鄭麗萍,鄭彩燕

(1.福建省兒童醫(yī)院藥劑科,福建 福州 350014;2.福建省立醫(yī)院藥劑科,福建 福州 350013)

在過去的幾十年里，癌癥的治療方法取得了很大的進(jìn)步。然而，據(jù)報(bào)道單就美國(guó)2022年將有191萬余例各類癌癥新發(fā)病例和60.9萬余例死亡病例[1]。其中，皮膚黑色素瘤將導(dǎo)致99 780例新發(fā)病例和7 650例死亡病例。盡管在癌癥治療方面取得了很大進(jìn)展，但是由于轉(zhuǎn)移灶通常對(duì)手術(shù)治療、放化療以及其他治療方式具有抗性，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移成為實(shí)體惡性腫瘤患者死亡的首要原因[2]。就黑色素瘤而言，它可以從局部皮膚疾病迅速發(fā)展為區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及更嚴(yán)重的內(nèi)臟轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道，如果黑色素瘤患者在腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移之前就被診斷出來，這些病例的5年生存率可達(dá)99%。然而，與之形成鮮明對(duì)比的是，一旦發(fā)生了轉(zhuǎn)移，這些患者的5年生存率急劇下降到只有12%～15%[3]。血源性轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要方式，主要包括腫瘤在原發(fā)部位生長(zhǎng)、血管化、侵入血管、循環(huán)、附著于毛細(xì)血管床、外滲和遠(yuǎn)端生長(zhǎng)等復(fù)雜的連續(xù)步驟組成的轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)[4]。

雖然腫瘤的轉(zhuǎn)移是可怕的，但從另一方面來看，腫瘤轉(zhuǎn)移的效率也是很低的。具體來說，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，數(shù)以百萬計(jì)的腫瘤細(xì)胞逃離原發(fā)腫瘤進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，但由此形成的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量遠(yuǎn)少于彌散的腫瘤細(xì)胞[5]。不僅如此，研究顯示腫瘤患者外周血中能夠檢測(cè)的循環(huán)腫瘤細(xì)胞極其罕見[6]。也有證據(jù)表明，腫瘤的生長(zhǎng)、繁殖和轉(zhuǎn)移僅依賴于腫瘤實(shí)體中的一小部分細(xì)胞。這一概念最初是基于這一現(xiàn)象得出的，即在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中測(cè)定多種類型的腫瘤細(xì)胞的增殖潛力時(shí)，只有少數(shù)細(xì)胞顯示出突出的增殖能力[7]。也有研究把上述的細(xì)胞子集認(rèn)定為腫瘤干細(xì)胞[8]。

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)是一種可靠的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，近年來引起了人們的極大關(guān)注。在癌癥研究中，iTRAQ是一種廣泛應(yīng)用的技術(shù)，常用于篩選疾病進(jìn)展和化療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。通過運(yùn)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，Liu等人發(fā)現(xiàn)了一組新的胰腺癌生物標(biāo)志物，包括載脂蛋白E (APOE)、α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H3(ITIH3)、載脂蛋白A1(APOA1)、載脂蛋白L1(APOL1)。這與單獨(dú)使用CA19-9作為標(biāo)志物相比，顯著提高了胰腺癌診斷的敏感性和特異性[9]。Zhao等人通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇敏感的PC3細(xì)胞和多西紫杉醇耐藥的PC3-Rx細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組學(xué)間也存在差異，并在臨床患者中驗(yàn)證了這種顯著變化[10]。

本研究利用腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，在親本鼠源黑色素瘤細(xì)胞株(B16F10)的基礎(chǔ)上，建立了肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞株(B16F10M)，并利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與親本黑色素瘤細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生了代謝重組。具體來說，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解水平發(fā)生了下調(diào)。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1 材料與方法

1.1試劑和耗材：Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(萬類生物)、RT-qPCR引物(生工生物科技)、三氟乙酸、碘乙酰胺和二硫蘇糖醇(Sigma Aldrich)、iTRAQ試劑盒(AB Sciex)、測(cè)序級(jí)改良胰蛋白酶(Promega)。

1.2細(xì)胞：鼠源B16F10黑色素瘤細(xì)胞株和人黑色素瘤細(xì)胞株A375購自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。將eGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，獲得帶綠色熒光標(biāo)記的B16F10-GFP細(xì)胞。分別從C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤中分離出其子代B16F10M-GFP和A375M細(xì)胞株。主要過程包括：將親代細(xì)胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，1個(gè)月后剝離肺轉(zhuǎn)移灶。使用胰蛋白酶(0.1%)和膠原酶Ⅰ(0.1%)混合酶解組織片段。最后，細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。B16F10、B16F10M、A375和A375M黑色素瘤細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% (v/v)胎牛血清(Gembio)、1%青霉素/鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone)中，培養(yǎng)箱濕度控制為37℃，CO2濃度控制為5%。

1.3ATP含量檢測(cè):本研究采用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定ATP含量。簡(jiǎn)單來說，在細(xì)胞懸液中加入100 μl ATP檢測(cè)試劑，充分混勻3 min，隨后轉(zhuǎn)移到96孔板上，黑暗中靜置10 min。最后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度(熒光/細(xì)胞數(shù))來定量ATP含量。

1.4iTRAQ:本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)研究B16F10細(xì)胞和B16F10M細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異，蛋白提取、質(zhì)譜、蛋白解析、數(shù)據(jù)分析外送杭州景杰科技生物有限公司開展。

1.5生物信息學(xué)分析:本研究分別檢測(cè)3個(gè)B16F10和B16F10M細(xì)胞樣本，對(duì)3個(gè)重復(fù)樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)的平均值進(jìn)行進(jìn)一步分析。如果B16F10M與B16F10的絕對(duì)平均比率>1.5或<0.67，且P<0.05，則將該蛋白視為差異表達(dá)蛋白。 利用UniProt-GOA數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)蛋白質(zhì)注釋、功能分類、功能富集和聚類分析進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用在線STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件生成蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，富集PPI子網(wǎng)絡(luò)。

1.6RT-qPCR:使用TRIzol試劑盒提取RNA，將收集到的RNA用15～20 μl DEPC水溶解后，使用Q5000超微量紫外可見分光光度儀測(cè)定其濃度和純度。使用PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后使用紫外可見分光光度儀測(cè)定cDNA濃度。使用SYBR?Premix Ex TaqTM PCR Kit試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，使用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證擴(kuò)增的產(chǎn)物是否與理論的擴(kuò)增產(chǎn)物一致。最后，通過2-ΔΔCt法計(jì)算各基因相對(duì)于內(nèi)參基因(ACTB)的表達(dá)量。

1.7凋亡檢測(cè):本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況。簡(jiǎn)要如下：將腫瘤細(xì)胞以3×105個(gè)/孔培養(yǎng)于6孔板中，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)數(shù)天，后置于氧氣濃度為1%的低氧工作站36 h，收集上清和細(xì)胞，離心、洗滌、重懸。使用5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI混合染色，4℃避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.8動(dòng)物實(shí)驗(yàn):動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照國(guó)家自然科學(xué)基金委關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物關(guān)愛使用的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行操作。對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行異常行為監(jiān)測(cè)，以減少動(dòng)物的疼痛和痛苦。如果發(fā)現(xiàn)動(dòng)物健康狀況嚴(yán)重惡化，則對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂死。

2 結(jié)果

2.1B16F10M的構(gòu)建:基于B16F10，成功構(gòu)建了B16F10M。見圖1。圖1中箭頭所示的黑色結(jié)節(jié)就是親代B16F10在小鼠肺部形成的轉(zhuǎn)移灶。通過體外細(xì)胞培養(yǎng)和熒光顯微拍照證實(shí)了圖示的黑色結(jié)節(jié)起源于親本B16F10細(xì)胞，而不是來自宿主小鼠。

圖1 B16F10M細(xì)胞株的構(gòu)建

2.2B16F10M糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)水平的下調(diào):通過運(yùn)用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對(duì)親本B16F10細(xì)胞和肺轉(zhuǎn)移B16F10M細(xì)胞純化的蛋白提取物進(jìn)行分析，揭示兩個(gè)細(xì)胞株蛋白表達(dá)譜的差異。通過對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的分析，共鑒定出了3 348個(gè)蛋白，并對(duì)其中的2 467個(gè)蛋白進(jìn)行了定量分析。 通過將兩株細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)水平差異高于1.5倍或者低于0.67倍的蛋白視為差異表達(dá)蛋白(B16F10M/B16F10，P<0.05)，發(fā)現(xiàn)相比于B16F10細(xì)胞，有 147個(gè)蛋白在B16F10M細(xì)胞中呈現(xiàn)出表達(dá)上調(diào)，175個(gè)蛋白呈現(xiàn)出表達(dá)下調(diào)。

將蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出的差異表達(dá)蛋白從生物過程、細(xì)胞成分、分子功能三個(gè)方面進(jìn)行聚類分析。見圖2。從分子功能層面，發(fā)現(xiàn)在上調(diào)表達(dá)的蛋白中，52%的蛋白為連接蛋白，25%的蛋白具有催化活性；在下調(diào)表達(dá)的蛋白中，這兩種蛋白的比率分別為48%和37%。

圖2 差異表達(dá)蛋白的GO分類分析

對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果見表1。共富集出24個(gè)通路(P<0.05)，主要包括補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血級(jí)聯(lián)、碳代謝、磷酸戊糖途徑和糖酵解/糖異生代謝通路等。

表1 差異表達(dá)蛋白的細(xì)胞信號(hào)通路分析

通過利用在線數(shù)據(jù)庫STRING和Cytoscape軟件，分析這些差異表達(dá)蛋白的蛋白-蛋白相互作用(PPI)。得到了與前面相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白中最顯著變化的5個(gè)信號(hào)通路是糖酵解/糖異生、抗生素的生物合成、碳代謝、氨基酸的生物合成和代謝通路。這兩種方法均表明糖酵解/糖異生代謝途徑在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了顯著的下調(diào)。對(duì)兩個(gè)細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)B16F10M細(xì)胞胞內(nèi)ATP產(chǎn)量低于B16F10細(xì)胞，驗(yàn)證了兩株細(xì)胞代謝上的差異。見圖3。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)涉及糖酵解/糖異生相關(guān)蛋白包括PKM、ALDOA、LDHB、TPI1、LDHA、人肝臟磷酸果糖激酶(PFKL)、PGAM1、肌肉磷酸果糖激酶(PFKM)、PGK1、GPI1和ENO1。見圖3。

圖3 B16F10M細(xì)胞糖酵解水平下調(diào)

2.3RT-qPCR驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果:通過前面對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，許多下調(diào)表達(dá)的蛋白參與了糖酵解/糖異生過程。為了驗(yàn)證這一結(jié)果，本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，除LDHA外，其他基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度的下調(diào)。因此，RT-qPCR結(jié)果與iTRAQ數(shù)據(jù)基本一致，從而驗(yàn)證了iTRAQ的結(jié)果。通過使用RT-qPCR對(duì)人源黑色素瘤細(xì)胞A375M與親本A375細(xì)胞ALDOA基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ALDOA在人源性黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞A375M中也呈下調(diào)表達(dá)。見圖4。這一結(jié)果在一定程度表明糖酵解信號(hào)通路下調(diào)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中是一個(gè)普遍現(xiàn)象。

圖4 RT-qPCR驗(yàn)證B16F10M細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平降低

2.4與親本B16F10細(xì)胞相比，B16F10M細(xì)胞缺氧耐受能力較弱:根據(jù)上述研究，糖酵解/糖異生相關(guān)蛋白在轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了B16F10細(xì)胞和B16F10M細(xì)胞的缺氧耐受性。經(jīng)過低氧環(huán)境培養(yǎng)，B16F10M細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比例高于B16F10細(xì)胞，其中B16F10M凋亡細(xì)胞比率為41.1%，B16F10凋亡細(xì)胞比率為27.3%。據(jù)此得出B16F10M細(xì)胞對(duì)缺氧的敏感性高于親本B16F10細(xì)胞。見圖5。

圖5 B16F10細(xì)胞具有比B16F10M細(xì)胞更強(qiáng)的低氧耐受能力

3 討論

癌癥患者死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移引起的并發(fā)癥。因此，針對(duì)轉(zhuǎn)移性疾病的有效治療將提高癌癥患者的死亡率。大量研究揭示了某些致癌基因參與癌變的過程，如致癌基因Ras的發(fā)現(xiàn)。但這些研究多集中在腫瘤發(fā)生方面，其研究對(duì)象通常為正常細(xì)胞和癌細(xì)胞。就目前而言，癌癥的發(fā)生是不可預(yù)測(cè)的，也就是說，不知道人體體內(nèi)正常的細(xì)胞會(huì)在何時(shí)何地發(fā)生癌變。相反，腫瘤在轉(zhuǎn)移之前可能潛伏數(shù)月至數(shù)年，因此預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移相對(duì)更容易實(shí)現(xiàn)[11]。更重要的是，腫瘤切除患者逐漸增多，這些患者每時(shí)每刻都面臨著腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。大量研究報(bào)道，大部分腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后被快速消除，其余存活的細(xì)胞就成了腫瘤轉(zhuǎn)移的根源?？紤]到腫瘤的異質(zhì)性和腫瘤轉(zhuǎn)移不是由癌細(xì)胞擴(kuò)散引起的偶然事件的觀點(diǎn)，本研究假設(shè)轉(zhuǎn)移過程中存活的細(xì)胞在某些特質(zhì)上一定不同于死亡的細(xì)胞。因此，本研究以小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞株為基礎(chǔ)，通過腫瘤轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型構(gòu)建了肺轉(zhuǎn)移B16F10M細(xì)胞株。在之前的研究中，B16F10M細(xì)胞展現(xiàn)出比親本B16F10細(xì)胞更高的轉(zhuǎn)移能力[12]。因此，找出潛在的機(jī)制顯得尤為重要。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為癌癥研究的有力工具，為研發(fā)靶向藥物提供了一個(gè)獨(dú)特的途徑來發(fā)掘關(guān)鍵的生物標(biāo)志物。本研究運(yùn)用一種廣泛使用的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)iTRAQ，來檢測(cè)和定量B16F10細(xì)胞與存活的B16F10M細(xì)胞之間的蛋白表達(dá)差異。定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出322個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)表達(dá)蛋白147個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白175個(gè)。通過GO分析和KEGG通路分析，確定了這些差異表達(dá)蛋白潛在的功能分類：共涉及24條信號(hào)通路，包括補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、碳代謝、戊糖磷酸途徑、糖酵解/糖異生代謝途徑等。本文還利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscapae軟件分析了這些差異表達(dá)蛋白中的PPI。值得關(guān)注的是，這兩種方法都揭示了糖酵解/糖異生代謝途徑是在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生了顯著下調(diào)。后續(xù)的RT-qPCR結(jié)果支持了這一結(jié)論。

根據(jù)“瓦伯格效應(yīng)”理論，癌細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下，也傾向于依賴糖酵解代謝進(jìn)行能量供給，而不是高效的線粒體氧化磷酸化[13]。不僅如此，糖酵解似乎有利于癌癥的轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道，小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制高轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的糖酵解顯著降低其轉(zhuǎn)移能力[14]。也有研究顯示，敲除LDHA可下調(diào)TGF-β2和MMP-2的表達(dá)，減弱腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移[15]。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解水平較低。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是由于不同腫瘤類型間的異質(zhì)性造成的。在缺氧耐受實(shí)驗(yàn)中，B16F10M細(xì)胞比親本B16F10細(xì)胞對(duì)缺氧更敏感。由此得出B16F10M細(xì)胞比B16F10細(xì)胞更依賴線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)，而非糖酵解。根據(jù)以往的研究，腫瘤干細(xì)胞更依賴于線粒體氧化磷酸化而非糖酵解來進(jìn)行能量供給[16]。綜上所述，腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化可以在一定程度上解釋腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生的代謝重編程，或者說代謝重編程可能是腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的動(dòng)力，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。