/只；48 h后經(jīng)腹腔注射 hCG 10 IU/只，注射hCG當(dāng)天雌鼠與同品系雄鼠合籠過夜。準(zhǔn)備培養(yǎng)皿：取胚前1 d下午，在35 mm培養(yǎng)皿中用KSOM培養(yǎng)液制做數(shù)滴30 μl的培養(yǎng)微滴，表面覆蓋培養(yǎng)油，按需制備，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱過夜平衡，時(shí)間約16 h。鼠胚采集：于合籠第2天早上檢查小鼠交配情況，選擇見栓小鼠備用。1-細(xì)胞胚胎收集：注射hCG 18 h后處死見栓雌鼠，將輸卵管壺腹部劃破，將收集到的絮狀受精卵團(tuán)放置到提前預(yù)熱至37 ℃的透明質(zhì)酸酶液滴中，當(dāng)胚胎周圍的卵丘和顆粒細(xì)胞被消化分離后，立即轉(zhuǎn)移到M2操作液中清洗，挑選出形態(tài)正常的胚胎，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)微滴中，用于1-細(xì)胞鼠胚檢測試驗(yàn)。體外培養(yǎng)：采用微滴法培養(yǎng)，將鼠胚隨機(jī)分為樣品組、陰性對照組和陽性對照組，每組不少于50枚。陰性對照組胚胎在培養(yǎng)液滴中清洗2～3次后，直接轉(zhuǎn)移到提前平衡好的微滴中培養(yǎng)。陽性對照組胚胎在培養(yǎng)液滴中清洗2～3次后，轉(zhuǎn)移到提前平衡好的陽性對照液滴中（含0.005% Triton X-100的KSOM）。樣品組胚胎在樣品液滴中清洗2～3次后，轉(zhuǎn)移到提前預(yù)熱至37 ℃的樣品液滴接觸20 min，接觸后的胚胎在培養(yǎng)液滴中清洗2～3次，轉(zhuǎn)移到提前平衡好的培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：每組鼠胚采集自3～5只小鼠，每個(gè)微滴中培養(yǎng)胚胎數(shù)不超過20枚。在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，檢查囊胚發(fā)育情況并計(jì)算囊胚形成率。囊胚形成率=囊胚數(shù)/（1-細(xì)胞胚胎數(shù)）×100%?？山邮軠?zhǔn)則：陰性對照組囊胚形成率應(yīng)≥80%；陽性對照組囊胚形成率應(yīng)低于陰性對照組[11]。

1.5.2 囊胚染色和計(jì)數(shù) 囊胚收集：收集體外鼠胚試驗(yàn)中樣品組和陰性對照組所有發(fā)育良好的囊胚備用。囊胚染色：于室溫下，用PBS對囊胚進(jìn)行3次漂洗，10 min/次，漂洗完將囊胚放入2%的PFA中固定30 min；室溫下將囊胚轉(zhuǎn)移至透膜液中30 min，用PBS對囊胚進(jìn)行3次漂洗，10 min/次；將囊胚置于30%的山羊血清中3 h，以封閉非特異性的抗體結(jié)合位點(diǎn)；PBS漂洗囊胚1次；4 ℃下與一抗結(jié)合12 h；PBS漂洗囊胚3次，10 min/次；室溫、避光條件下與二抗結(jié)合1 h；PBS漂洗囊胚3次，10 min/次；將胚胎移至PI染色液中，置于室溫避光條件下30 min；用PBS在玻片上做一個(gè)含囊胚的小液滴，在蓋玻片4個(gè)角分別滴一小滴甘油滴，用蓋玻片輕輕覆蓋囊胚樣品，輕壓蓋玻片使囊胚細(xì)胞延展平鋪；置于室溫避光條件下20 min；在熒光顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。囊胚細(xì)胞染色和計(jì)數(shù)為熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)囊胚細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)?？偧?xì)胞數(shù)≥50個(gè)，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)≥12個(gè)為良好囊胚數(shù)[12]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外鼠胚試驗(yàn)結(jié)果 陰性對照組囊胚形成率97.00%，陽性對照組囊胚形成率為0，試驗(yàn)條件成立，樣品組的囊胚形成率為99.05%，見表1。

表1 各組體外鼠胚試驗(yàn)結(jié)果（n，%）

2.2 囊胚染色和計(jì)數(shù)結(jié)果 每組計(jì)數(shù)32個(gè)囊胚，陰性對照組良好囊胚數(shù)占比為96.88%（31/32），樣品組良好囊胚數(shù)占比為93.75%（30/32），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.350，P＞0.05），見表2、表3。

表2 陰性對照組囊胚細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞總數(shù)（n）

表3 樣品組囊胚細(xì)胞總數(shù)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞總數(shù)（n）

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)起源于20世紀(jì)70年代，是目前公認(rèn)治療不孕癥的最有效方法[13]。近年來，在社會需求的刺激下，人類輔助生殖技術(shù)和產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展并不斷完善，輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械產(chǎn)品也愈加豐富[14，15]。而這類醫(yī)療器械的安全性和有效性直接影響著患者以及子代的安全與健康，因此要對其質(zhì)量和安全性給予高度重視并嚴(yán)格監(jiān)管，其中的生物相容性評價(jià)也是監(jiān)管重點(diǎn)，主要的評價(jià)項(xiàng)目除了要包含GB/T 16886系列中涉及的如致敏、急性全身毒性等常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目之外，對于可能接觸配子和/或胚胎的產(chǎn)品，需要進(jìn)行體外鼠胚試驗(yàn)，體外鼠胚試驗(yàn)分為1-細(xì)胞和2-細(xì)胞兩種方法，由于1-細(xì)胞胚胎方法更為敏感，因此標(biāo)準(zhǔn)推薦使用1-細(xì)胞胚胎法[16，17]。鼠胚試驗(yàn)結(jié)果是觀察囊胚發(fā)育情況并計(jì)算囊胚形成率，但是僅憑這兩點(diǎn)無法完整地說明囊胚質(zhì)量的優(yōu)劣。因此，可兼用囊胚染色和計(jì)數(shù)法，通過對囊胚細(xì)胞染色和計(jì)數(shù)良好囊胚數(shù)對發(fā)育期的胚胎進(jìn)行分析[18]。

本研究結(jié)果顯示，陰性對照組囊胚形成率97.00%，陽性對照組囊胚形成率為0，試驗(yàn)條件成立，樣品組的囊胚形成率為99.05%；陰性對照組良好囊胚數(shù)占比為96.88%（31/32），樣品組良好囊胚數(shù)占比為93.75%（30/32），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見，我國輔助生殖技術(shù)用醫(yī)療器械和國內(nèi)產(chǎn)業(yè)已初具雛形，標(biāo)準(zhǔn)化工作和監(jiān)督技術(shù)也日益完善，這些都將成為輔助生殖用醫(yī)療器械后續(xù)發(fā)展的重要?jiǎng)恿捅Ｕ?，也為該類產(chǎn)品檢測及監(jiān)管提供技術(shù)參考。

綜上所述，該種洗精液體外鼠胚試驗(yàn)?zāi)遗咝纬陕始澳遗呒?xì)胞染色和計(jì)數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，可進(jìn)一步用于臨床研究。