翁雪婷，陳 瑩，林 雙，廖溫靖，黃 婕，蔡藝煌

(1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023；2.口腔生物材料福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023)

MicroRNAs(miRNA)是長度約為22個堿基的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，可以通過靶向作用抑制或者降解靶mRNA的翻譯水平來調(diào)節(jié)特定靶基因的表達(dá)[1]。人類miR-92a(hsa-miR-92a)的編碼基因位于13號染色體的長臂上，屬于miR-25基因家族。越來越多的研究表明，has-miR-92a-3p參與到多種癌癥及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，如前列腺癌[2]、乳腺癌[3]、肺部內(nèi)皮細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)[4]以及肺纖維化[5]、過度肥胖[6]、凝血功能障礙[7]等。hsa-miR-92a-3p 參與了多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展過程，對hsa-miR-92a-3p 進(jìn)行靶基因相關(guān)生物信息學(xué)分析，為今后進(jìn)一步深入探索 hsa-miR-92a-3p 功能和作用具有十分重要的指導(dǎo)意義。本研究通過對miR-92a-3p的生物信息學(xué)預(yù)測分析，篩選出192個hsa-miR-92a-3p的靶基因，并通過構(gòu)建靶基因集合編碼蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，獲取關(guān)鍵節(jié)點靶基因，為進(jìn)一步深入探究hsa-miR-92a-3p相關(guān)分子功能及作為臨床診斷和檢測靶標(biāo)提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

利用miRBase(http：//www.mirbase.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、UCSC (http：//genome.ucsc.edu/)等在線數(shù)據(jù)庫查找miR-92a-3p的染色體定位、堿基序列、物種保守性等基礎(chǔ)信息。然后使用miRGator(http：//mirgator.kobic.re.kr/)查看miR-92a-3p在不同疾病中的表達(dá)豐富度。再通過miRDB(http：//mirdb.org/)、TargetScan(http：//www.targetscan.org/)、Clip-seq(http：//mirtarclip.mbc.nctu.edu.tw/)和miRWalk(http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)四種在線軟件預(yù)測miR-92a-3p的靶基因。利用venny2.0在線軟件取交集，最終確定miR-92a-3p的靶基因集合范圍。利用在線數(shù)據(jù)庫string11.5(http：//string-db.org/)查詢獲得所預(yù)測靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape_3.9.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖的制作。

將前期韋恩圖集合交集得到的靶基因及其分析數(shù)據(jù)整理格式后導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫DAVID[DAVID：Functional Annotation Result Summary (ncifcrf.gov)]對靶基因數(shù)據(jù)進(jìn)行功能富集GO分析，得到的功能注釋相對于背景具有統(tǒng)計意義(P<0.05)。再使用KOBAS3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對4個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶基因交集(共192個基因)進(jìn)行KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析，以P<0.01作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1miR-92a-3p 定位及序列保守性分析：通過在線檢索miRBase、UCSC數(shù)據(jù)庫，確定hsa-miR-92a-3p基因序列號為MIMAT0000092，位于13q31.3的染色體區(qū)域內(nèi)(見圖1)，基因位點在 chr13：91 351 314～91 351 391。通過miRBase在線數(shù)據(jù)庫檢索miR-92a-3p的成熟序列，結(jié)果顯示，在33 個不同物種中存在高度保守的成熟序列。在對不同物種的miR-92a-3p序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn) miR-92a-3p 的成熟序列“UAUUGCACUUGUCCCGGCCU”在人、獼猴、小鼠、山羊、眼鏡王蛇、綠海膽等多物種之間具有高度的保守性(見表1)。

圖1 miR-92a-3p 在人類基因組中所處的位置

表1 不同物種miR-922-3p成熟序列

2.2hsa-miR-92a-3p在人類各組織的表達(dá)分析：利用miRGator 3.0在線數(shù)據(jù)庫查找miR-92a-3p在不同人體疾病中的表達(dá)情況，其中在乳腺頂漿分泌癌、乳腺癌、乳腺導(dǎo)管原位癌、乳腺化生、淋巴瘤、鼻咽腫瘤、牛皮癬、黑色素瘤中表達(dá)豐富(見圖2)。

圖2 miR-92a-3p 在人類基因組中所處的位置

2.3miR-92a-3p 的靶基因預(yù)測：通過TargetScan、miRDB、Clip -Seq、miRWalk 4種公共數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測出了1 041、985、2 019、50 420個靶向調(diào)控基因，利用venny2.0取交集后最終確定192個預(yù)測交集靶基因，占各軟件預(yù)測到的靶基因總數(shù)的 1.3%(見圖3)。

圖3 miR-92a-3p的預(yù)測靶基因

2.4靶基因編碼蛋白質(zhì)間的互相作用預(yù)測：將4個數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的靶基因取交集后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到String11.5公共數(shù)據(jù)庫在線分析靶基因編碼蛋白質(zhì)間的相互關(guān)系，然后再把String11.5分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape_v3.9.0軟件繪制PPI圖，結(jié)果顯示，miR-92a-3p的靶基因編碼蛋白質(zhì)之間具有復(fù)雜的蛋白質(zhì)互作關(guān)系，尤其是靶基因PTEN、ITPR1、MAPK8、FBXW7、KAT2B、SMAD7的編碼蛋白質(zhì)在Cytoscape_v3.9.0中利用算法分析相關(guān)度高且在整個網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵節(jié)點位置(見圖4)。

圖4 miR-92a-3p 預(yù)測靶基因所編碼蛋白質(zhì)間的相互作用分析

2.5miR-92a-3p靶基因KEGG分析：對4個數(shù)據(jù)庫都預(yù)測到的192個靶基因進(jìn)行KEGG信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集性分析，發(fā)現(xiàn)miR-92a-3p的靶基因顯著富集在PI3K-Akt signaling path way、FoxO signaling pathway、Cellular senescence等信號通路中(P<0.01，見表2)。

表2 miR-92a-3p預(yù)測靶基因的KEGG分析結(jié)果

2.6miR-92a-3p靶基因GO分析：對4個在線數(shù)據(jù)庫所預(yù)測到的192個靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)miR-92a-3p的靶基因顯著富集在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等10個細(xì)胞組件(P<0.05)，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)的合成等生物過程(P<0.05)(見圖5)。

圖5 miR-92a-3p 預(yù)測靶基因的GO功能注釋結(jié)果

3 討論

本研究通過對不同物種的has-miR-92a-3p的序列對比發(fā)現(xiàn)，序列 UAUUGCACUUGUCCCGGCCU 在16個物種中保持高度保守性，說明has-miR-92a-3p在進(jìn)化過程中具備穩(wěn)定性，保守性[8]，以此提示has-miR-92a-3p可能在參與機(jī)體正常生理和病理的生物學(xué)功能過程中發(fā)揮重要的作用。

本研究推測PTEN、MAPK8、KAT2B、ITPR1為此蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點蛋白質(zhì)，因此我們推測這4個中心節(jié)點基因可能在has-miR-92a-3p調(diào)控的生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。進(jìn)一步對這些中心節(jié)點基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析，發(fā)現(xiàn)中心節(jié)點基因所參與的分子生物功能過程包括轉(zhuǎn)移酶的合成、細(xì)胞周期、生物節(jié)律、配體結(jié)合、細(xì)胞凋亡、核苷酸合成過程等。大量研究發(fā)現(xiàn)has-miR-92a-3p在多種腫瘤中異常表達(dá)，表明其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的重要的作用。has-miR-92a-3p在乳腺癌[9]、胃癌[10]和食道癌[11]中表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究表明，has-miR-92a-3p在前列腺癌中被IncRNA FER1L4結(jié)合，從而上調(diào)FBXW7，抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和存活[12]。has-miR-92a-3p還被證實可通過作用PTEN而調(diào)節(jié)其下游PTEN/AKT通道來促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)has-miR-92a-3p能夠通過PI3K-Akt信號通路影響腫瘤發(fā)生發(fā)展。楊檳伊研究[14]表明has-miR-92a-3p可以通過將PTEN作為靶目標(biāo)調(diào)節(jié)其表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控PI3K-Akt信號通路來促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等的惡性發(fā)展；劉宇等對比正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，has-miR-92a-3p通過靶向抑制PTEN的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]；Hang等人揭示has-miR-92a-3p可以靶向調(diào)控CDH1和Notch-1影響β-catenin和Akt信號通路，進(jìn)而在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，并通過體外下調(diào)has-miR-92a-3p證實其下調(diào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性腫瘤[16]。特別是Yang等通過對高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞進(jìn)行外泌體測序，確定has-miR-92a-3p是肝癌進(jìn)展的潛在標(biāo)志物，并發(fā)現(xiàn)has-miR-92a-3p能夠抑制PTEN激活A(yù)kt/Snail信號通路，促進(jìn)受體癌細(xì)胞EMT和肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移[13]。揭示has-miR-92a-3p可以作為惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中潛在的生物標(biāo)志物，未來有望應(yīng)用于臨床早期診斷和預(yù)后判斷。

綜上所述，本研究采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫方法獲取了hsa-miR-92a-3p在部分疾病中通過靶基因調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)功能、基本序列信息、靶向調(diào)控基因、靶基因編碼蛋白質(zhì)的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖、GO 分析和 KEGG 信號通路分析等的結(jié)果，為探究hsa-miR-92a-3p在腫瘤中潛在的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，然而本文章預(yù)測結(jié)果也有待實驗的研究來進(jìn)一步證實。