李穎 鞠斯羽 魏健

(長春師范大學，吉林 長春 130051)

大豆是世界上最主要的油料作物之一，同時也是主要的食品和飼料中的蛋白質(zhì)原料。大豆種子中，不但富含一定量的人體必需氨基酸，還具有豐富的膳食礦物質(zhì)、維生素、不飽和脂肪酸和異黃酮等對人類身體發(fā)育有利的物質(zhì)。世界上栽培規(guī)模最大的轉(zhuǎn)基因作物就是轉(zhuǎn)基因大豆，在當時也是第一批進入商業(yè)栽培市場的轉(zhuǎn)基因作物之一?？茖W研究已經(jīng)證明，有著巨大使用價值的轉(zhuǎn)基因作物新品種必須在成百上千乃至幾萬次的轉(zhuǎn)化事件中選出[1]。

雖然大豆基因組序列已經(jīng)被公布[2]，但大多數(shù)大豆基因的功能尚不清楚。所以，一個最有效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方式就是研究大豆基因功能、通過分子育種培育大豆新品種的重要前提。大約85%的轉(zhuǎn)基因植物都是利用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化途徑而成功得到的。農(nóng)桿菌是一類革蘭氏陰性菌，包含了根癌農(nóng)球菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，兩者各自包含了功能構(gòu)造相同的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA。當植被受傷時，農(nóng)桿菌可以通過侵染植被傷口進入細胞，通過將其T-DNA嵌入在植株基因組中，使得其所攜帶的基因可以直接在植株上表現(xiàn)。而受損植株根系中可以產(chǎn)生羥乙酰丁香酸和乙酰丁香酸，作為標志物質(zhì)可以引導Ti質(zhì)粒的VIR基因和根瘤菌染色體操縱子的表現(xiàn)。Vir基因產(chǎn)物可以使Ti質(zhì)粒上的t-DNA序列融合在宿主細菌的基因組上，從而能夠通過減數(shù)分裂安全的遺傳到下一代。農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法有很多優(yōu)點，如操作簡單、重現(xiàn)性高、實驗成本低等，因此是植物轉(zhuǎn)化的最佳選擇之一。然而，農(nóng)桿菌介導法仍然存在諸多問題：其轉(zhuǎn)化效率低、受多種因素影響等，這些問題限制了遺傳轉(zhuǎn)化效率。本文總結(jié)了影響大豆遺傳轉(zhuǎn)化的各種因素，為大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的調(diào)整及有關(guān)科學研究提供依據(jù)。

1 農(nóng)桿菌侵染液濃度對大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌侵染液的濃度也是影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效果的最主要因素之一，因此探究其在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中的影響十分關(guān)鍵。如果農(nóng)桿菌侵染液含量過低，就會有很少的農(nóng)桿菌細胞和外植體接觸，而無法進行有效的轉(zhuǎn)化;當農(nóng)桿菌侵染液含量過高，農(nóng)桿菌細胞內(nèi)部就會產(chǎn)生相互拮抗使其無法生長轉(zhuǎn)化。皮照興[3]等設(shè)置了5組不同濃度的農(nóng)桿菌侵染液，OD600依次是0.2、0.4、0.6、0.8、1.0。其中，當農(nóng)桿菌侵染液濃度OD600在0.6～0.8，抗性芽再生率最高且差異不大。孫昕[4]等利用不同濃度農(nóng)桿菌菌液(選擇OD600分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9)對“吉育47”大豆進行侵染，進行共培養(yǎng)時長為5d，5d后再進行GUS染色，研究發(fā)現(xiàn)，當農(nóng)桿菌侵染液OD600為0.7、0.8、0.9時，子葉節(jié)區(qū)分生組織的GUS加染色點數(shù)量較多;再進一步研究GUS熒光值的數(shù)據(jù)，分析表明，當OD600為0.8時GUS表達量最大，其次是0.7和0.9，所以選擇農(nóng)桿菌菌液OD600為0.7～0.8范圍內(nèi)侵染“吉育47”大豆其轉(zhuǎn)化效率最好，這也為本文選擇農(nóng)桿菌侵染液濃度提供了參考。叢亞輝[5]等研究發(fā)現(xiàn)，OD650值分別為0.6、0.8和1.0等3個菌液濃度侵染大豆品種“杰克紫”子葉節(jié)時，GUS瞬時表達率依次是97.0%、90.7%和85.6%，其中，OD650為0.6時對大豆子葉節(jié)的侵染能力顯著優(yōu)于0.8和1.0，而“天隆一號”的試驗結(jié)果也與“杰克紫”相同。所以農(nóng)桿菌侵染濃度水平OD650為0.6時比較適用于大豆子葉節(jié)培養(yǎng)。李姝璇[6]等通過研究影響農(nóng)桿菌侵染效率的主要因素并以大豆子葉外植體中GUS的瞬時表達率來評價農(nóng)桿菌的侵染效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當農(nóng)桿菌侵染液濃度OD650為0.6時，為侵染大豆子葉節(jié)的最適濃度，侵染效率可達到96%以上。在8個大豆品種中，“天龍1號”、“杰克紫”等大豆品種的農(nóng)桿菌感染效率相對較高。在大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌的侵染濃度影響較大，近年來在大豆遺傳轉(zhuǎn)化實驗中一般選擇OD600為0.6～1.0為最佳侵染濃度。

2 大豆基因型對大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響

農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中最常用的方法。篩選有利于農(nóng)桿菌感染和組織再生的大豆基因型是建立高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的重要步驟。由于進口轉(zhuǎn)基因大豆質(zhì)量高、價格低，中國大豆產(chǎn)量在過去10a中大幅下降。目前，“威廉姆斯82”和“杰克”大豆品種是國際上常用的大豆轉(zhuǎn)化育種和研究品種。然而，這2個基因型的農(nóng)藝性狀較差，只適合在狹窄的地區(qū)種植[7]。因此，為了加快我國轉(zhuǎn)基因大豆育種的進程，研究人員分別選擇不同基因型大豆進行探究。2016年，劉晨光[8]等選取了“豫豆22”、“冀豆16”、“中黃42”3個大豆品種來探究不同基因型對子葉節(jié)再生效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同樣的條件下，“豫豆22”芽誘導率和再生率較高，分別是41%和15.3%；“冀豆16”次之，“中黃42”最差。由此可知“豫豆22”適用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化中。同年楊靜小組[9]選擇了2種國外大豆，9種國內(nèi)大豆進行研究，在轉(zhuǎn)化過程中篩選出“杰克”、“華春6號”、“沈農(nóng)9號”具有較高的再生率，其中“沈農(nóng)9號”再生率和轉(zhuǎn)化率均為相對較高水平，因此適用于大豆遺傳轉(zhuǎn)化中從而獲得更多植株進行研究。2021年，Mi-Suk Seo等[10]報告了21個屬于韓國大豆核心種質(zhì)的大豆品種和2個國外品種(“杰克”和“Maverick”)的組織培養(yǎng)效率。在21個品種中，“關(guān)安”、“安平”和“色南”有著密切的親緣關(guān)系，這3個品種的發(fā)芽率和再生率都很高。此外，在參考基因組測序中使用的“威廉82”和2個外國品種中也觀察到了較高的組織培養(yǎng)能力。不同品種的大豆對農(nóng)桿菌的易感程度呈現(xiàn)出顯著的差異，不同基因型的大豆與農(nóng)桿菌間的相互作用不同，因此在大豆遺傳轉(zhuǎn)化中選擇再生率較高的大豆品種十分必要。

3 篩選劑種類及濃度對大豆遺傳轉(zhuǎn)化的影響

3.1 篩選劑種類

在大豆基因改造領(lǐng)域，篩選標記物是篩選利用轉(zhuǎn)基因材料生長和轉(zhuǎn)化細胞，生存、增殖與成熟的重要因子。各種種類的篩選劑不但影響了轉(zhuǎn)化效果，同時也限制了轉(zhuǎn)基因材料的實用價值。目前有許多篩選劑，包括了抗生素類如潮霉素、卡那霉素，以及除草劑類如草甘膦、草胺膦等。

在多種植株的基因轉(zhuǎn)化中，卡那霉素也常被用來作為抗性檢測標記的主要抗生素之一。卡那霉素也是氨基胰腺外分泌細菌的主要抗生素，其中毒原理為與植株細胞器葉綠體和線粒體內(nèi)的核糖體30S亞基緊密結(jié)合，進而抑制由轉(zhuǎn)錄進程所引起的細胞凋亡;而轉(zhuǎn)化細菌則具有了對抗生素的耐受性，從而在某一確定濃度的高選擇性抗生素的選擇培養(yǎng)基中生存了下來;而未轉(zhuǎn)換的細菌則因為沒有該抗性基因，而被抑制或殺滅[11]。

第一批轉(zhuǎn)基因大豆是Hinchee等在1988年使用nptII基因生產(chǎn)的，該基因?qū)⒖敲顾刈鳛橐环N篩選劑。大豆品種對卡那霉素的反應在愈合率方面比較相似，但在褐變率方面不同。王萍[12]等研究發(fā)現(xiàn)，不同大豆外植體對卡那霉素的反應存在顯著差異，以真葉片的反應最敏感，下胚軸的反應最慢。雖然卡那霉素成本低、適用范圍廣，但不同基因型大豆的耐受性差異較大。

潮霉素抗性基因hpt是目前應用較多的標記基因之一，已經(jīng)在許多植物的基因功能研究中獲得了應用。潮霉素還能阻礙植株細胞葉綠體、線粒體內(nèi)的核糖體和增長作用因子EF-2的融合，進而抑制多肽鏈的正常生長。當潮霉素在未轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)時，就可與細胞中的30S核糖體融合，因而使細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成困難，進而造成蛋白質(zhì)的逐漸褐化死亡[13]，作用機理與卡那霉素相似。

草甘膦和草胺膦都是一種有機磷類的除草劑，具有生物活性高、效率高、毒性較小、殺草譜高、易于降解、少殘留，以及對環(huán)境相對比較安全等優(yōu)點。其可以殺滅幾乎全部的綠色植物，而且對動物無害，所以是一種既安全又有效的除草劑，是農(nóng)作物中使用較為普遍的一種除草劑[14]。宋張悅[15]等以草丁膦作為篩選試劑得到了“天隆一號”等6個較適宜的大豆受體品種，且平均轉(zhuǎn)化效率都穩(wěn)定在2.4%以上。

3.2 篩選劑濃度

選擇合適的篩選劑濃度也是大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因素，因為篩選過程過嚴或過松均會降低對轉(zhuǎn)化植株的篩選效率。

劉京等[16]研究了不同質(zhì)量濃度的潮霉素對發(fā)狀根生長誘導和根系伸長的影響。結(jié)果顯示，潮霉素可有效抑制非轉(zhuǎn)化細胞的生長發(fā)育，并可用作大豆發(fā)狀根轉(zhuǎn)化體系中的篩選試劑。同卡那霉素一樣，不同種類的大豆對潮霉素耐受性有所差異。所得結(jié)果表明，“自貢冬豆”、“吉林小粒1號”、“吉育47”和“中黃30”在發(fā)狀根誘導階段的潮霉素適宜的篩選濃度依次是40mg·L-1、16mg·L-1、16mg·L-1、24mg·L-1;根伸長階段則依次為49mg·L-1、46mg·L-1、33mg·L-1、55mg·L-1。宋張悅[15]等又成功構(gòu)建了由一種農(nóng)桿菌介導的以草甘膦作為的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的直接篩選試劑，轉(zhuǎn)化效率0.41%～3.06%。研究人員經(jīng)濃度梯度實驗結(jié)果顯示，當草甘膦的篩選濃度為100mg·L-1時，再生率降低了2～3倍，但是轉(zhuǎn)化效率并不受限制?？梢娫诟邼舛群Y選過程中，抗性外植體顯示出了明顯的生長優(yōu)勢，而且高濃度篩選還可以省去不少工作量，對降低假陽性率和增加轉(zhuǎn)基因植株的抗性等方面，都會有一些效果。

張忻爽等[17]用“合豐35”、“黑農(nóng)44”和“吉林35”的胚尖當外植體，研究了不同濃度的卡那霉素和草銨膦對各種基因型大豆胚尖不定芽所誘導的作用效果。結(jié)果表明，“合豐35”、“黑農(nóng)44”和“吉林35”的適宜卡那霉素的篩選濃度是100mg·L-1，而草胺膦濃度則依次是0.6mg·L-1、0.2mg·L-1和0.2mg·L-1。實驗結(jié)果說明，不同基因型大豆再生體系中對不同品種及濃度的篩選劑有所不同，因此，在今后針對某一基因型進行遺傳轉(zhuǎn)化實驗時，選用合適的篩選劑及其濃度是十分必要的，同時還應從對外植體不定芽的誘導率、芽數(shù)和芽長度等多種因子綜合考察后進行判斷。

在大豆遺傳轉(zhuǎn)化實驗中，如果篩選劑濃度太低，則無法抑制或殺死未轉(zhuǎn)化細胞，從而導致假陽性植株數(shù)量過多，進而干擾轉(zhuǎn)化植株的篩選和鑒定等工作;若篩選濃度太高，則會殺死已經(jīng)轉(zhuǎn)化細胞或抑制其增殖發(fā)育，從而難以獲得已轉(zhuǎn)化植株。所以，人們開展了受體材料篩選劑耐受性實驗，以研究設(shè)定合理的篩選臨界濃度，確保理想的篩選效果十分關(guān)鍵[18]。

4 展望

多年來，國內(nèi)外的科研人員開發(fā)和優(yōu)化了大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系，進一步證實并豐富了大豆的基因功能，并獲得了具有更多優(yōu)良性狀的新品種。由于中國農(nóng)作物主要功能基因組學的研究開發(fā)，以及國際轉(zhuǎn)基因大豆新品種培育研究工作的開展，安全高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展始終是中國轉(zhuǎn)基因大豆研發(fā)的重點課題之一。多年的研究已經(jīng)證實，大豆不定芽再生系統(tǒng)是大豆的遺傳轉(zhuǎn)化的主要途徑。由于大豆對光周期的敏感，品種推廣應用的適應范圍有限，今后應優(yōu)化大豆的加工方法和再生體系。所以，未來大豆基因改造技術(shù)將選擇產(chǎn)業(yè)上主栽品種為重點基因型，對其改造技術(shù)與再生系統(tǒng)加以完善;政府為滿足對轉(zhuǎn)基因大豆育種與功能基因研發(fā)的需求，也支持對其細胞再生系統(tǒng)的完善與改良。