李曉韻，汪 瀚，孫蘭婷，李 祥，江海林，何望生，楊文明，3，花代平

（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230031；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3. 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230031）

Wilson 病（Wilson disease，WD）是由ATP7b基因突變引起的銅代謝障礙性常染色體隱性遺傳疾病［1］。銅沉積導(dǎo)致WD 的臨床癥狀是異質(zhì)性的，主要表現(xiàn)為肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)受損［2］。絕大多數(shù)患者存在不同嚴(yán)重程度的肝纖維化病變，如果治療不及時(shí)，將發(fā)展為肝硬化。最新研究發(fā)現(xiàn)肝臟表型患者臨床常用藥物青霉胺會(huì)抑制免疫系統(tǒng)，增加感染風(fēng)險(xiǎn)［3］，因此仍需探索更為適用的治療方法。

肝豆靈是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，已于臨床應(yīng)用30 余年，由大黃、丹參、莪術(shù)、姜黃、雞血藤、黃連組成，具有解毒化瘀，清熱利膽的功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)肝豆靈可顯著改善WD患者肝纖維化、肝臟功能、凝血指標(biāo)，起到排銅保肝治療作用［4-6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝豆靈能顯著改善銅負(fù)荷大鼠肝纖維化程度，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制銅負(fù)荷大鼠肝組織中Notch 信號(hào)通路，降低TGF-β1、PDGF 的表達(dá)水平等［7，8］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為大數(shù)據(jù)時(shí)代下新興的人工智能交互型研究方法，整合海量臨床、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有多樣性、前沿性［9］。本文使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)了肝豆靈治療WD 肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)與機(jī)制，并使用硫酸銅誘導(dǎo)C57 小鼠肝纖維化模型通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，為日后深入研究肝豆靈作用于WD 肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 肝豆靈活性成分及靶點(diǎn)獲取

在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）中 搜 索 大黃、丹參、莪術(shù)、姜黃、雞血藤、黃連的活性成分?jǐn)?shù)據(jù)，以口服利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，并在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取活性對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，去除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)活性成分，利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt（https：//www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)信息進(jìn)行人源基因標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得到對(duì)應(yīng)靶基因。

1.2 WD 肝纖維化相關(guān)基因數(shù)據(jù)篩選取

以“Wilson disease”、“Wilson’s disease”、“Liver Fibrosis”為關(guān)鍵詞，檢索基因卡片數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards（https：//www. genecards. org/）、藥 物 總 數(shù) 據(jù) 庫(kù)DrugBank（https：//go.drugbank.com/）、遺傳藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)PharmGKB（https：//www.pharmgkb.org/）、疾病相關(guān)的基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)DisGeNET（https：//www.disgenet.org/home/）。

1.3 肝豆靈防治WD 肝纖維化潛在作用靶點(diǎn)獲取

將篩選好的肝豆靈活性成分作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，WD 基因數(shù)據(jù)，肝纖維化基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入獲取韋恩圖的 網(wǎng) 站［10］（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html），得到交集基因數(shù)據(jù)。

1.4 肝豆靈防治WD 肝纖維化交集基因PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING 網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org/）分析藥物與疾病相交集基因的蛋白質(zhì)間相互作用聯(lián)系度，選擇交互分?jǐn)?shù)高度相關(guān)（0.7），并隱藏?zé)o交互節(jié)點(diǎn)。將分析出的數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Cytoscape3.8.2 軟件中進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（PPI），并按蛋白質(zhì)相互作用關(guān)聯(lián)度中心性（Degree）值得到排名前十基因。

1.5 交集基因富集分析

將上文篩出的108 個(gè)藥物、疾病交集基因相關(guān)導(dǎo)入到R version 4.1.2 中。用R 包下載GO 數(shù)據(jù)庫(kù)以及KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行肝豆靈與疾病交集基因富集分析，繪制柱狀圖。GO 分析細(xì)化為分子功能、生物過(guò)程、細(xì)胞組分分析。為精簡(jiǎn)數(shù)據(jù)，GO 富集分析結(jié)果按P值取前20 后按照基因數(shù)排序，KEGG 富集分析結(jié)果以基因數(shù)取前20 排序，并進(jìn)行柱狀圖繪制。

1.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)C57 雄性小鼠，體重（25±5）g，購(gòu)于杭州醫(yī)學(xué)院，合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度（21±2）℃，濕度50%±5%，自然晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食飲水。本次實(shí)驗(yàn)操作遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.6.2藥物 肝豆靈片，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（皖藥制字Z20050071）；青霉胺片，上海上藥信誼藥廠(chǎng)有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)H31022286）；五水合硫酸銅（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20201105）；高銅飼料（合肥青源生物科技有限公司，批號(hào)20210516）。

1.6.3試劑與儀器 主要試劑：山羊抗小鼠β-actin（批號(hào)：19AW0505）、山羊抗小鼠IgG（批號(hào)：142637）、山羊抗兔IgG（批號(hào)：139931），廠(chǎng)家Zs-BIO；P-C-JUN（批 號(hào)：37j3230）、P38（批 號(hào)：10y0837）、p-P38（批 號(hào)：79d6101）、JNK（批 號(hào)：51n7087）、p-JNK（批號(hào)：36c5455），廠(chǎng)家Affinity。

主要儀器：電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）；常溫微量離心機(jī)（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司）；自動(dòng)曝光儀（上海培清科技有限公司）。

1.6.4 分組及給藥方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為空白組，模型組及肝豆靈低劑量組、中劑量組、高劑量組和青霉胺組。參照文獻(xiàn)［8］造模以含硫酸銅1.5 g/kg 的小鼠飼料和0.185% 硫酸銅去離子水喂養(yǎng)24 周。于第12 周，給藥組按70 kg 體重成人日用量的9 倍進(jìn)行換算，肝豆靈高、中、低劑量組 按1.16 g·kg-1·d-、0.58 g·kg-1·d-、0.29 g·kg-1·d-1，青霉胺組按0.1 g·kg-1·d-進(jìn)行灌胃?？瞻捉M用等容積的生理鹽水，每天1 次，連續(xù)灌胃12 周［11］。

1.6.5 肝組織病理學(xué)檢測(cè) 肝組織切片、脫水、包埋、封片，進(jìn)行Masson 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)及肝纖維化程度。

1.6.6 Western Blot 檢測(cè)肝組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 稱(chēng)取各組小鼠肝組織70 mg，提取總蛋白，電泳后處理樣品使蛋白充分變性。上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入P38（1∶1 000）、JNK（1∶1 000）、CJUN（1∶1 000）、p-P38（1∶1 000）、p-JNK（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入洗滌液（PBST），每次洗滌10 min，共洗滌3 次。室溫二抗（1∶10 000）孵育2 h，加入洗滌液（PBST），分3 次洗滌，每次10 min，在暗室中進(jìn)行蛋白檢測(cè)，用Image J 1.8.0.112 軟件進(jìn)行膠片條帶的分析，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肝豆靈主要活性成分及靶點(diǎn)

將中藥活性成分整合并按OB 值排序，排名前20 藥物活性成分，見(jiàn)表1。肝豆靈的組成藥物中起作用的成分為：紫丹參萜醚、黃麻苷A、穆坪馬兜鈴酰胺、蘆薈大黃素、雙去甲氧基姜黃素、驢食草酚、丹參醛、丹參醌酚Ⅱ、8-鄰-甲雷杜辛、贗靛黃素、刺芒柄花素、表丹參螺縮酮內(nèi)脂、黃藤素等。

表1 肝豆靈中OB 值排名前20 的藥物活性成分Tab 1 Drug active components with OB value ranking top 20 in Gan Dou Ling

2.2 肝豆靈防治WD 肝纖維化潛在治療靶點(diǎn)

GeneCards 數(shù) 據(jù) 過(guò) 多，以Relevance score＞9.800 144 196 為條件進(jìn)行篩選，并將所有基因取并集，最終整理出WD 密切相關(guān)基因1 287 個(gè)，肝纖維化密切相關(guān)基因2 144 個(gè)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入jvenn 網(wǎng)站（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html）中獲取藥物疾病交集基因108 個(gè)。

2.3 肝豆靈防治WD 肝纖維化PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其核心基因

將交集基因?qū)隨TRING 網(wǎng)站進(jìn)行PPI 分析，用Cytoscape3.8.2 繪圖，見(jiàn)圖1，并按度值排序得到排名前10 基因，見(jiàn)圖2。

可見(jiàn)絲/蘇氨酸蛋白激酶1、腫瘤壞死因子、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3、JUN（又稱(chēng)C-JUN）、白介素6、抑癌基因TP53、內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子A、表皮生長(zhǎng)因子、白介素1β、胱天蛋白酶3 受體是肝豆靈作用于WD 肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵靶基因。

2.4 交集基因富集分析結(jié)果

GO 富集分析結(jié)果顯示肝豆靈主要通過(guò)生物過(guò)程中傷口愈合、對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)；細(xì)胞組分中的膜筏、膜微區(qū)、囊腔D-結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合；分子功能中的受體-配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、信號(hào)受體激活劑活性在WD肝纖維化病程中起作用。

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示肝豆靈在WD 肝纖維化病變過(guò)程中主要作用于：絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路發(fā)揮治療效果（圖3）。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.5.1 各組小鼠肝組織病理比較 由肝組織MASSON 染色結(jié)果可見(jiàn)：各治療組匯管區(qū)周?chē)z原纖維藍(lán)染量比模型組顯著減少。模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中央靜脈周?chē)汤w維間隔形成，局灶炎性細(xì)胞聚集，見(jiàn)圖4。

2.5.2 各組小鼠肝組織中P38、p-P38、JNK、p-JNK、p-C-JUN 蛋白表達(dá)量比較 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示各組小鼠肝組織中P38、JNK 表達(dá)并無(wú)明顯差異，p-P38、p-JNK、p-C-JUN 在肝豆靈中劑量組、肝豆靈高劑量組、青霉胺組中的表達(dá)抑制更為明顯（P＜0.000 1），見(jiàn)表2，圖5。

表2 各組小鼠肝組織P38、p-P38、JNK、p-JNK、p-C-JUN 蛋白表達(dá)量比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of P38，p-P38，JNK，p-JNK，p-C-JUN protein expression in liver tissue of mice in each group（n=3，±s）

表2 各組小鼠肝組織P38、p-P38、JNK、p-JNK、p-C-JUN 蛋白表達(dá)量比較（n=3，±s）Tab 2 Comparison of P38，p-P38，JNK，p-JNK，p-C-JUN protein expression in liver tissue of mice in each group（n=3，±s）

注：與空白組比較，#P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.01。

組別空白組模型組肝豆靈低劑量組肝豆靈中劑量組肝豆靈高劑量組青霉胺組p-C-JUN/β-actin 0.23±0.02 0.72±0.02#0.61±0.03*0.52±0.03*0.43±0.03*0.32±0.02*P38/β-actin 0.73±0.02 0.73±0.01 0.74±0.02 0.74±0.03 0.72±0.02 0.73±0.03 p-P38/ P38 0.47±0.03 1.10±0.05#0.96±0.05*0.82±0.01*0.73±0.03*0.56±0.03*JNK/β-actin 0.82±0.02 0.80±0.03 0.84±0.01 0.83±0.04 0.81±0.05 0.79±0.04 p-JNK/JNK 0.40±0.01 1.03±0.05#0.86±0.04*0.71±0.03*0.62±0.02*0.47±0.04*

3 討論

銅雖然是人體內(nèi)必不可少的微量元素，但當(dāng)攝入過(guò)量或代謝障礙時(shí)，銅的積累將產(chǎn)生高毒性［12］。WD 是由于ATP7b 基因突變引起的肝臟銅代謝障礙的遺傳病。肝臟作為銅代謝障礙第一受累器官，過(guò)量的銅能夠直接損傷肝細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)成分、破壞氧化還原平衡，引起炎癥反應(yīng)進(jìn)而引發(fā)肝纖維化［13］，肝病是約40%～60% WD 患者的首發(fā)臨床表現(xiàn)［14］。中醫(yī)并無(wú)WD 病名的相關(guān)記載，根據(jù)其臨床癥狀可歸于“肝風(fēng)”、“積聚”等范疇。銅毒內(nèi)聚、痰瘀阻絡(luò)是WD 發(fā)病關(guān)鍵，銅毒內(nèi)聚阻礙氣機(jī)，膽汁排泄障礙，肝失疏泄發(fā)為“肝風(fēng)”，臨床表現(xiàn)為震顫、精神神經(jīng)癥狀等。痰濕之邪與瘀血相結(jié)合，“積聚”由此而生，臨床表現(xiàn)為肝脾腫大、脾功能亢進(jìn)，甚者會(huì)進(jìn)展成肝硬化。

此次研究通過(guò)整合分析各平臺(tái)數(shù)據(jù)得到肝豆靈活性成分119 個(gè)，肝豆靈- WD 肝纖維化交集基因108 個(gè)。既往資料表明在肝豆靈核心活性成分中，蘆薈大黃素能改善肝功能、減輕肝臟炎性浸潤(rùn)［15］；雙去甲氧基姜黃素通過(guò)抗炎、抗氧化起到護(hù)肝作用［16］；刺芒柄花素具有抗炎、抗病毒作用［17］；黃藤素可通過(guò)激活細(xì)胞自噬性保護(hù)機(jī)制等，起到改善肝損傷、減輕炎癥、抑制纖維化進(jìn)程的作用［18，19］。這提示肝豆靈的有效成分大多通過(guò)抗炎、抗氧化等起到改善WD 肝纖維化的作用。在肝豆靈治療WD肝纖維化的核心基因中，絲/蘇氨酸蛋白激酶1 會(huì)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生進(jìn)而激發(fā)肝纖維化［20］；腫瘤壞死因子、白介素6、白介素1β 均為炎癥因子基因，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展［21］；信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3 通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)參與纖維化進(jìn)程［22］；而C-JUN 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中肝細(xì)胞存活的重要調(diào)節(jié)因子，據(jù)報(bào)道C-JUN 的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)肝纖維化發(fā)生［23］。聯(lián)系核心基因分析結(jié)果與KEGG 富集分析結(jié)果，本文選擇相關(guān)性高的MAPK 信號(hào)通路作為肝豆靈防治WD肝纖維化研究靶點(diǎn)。MAPK 是一種基于磷酸化傳導(dǎo)形式，以級(jí)聯(lián)放大為特征的信號(hào)通路。該通路在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，與免疫相關(guān)疾病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、組織器官纖維化等密切相關(guān)。真核細(xì)胞內(nèi)P38 MAPK 通路、C-JUN 氨基端激酶（JNK）通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERKs）通路是3 條經(jīng)典MAPK信號(hào)通路。其中P38 MAPK 通路在炎癥和細(xì)胞程序性死亡等應(yīng)激反應(yīng)中起到重要作用［24］；JNK 信號(hào)傳導(dǎo)與肝細(xì)胞中的細(xì)胞死亡、存活、分化、增殖和腫瘤發(fā)生有關(guān)，此外它參與炎癥和纖維化［25］。在肝纖維化小鼠模型中可見(jiàn)P38 MAPK 、JNK 信號(hào)通路的激活增多［26，27］，且抑制P38/JNK 信號(hào)通路可減緩肝組織纖維化病理進(jìn)程。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明銅在小鼠肝臟的長(zhǎng)期過(guò)載會(huì)引發(fā)肝纖維化，且P38/JNK 信號(hào)通路在此病程中被激活。與模型組相比，喂中藥組小鼠肝組織中P38/JNK 信號(hào)通路被抑制，其中肝豆靈高劑量組的通路抑制作用尤為明顯，提示肝豆靈抑制WD 肝纖維化進(jìn)程可能是通過(guò)抑制MAPK 信號(hào)通路的激活，減少通路相關(guān)蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。但其中的具體作用機(jī)制還不明確，需要進(jìn)一步的探索研究。

綜上，本次研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了肝豆靈防治WD 肝纖維化的可能分子作用機(jī)制，并通過(guò)銅負(fù)荷小鼠實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了肝豆靈可能是通過(guò)抑制P38/JNK 信號(hào)通路激活，減少通路相關(guān)蛋白表達(dá)量起到治療WD 肝纖維化的作用。此次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究肝豆靈的藥物有效成分基礎(chǔ)分析及分子作用機(jī)制提供參考，也使日后相關(guān)研究更具針對(duì)性。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。