張澤瑾，姚宏紀(jì)，薛兆毅，展羽桐，郭瑩潔，吳 蒙，藺可鑫，熊婧妍，張 勇

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，海南 ?？?571199；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571199）

傳統(tǒng)抗生素廣泛使用和濫用帶來的耐藥問題早已成為世界各國臨床治療面臨的難題，對人類健康產(chǎn)生巨大威脅。針對抗生素耐藥問題尤其革蘭氏陰性細(xì)菌，迫在眉睫［1］。銅綠假單胞菌是臨床上難治型革蘭氏陰性桿菌，對很多抗生素都天然耐藥，是臨床感染面臨的主要挑戰(zhàn)之一，與此同時(shí)，銅綠假單胞菌感染的治療還面臨著內(nèi)毒素大量釋放引起的炎癥因子風(fēng)暴［2］，進(jìn)而誘發(fā)多器官衰竭等問題，如膿毒癥［3］，為臨床治療增加難度。設(shè)計(jì)具有高效抗銅綠假單胞菌活性和減少內(nèi)毒素（LPS）產(chǎn)生的新型潛在雙功能藥物是治療類似銅綠假單胞菌的革蘭氏陰性細(xì)菌感染的有效途徑之一。

LBP（86～99）和BPI（86～99）為一類能夠結(jié)合LPS 的多肽，能夠與LPS 結(jié)合，阻斷LPS 的生理效應(yīng)，發(fā)揮LPS 中和作用，但其對革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌活性較弱［4］。Myxinidin 是一種主要抗革蘭氏陰性細(xì)菌的魚類抗菌肽，天然存在于盲鰻體表黏液中，無毒性，穩(wěn)定性好，對銅綠假單胞菌具有抗菌活性，但無LPS 中和作用［5］。本研究旨在嘗試采用四肽GGGS-linker 實(shí)現(xiàn)2 個(gè)不同功能多肽的雜合，以期設(shè)計(jì)出具有抗銅綠假單胞菌活性和中和其LPS作用的雙功能雜合抗菌肽，為包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌感染治療藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)提供新思路和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種 銅綠假單胞菌CMCC10104（P.aeruginosaCMCC10104），銅綠假單胞菌ATCC 9027（P.aeruginosaATCC 9027），由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑及儀器 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、瓊脂、氯化鈉、顯色基質(zhì)鱟試劑盒購等試劑購自于北京索萊寶科技有限公司；主要儀器包括：生物安全柜（海爾，HR900-IIA2），離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，多功能酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1雙功能雜合肽的設(shè)計(jì)和合成 LBP（86～99）和BPI（86～99）能與LPS 結(jié)合，但抗銅綠假單胞菌活性弱；Myxinidin 為魚類代表性抗菌肽，具有抗革蘭氏陰性細(xì)菌活性，不能夠結(jié)合LPS，不具有中和LPS 作用。本研究以四肽GGGS-linker 實(shí)現(xiàn)母體肽LBP、BPI 與Myxinidin 雜合，形成全新的雜合抗菌肽BLM 和LLM（表1）。采用固相合成法合成母體肽和雜合肽，純度＞99%。利用EMBOSS 和Ex-PASy 生物信息學(xué)軟件對其理化參數(shù)進(jìn)行分析。

1.2.2細(xì)菌培養(yǎng) 挑取P.aeruginosaCMCC10104和P.aeruginosaATCC 9027 單菌落接種于MH 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)18～24 h，獲得P.aeruginosa菌液，并按要求進(jìn)行稀釋用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。P.aeruginosa平板計(jì)數(shù)采用MH 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定 MIC 測定方法參考前期研究［6］，具體如下：合成后多肽，陽性藥羧芐青霉素（CA）和陰性對照氨芐青霉素（Amp）進(jìn)行2 倍倍比稀釋，最高濃度為256 μmol/L。取50 μL 系列藥物溶液加入96孔板，每個(gè)濃度3 個(gè)復(fù)孔，制備MIC 板?；罨疨.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC 9027，以MH 液體培養(yǎng)基稀釋并制備成2.0×105CFU/mL的菌液，取50 μL 菌懸液加入MIC 板各孔，37 ℃孵育16～18 h，以澄清培養(yǎng)孔的最低濃度記錄為MIC。對包括MIC 及以上濃度各孔進(jìn)行涂平板計(jì)數(shù)，明確各孔銅綠假單胞菌數(shù)量和濃度，以各處理孔中菌落數(shù)低于初始接種量的99.9%的培養(yǎng)孔所對應(yīng)的最低藥物濃度為該多肽的MBC。

1.2.4殺菌動力學(xué)曲線測定 殺菌動力學(xué)曲線測定方法參考前期研究［6］，簡述如下：同“1.2.3”制備P.aeruginosaATCC 9027 的2.0×105CFU/mL 菌液，取50 μL 菌液加至96 孔板中。加入終濃度為1×MIC、2×MIC、4×MIC 的LLM 雜 合抗菌肽溶液，以MH 液體培養(yǎng)基和2×MIC CA 為空白對照和陽性對照，37 ℃孵育。分別在0、1、2、4、6、12 h 時(shí)間點(diǎn)取樣并進(jìn)行平板涂布計(jì)數(shù)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.2.5LPS 中和實(shí)驗(yàn) LPS 中和實(shí)驗(yàn)測定方法參考前期研究［6］，簡述如下：（1）樣品制備：如“1.2.2”制備1.0×105CFU/mL 的P.aeruginosaATCC 9027菌液。制備含有終濃度為4×MIC 的LLM 雜合肽，2×MIC CA 和不含藥物的菌液培養(yǎng)基，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)處理6 個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育處理2 h（所有試劑和耗材為無熱源）。（2）鱟試劑檢測細(xì)菌LPS：每個(gè)處理組選擇3 個(gè)復(fù)孔，收集上清液，采用鱟試劑測定LPS 水平，具體方法和操作步驟參考顯色基質(zhì)鱟試劑盒（T7571，索萊寶）。（3）銅綠假單胞菌活菌數(shù)量檢測：每個(gè)處理組選擇3 個(gè)復(fù)孔，并進(jìn)行菌落平板計(jì)數(shù)，評價(jià)LLM 的抗菌活性。

1.2.6 溶血性測定 溶血性實(shí)驗(yàn)測定方法參考前期 研 究［6］。簡 述 如 下：配 置 成 濃 度 為230 μmol/L（800 μg/mL）的LLM 雜合肽母液，并進(jìn)行2 倍倍比稀釋至濃度為0.1 μg/mL，獲得系列LLM 雜合肽濃度溶液。取5 mL 兔全血，1 500 r/min，4 ℃離心5 min 收集紅細(xì)胞。取1 mL 無菌0.9% NaCl 溶液重懸紅細(xì)胞沉淀，同上離心，去除上清；重復(fù)3 次至無色透明。加入一定體積的生理鹽水制備8%紅細(xì)胞懸液，取100 μL LLM 雜合肽和紅細(xì)胞懸液混合至96 孔板，以無菌生理鹽水和0.1% Triton X-100 作為對照處理組，37 ℃孵育1 h 后，將各孔紅細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管，1 500 r/min，4 ℃離心5 min，取100 μL 上 清 液 于 新 的96 孔 酶 標(biāo) 板，測 定540 nm 吸光度值。定義生理鹽水處理組溶血度為0%，而0.1% Triton X-100 為100%，作為溶血參照。按照如下公式計(jì)算各處理組的溶血性：

溶血度（%）=［（Abs540nm雜合肽LLM-Abs540nm生理鹽水）／（Abs540nm0.1% Triton X-100-Abs540nm生理鹽水）］×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研數(shù)據(jù)處理和繪圖采用Graphpad Prism 9.0軟件；不同處理組間比較采用t檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多肽設(shè)計(jì)

本 研 究 以BPI、LBP、Myxinidin 為 母 體 肽，以GGGS-linker 為鉸鏈，設(shè)計(jì)出BPI-Linker-Myx（BLM）和LBP-Linker-Myx1（LLM）雜合抗菌肽。并對相關(guān)抗菌肽的理論分子量、攜帶正電荷數(shù)、等電點(diǎn)、疏水力矩（μH）和疏水性（GRAVY）進(jìn)行分析，具體參數(shù)見表1。與Myxinidin 母體肽比較，雜合肽BLM 和LLM 所攜帶正電荷數(shù)分別增加至+9和+8，而疏水參數(shù)GRAVY 值降低；另外，BLM 疏水力矩增加，而LLM 疏水力矩降低。對BLM 和LLM 雜合肽進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果表明BLM 質(zhì)譜鑒定的分子量為3 371.2，與理論分子量3 365 相近（圖1 A），而LLM 質(zhì)譜鑒定的分子量為3 459.6，與理論分子量3 454 相近（圖1 B）。

2.2 BLM 和LLM 的 抗 菌 作 用

以P.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC 9027 為 受 試 對 象，對BPI（86～99）、LBP（86～99）、Myxinidin、BLM、LLM、CA 和Amp 抗銅綠假單胞菌效價(jià)進(jìn)行測定。 母體肽BPI（86～99）、LBP（86～99）和Myxinidin 對P.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC 9027 均表現(xiàn)出一定的抗菌活性（表2）。對P.aeruginosa CMCC10104的MIC 分 別 為32、32、16 μmol/L，對P.aeruginosaATCC 9027 的MIC 分別為32、32、16 μmol/L。 雜 合 肽 BLM 對P. aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC 9027 沒 有 抗 菌活性，MIC＞128 μmol/L。LLM 則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗銅綠假單胞菌活性，針對P.aeruginosaCMCC10104和P.aeruginosaATCC9027 的MIC 分別為2 μmol/L和4 μmol/L，與母體肽比較，抗菌活性提高了8～16倍（表2）。MBC 進(jìn)行測定結(jié)果如表2，母體肽的MBC 值均是MIC 值的2～4 倍，即MBC/MIC=2。而LLM 雜合肽MBC 值與MIC 值相同，即MBC/MIC=1，這提示，雜合肽LLM 具有更強(qiáng)的殺菌活性。羧芐青霉素CA 表現(xiàn)出顯著的抗銅綠假單胞菌活性，針對P.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC9027 的MIC 分別為4 μmol/L 和2 μmol/L，但MBC/MIC 值為2 或4。而氨芐青霉素對銅綠假單胞菌無效，與理論相符合。見表2。

表2 MIC 和MBC 測定結(jié)果（μmol/L）Tab 2 The results of MIC and MBC（μmol/L）

2.3 LLM 的殺菌動力學(xué)特征

殺菌動力學(xué)曲線是反映抗菌藥物殺菌特點(diǎn)的重要參數(shù)。以P.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC9027 為目標(biāo)受試菌。P.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC9027 初始接種量 分 別 為（4.46±0.25）log10CFU/mL 和（4.20±0.09）log10CFU/mL，未經(jīng)LLM 干預(yù)處理的CK 組，37 ℃孵育12 h 后，二者分別增加至（8.46±0.20）log10CFU/mL 和（8.34±0.07）log10CFU/mL（圖2）。經(jīng)1×MIC、2×MIC、4×MIC 的LLM 處理1 h 后，P.aeruginosaCMCC10104 菌落數(shù)分別減少了2.7、2.9、3.2 log10CFU/mL（圖2A），而P. aeruginosaATCC9027 減 少 了3.0、2.7、3.2 log10CFUmL（圖2B）。處理12 h 后，P.aeruginosaCMCC10104 和P.aeruginosaATCC9027 分 別 減 少 3.4 和 3.2 log10CFU/mL（圖2A 和B）。相對于CK 組，針對P.aeruginosaCMCC10104和P. aeruginosaATCC9027，4×MIC 的LLM 組菌落數(shù)分別下降了7.5 和7.3 log10CFU/mL。由此可見，LLM 對P.aeruginosa表現(xiàn)出較強(qiáng)的快速殺菌活性，且持續(xù)12 h未見反彈（圖2）。

2.4 雜合肽LLM 中和內(nèi)毒作用

選擇P.aeruginosaATCC9027 作為受試菌，對雜合肽LLM 中和LPS 作用進(jìn)行評估。4×MIC 的LLM 處 理2 h 后，P.aeruginosaATCC9027 數(shù) 量 顯著 下 降3.92 log10CFU/mL，2×MIC 的CA 下 降2.82 log10CFU/mL，提示4×MIC LLM 表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗P.aeruginosaATCC9027 活性（圖3A）。同時(shí)，對銅綠假單胞菌培養(yǎng)液上清中LPS 水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，ddH2O 處理的正常組LPS 水平為0.2 EU/mL，而給予4×MIC LLM 處理組后，LPS 濃度顯著降至0.09 EU/mL（P＜0.001），而2×MIC CA處理組LPS 水平顯著高至0.24 EU/mL（P＜0.05）（圖3B）。與正常組相比，2×MIC CA 處理組的LPS 水平也顯著升高（圖3B）。

2.5 雜合肽LLM 的溶血性

雜合肽LLM 對紅細(xì)胞毒性采用溶血性進(jìn)行評估。115 μmol/L（400 μg/mL）的LLM 雜合肽與兔紅細(xì)胞共孵育后產(chǎn)生的溶血性為0.5%（圖4），低于100 μg/mL（28.75 μmol/L）時(shí)幾乎不產(chǎn)生溶血性，而此濃度遠(yuǎn)高于MBC。因此，LLM 雜合肽在有效殺菌濃度范圍內(nèi)對哺乳動物紅細(xì)胞不具有溶血毒性，具有潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

3 討論

抗生素耐藥已成為全球公共健康問題，對人類健康造成重大威脅，尤其是逐年增多的超級細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌因其區(qū)別革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁和外膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其臨床耐藥問題更加突出［7，8］。挖掘新型抗菌藥物是解決抗生素耐藥問題的有效策略之一?？咕氖且活惥哂衼碓磸V，抗菌活性強(qiáng)且不易耐藥的多肽，是近20 年最有可能突破細(xì)菌耐藥問題的新型候選抗感染藥物之一。

銅綠假單胞菌是一種代表性革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛存在于人皮膚、醫(yī)療器械、水、食物及醫(yī)院或社區(qū)空氣等環(huán)境中，具有較強(qiáng)的生活能力［9］。銅綠假單胞菌屬于條件致病菌，可以感染人體所有器官和部位，引起嚴(yán)重的急慢性感染，甚至引起死亡［10，11］。而銅綠假單胞菌感染的抗生素治療過程還面臨LPS 釋放的挑戰(zhàn)，易誘發(fā)LPS 血癥，增加治療難度［2，12，13］。另外，由于銅綠假單胞菌具有天然的耐藥特性和結(jié)構(gòu)屏障，對諸多抗生素均耐藥，也給其臨床感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)［2］。挖掘具有殺滅銅綠假單胞菌和中和LPS 作用的新型抗銅綠假單胞菌的雙功能候選藥物是解決上述問題的有效策略［14，15］。

抗菌肽是新型抗生素挖掘的潛在目標(biāo)候選藥物，具有包括殺菌、抗病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)功效［16］。一些抗菌肽表現(xiàn)出中和LPS的作用，能夠與LPS 結(jié)合，減輕其對免疫細(xì)胞激活，抑 制 炎 癥 因 子 風(fēng) 暴 產(chǎn) 生［17，18］。Myxinidin 是 來 自 于盲鰻魚體表黏液的代表性魚類抗菌肽，具有抗革蘭氏陰性細(xì)菌活性，但不能夠中和LPS［5］。諸多研究表明，不同功能活性的多肽可以通過小肽柔性linker形成的鉸鏈連接而成新的多功能雜合多肽或蛋白，是藥物設(shè)計(jì)和開發(fā)的有效手段［19-21］。基于此，本研究采用四肽GGGS-linker 實(shí)現(xiàn)了LBP（86～89）和Myxinidin 的雜合，形成具有殺滅銅綠假單胞菌和中和銅綠假單胞菌LPS 的雙重功效的LLM 雜合肽，且活性是母體肽Myxinidin 的4～16 倍。LLM 能夠減少其殺滅銅綠假單胞菌過程中LPS 的釋放量，提示其可能保留了母體肽LBP（86～89）的獨(dú)立結(jié)構(gòu)特征和對LPS 的結(jié)合能力，從而發(fā)揮中和LPS 的作用。由此可見，柔性Linker 鉸鏈設(shè)計(jì)多功能抗菌肽的策略是可行的。

抗菌肽所攜帶正電荷數(shù)與其抗菌活性強(qiáng)度密切相關(guān)，一般情況下，攜帶正電荷數(shù)量越高其與細(xì)菌細(xì)胞膜（負(fù)電）結(jié)合的相互作用可能越強(qiáng)［22，23］，從而表現(xiàn)出對膜的破壞性和抗菌活性就越強(qiáng)。同時(shí)，抗菌肽的兩親性和疏水性的平衡也是影響其抗菌活性的重要因素［22］。基于此，筆者推斷LLM 雜合肽抗銅綠假單胞菌活性增強(qiáng)可能與其攜帶正電荷數(shù)量增加及親水和疏水空間結(jié)構(gòu)的平衡有關(guān)，確切關(guān)系和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。溶血性是臨床藥物安全性評價(jià)的重要指標(biāo)［24］。筆者進(jìn)一步評估了LLM 雜合肽對紅細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明LLM 對紅細(xì)胞在有效抗銅綠假單胞菌濃度范圍內(nèi)不具有紅細(xì)胞毒性。

總之，本研究構(gòu)建出全新的雜合抗菌肽LLM，其具有高效抗銅綠假單胞菌活性和中和銅綠假單胞菌LPS 的雙重功效，抗銅綠假單胞菌的MIC 為2～4 μmol/L，殺菌速度快，無溶血性，具有潛在用于治療銅綠假單胞菌感染的價(jià)值。

作者貢獻(xiàn)度說明：

張澤瑾、張勇：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)的處理和文章的撰寫；張澤瑾、姚宏紀(jì)、展羽桐、薛兆毅、郭瑩潔、吳蒙、藺可鑫和熊婧妍：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施，數(shù)據(jù)的收集。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。