胡小媛，尹飛飛，張俊清，李永輝，張旭光

（1. 海南醫(yī)學(xué)院熱帶轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；2. 海南醫(yī)學(xué)院海南省熱帶藥用植物研究開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；3. 海南醫(yī)學(xué)院?？谑欣枳遽t(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199；4. 海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199；5.海南醫(yī)學(xué)院-香港大學(xué)熱帶傳染病聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571199）

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）是具有包膜結(jié)構(gòu)的非節(jié)段單股負(fù)鏈RNA 病毒，屬于單股負(fù)鏈病毒目，副黏液病毒科，肺病毒亞科，肺病毒屬。該病毒最早由Morris 等在1956 年從黑猩猩中首次分離出來(lái)，此后在患嚴(yán)重下呼吸道疾病的嬰兒體內(nèi)也分離到［1］。HRSV 是導(dǎo)致嬰幼兒急性下呼吸道感染（acute lower respiratory infection，ALRI）的最常見(jiàn)病毒病原體之一［2］。時(shí)至今日，HRSV 仍然是引起1 歲以下兒童尤其是早產(chǎn)兒毛細(xì)支氣管炎的常見(jiàn)原因［3］。據(jù)Zhang 等［4］對(duì)來(lái)自135 篇報(bào)道文獻(xiàn)中的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析研究顯示，489 641 例急性呼吸道感染患者的病原體檢測(cè)結(jié)果中，HRSV 的感染率最高，高達(dá)18.7%，高于流感病毒、副流感病毒、鼻病毒等常見(jiàn)呼吸道病原體的感染率，其中大部分感染對(duì)象為嬰幼兒。目前，僅有帕利珠單抗和利巴韋林被批準(zhǔn)用于HRSV感染的預(yù)防或治療。帕利珠單抗是一種人源化單克隆抗體，已被證明可顯著降低高危兒童的疾病嚴(yán)重程度，但僅能用于預(yù)防高?；純篐RSV 感染，并不能用于治療HRSV 感染，且價(jià)格昂貴，不能滿(mǎn)足臨床應(yīng)用需求［5］。利巴韋林屬于廣譜抗病毒藥，但其毒副作用大，一般只推薦用于HRSV 感染的高危人群的重癥嬰兒［6］。盡管強(qiáng)心苷（cardiac glycoside）、地高辛（digoxin）和環(huán)鹽酸嗎甲吡嗪酸（cyclopiazonic acid）等藥物被報(bào)道具有抗HRSV 感染的活性并有部分藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，然而目前還沒(méi)有其他可用的抗感染和治療藥物［7，8］。中國(guó)傳統(tǒng)中藥抗病毒具有毒副作用小、高效、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)勢(shì)，受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注［9，10］。三叉苦、黃皮葉、路邊青、裸花紫珠、膽木、角花胡頹子和竹葉椒為具有清熱、解毒和抗炎作用的中藥，常用于臨床炎癥相關(guān)感染性疾病的治療［11-13］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)三叉苦水提物、黃皮葉水提物、路邊青水提物、裸花紫珠水提物、膽木醇提物、膽木水提物、角花胡頹子醇提物、角花胡頹子水提物和竹葉椒醇提物共9 種傳統(tǒng)中藥提取成分體外抗HRSV 的效果進(jìn)行了評(píng)估，以期為新型抗HRSV 的藥物開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞和病毒 人喉癌上皮細(xì)胞（Hep-2，ATCC CCL-23）和人呼吸道合胞病毒A 型（HRSVA，ATCC VR-26）由中科院上海巴斯德研究所贈(zèng)送，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2藥材來(lái)源 （1）三叉苦采集于海南瓊中黎母山，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為蕓香科吳茱萸屬植物三叉苦Evodia lepta（Spreng.）Merr.的根。

（2）黃皮葉采集于海南屯昌，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為蕓香科黃皮屬植物黃皮Clausena lansium（Lour.）Skeels 的葉。

（3）路邊青采集于?？谟琅d，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為馬鞭草科植物大青Clerodendrum cyrtophyllumTurcz.的地上部分。

（4）裸花紫珠采集于海南五指山，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為馬鞭草科植物裸花紫珠Callicarpa nudifloraHook.et Arn.的葉。

（5）膽木采集于海南瓊中，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為茜草科植物烏檀Nauclea officinalisPierre.ex Pitard 的莖枝。

（6）角花胡頹子采集于海南五指山，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為胡頹子科角花胡頹子Elaeagnus gonyanthesBenth.的根。

（7）竹葉椒采集于廣西南寧，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院田建平教授鑒定為蕓香科植物竹葉椒ZanthoxylumarmatumDC.的根。

1.1.3樣品制備 （1）三叉苦水提物的制備：取三叉苦藥材100 g，加8 倍量以上的水進(jìn)行2 次提取，合并2 次提取液，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL。量取提取液50 mL，80 ℃蒸干，得浸膏4.9 g，計(jì)算浸膏含量為98 mg/mL。

（2）黃皮葉水提物：取黃皮葉藥材100 g 藥材，加8 倍量以上的水進(jìn)行2 次提取，合并2 次提取液，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL。量取提取液50 mL，80 ℃蒸干，得浸膏11.9 g，計(jì)算浸膏含量為238 mg/mL。

（3）路邊青水提物：取路邊青藥材100 g 藥材，加8 倍量以上的水進(jìn)行2 次提取，合并2 次提取液，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL。量取提取液50 mL，80 ℃蒸干，得浸膏12.7 g，計(jì)算浸膏含量為254 mg/mL。

（4）裸花紫珠水提物：取裸花紫珠藥材100 g，加8 倍量以上的水進(jìn)行2 次提取，合并2 次提取液，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL。量取提取液50 mL，80 ℃蒸干，得浸膏2.5 g，計(jì)算浸膏含量為50 mg/mL。

（5）膽木水提物：取膽木藥材100 g 藥材，加8 倍量以上的水進(jìn)行2 次提取，合并2 次提取液，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL。量取提取液50 mL，80 ℃蒸干，得浸膏3.2 g，計(jì)算浸膏含量為64 mg/mL。

（6）膽木醇提物：取膽木藥材20 g，加8 倍量95 %乙醇提取兩次，合并兩次提取液，減壓干燥得浸膏0.557 g，精密稱(chēng)取膽木乙醇提取物32 mg，加1 mL DMSO 溶解，得含量為32 mg/mL 的膽木樣品。

（7）角花胡頹子醇提物：取角花胡頹子藥材50 g，加8 倍量95 %乙醇提取兩次，合并兩次提取液，減壓干燥得浸膏2.369 g，精密稱(chēng)取角花胡頹子提取物30 mg，加1 mL DMSO 溶解，得含量為30 mg/mL 的角花胡頹子醇提物樣品。

（8）角花胡頹子水提物；取角花胡頹子藥材50 g，加8 倍量以上的水進(jìn)行2 次提取，合并2 次提取液，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL。量取提取液50 mL，80 ℃蒸干，得浸膏1.929 g，計(jì)算浸膏含量為38.6 mg/mL。

（9）竹葉椒醇提物：取藥材50 g，加8 倍量95%乙醇提取兩次，合并兩次提取液，減壓干燥，得浸膏4.7 g，精密稱(chēng)取竹葉椒提取物20 mg，加1 mL DMSO 溶解，得含量為20 mg/mL 的竹葉椒樣品。

（10）表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）購(gòu)于成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.1.4 主要試劑和儀器 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶（0.25% EDTA-Trypsin）、抗生素（青霉素和鏈霉素）、PBS 緩沖液均購(gòu)自Gibco BRL 公司，CCK-8 試劑購(gòu)自Dojindo 東仁化學(xué)科技（上海）有限公司，生物安全柜購(gòu)自蘇凈安泰公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自Esco 公司，生物倒置顯微鏡（XDS-1B）為重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品，酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x）購(gòu)自Molecular Devices 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 傳代細(xì)胞Hep-2 培養(yǎng)于T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。生長(zhǎng)達(dá)到培養(yǎng)瓶90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，用胰酶（0.25% EDTA-Trypsin）消化細(xì)胞，吸去胰酶，用新的含10%FBS、1% 雙抗的DMEM 培養(yǎng)基稀釋后轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒培養(yǎng) 提前1 d 傳代Hep-2 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90% 培養(yǎng)瓶時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS 緩沖液潤(rùn)洗一遍后加入200 μL 病毒原液和800 μL 含2 %FBS 的DMEM 培 養(yǎng) 基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中感染1.5 h，每15 min 搖動(dòng)培養(yǎng)瓶使病毒充分感染細(xì)胞。再補(bǔ)充2%FBS 培養(yǎng)基至5 mL。培養(yǎng)2～3 d，當(dāng)觀察到細(xì)胞病變達(dá)到80%～90%，吸出培養(yǎng)液，離心后取上清分裝并在液氮中速凍10 min 后保存在-80 ℃冰箱。

1.2.3 病毒滴度TCID50測(cè)定 將Hep-2 細(xì)胞用含2 %FBS 的DMEM 培養(yǎng)基稀釋成1×104個(gè)/mL。病毒按梯度10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋?zhuān)♂尯玫牟《疽悍謩e與稀釋的細(xì)胞等體積混合，加到96 孔板中，每孔100 μL，每個(gè)梯度6 個(gè)孔。細(xì)胞對(duì)照每孔只加入100 μL 含5×103個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變程度，培養(yǎng)5 d 后，按CCK-8 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)細(xì)胞活性并計(jì)算細(xì)胞存活率。以每孔細(xì)胞存活率低于或等于50%為病毒感染陽(yáng)性，大于50%為病毒感染陰性，根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算病毒的半數(shù)感染量（TCID50），本實(shí)驗(yàn)所用病毒HRSV-A 測(cè)得的滴度為6.32×105TCID50/mL。

1.2.4 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn) 按每孔1×104個(gè)細(xì)胞將Hep-2 細(xì)胞鋪入96 孔板，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞長(zhǎng)成單層，用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將藥物按2 倍倍比稀釋成一系列不同濃度，棄去孔中舊培養(yǎng)液，加入一系列不同濃度的藥物稀釋液，每孔100 μL，細(xì)胞對(duì)照孔和空白對(duì)照孔不加藥物，加入100 μL 含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每個(gè)藥物濃度均重復(fù)3 個(gè)孔。在顯微鏡下觀察藥物處理組細(xì)胞病變情況，CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活性，按照說(shuō)明書(shū)每孔加入10 μL CCK-8 試劑，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)OD 值。計(jì)算各濃度藥物的細(xì)胞存活率（%）=［（OD 樣品-OD 空白對(duì)照）/（OD 細(xì)胞對(duì)照-OD 空白對(duì)照）］×100%，用GraphPad Prism 7.04 軟件繪圖并用其非線性回歸方法計(jì)算藥物的半數(shù)毒性濃度（CC50）［14］。

1.2.5 藥物對(duì)HRSV-A 的抑制作用 按每孔1×104個(gè)細(xì)胞將Hep-2 細(xì)胞鋪入96 孔板，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞長(zhǎng)成單層，用含2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將藥物稀釋成所需濃度。用含2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將病毒稀釋成一定濃度（按每孔MOI=0.5 計(jì)算）。將稀釋好的不同濃度藥物分別與病毒稀釋液1∶1 等體積混合，混合均勻。棄去孔中舊培養(yǎng)液，加入藥物與病毒混合液，每孔100 μL。細(xì)胞對(duì)照孔和空白對(duì)照孔不加藥物和病毒，加 入100 μL 含2%FBS 的DMEM 培 養(yǎng) 基，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。每個(gè)濃度組均重復(fù)3 個(gè) 孔。按 說(shuō) 明 書(shū) 每 孔 加 入10 μL CCK-8 試 劑，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1.5 h，酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)OD 值。計(jì)算各濃度藥物的細(xì)胞存活率（%）=［（OD 樣品-OD 空白）/（OD 細(xì)胞對(duì)照-OD 空白對(duì)照）］×100%，用GraphPad Prism 7.04 軟件繪圖并用其非線性回歸方法計(jì)算藥物半數(shù)有效濃度（EC50）［14］。

藥物治療指數(shù)（TI）= 藥物半數(shù)毒性濃度（CC50）/藥物半數(shù)有效濃度（EC50）

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)

為了評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，將藥物按2倍梯度稀釋成一系列濃度，分別加入到Hep-2 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h 后用CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性，并計(jì)算CC50。結(jié)果如圖1 所示，隨著各藥物濃度的提高，細(xì)胞存活率均呈明顯遞減趨勢(shì)。三叉苦水提物、黃皮葉水提物、路邊青水提物、裸花紫珠水提物、膽木水提物、膽木醇提物、角花胡頹子醇提物、角花胡頹子水提物及竹葉椒醇提物的CC50分別為1.85、＞2.38、0.93、0.65、0.85、1.00、0.32、2.84、0.10 mg/mL（圖1 A～I(xiàn)），其中黃皮葉水提物對(duì)細(xì)胞的毒性作用最弱，在本實(shí)驗(yàn)最大濃度2.38 mg/ mL 時(shí)細(xì)胞的存活率仍能達(dá)到95%以上，CC50為＞2.38 mg/mL（圖1 B）。在本實(shí)驗(yàn)所受試的藥物中，竹葉椒醇提物對(duì)細(xì)胞的毒性最強(qiáng)，CC50為0.1 mg/mL（圖1 I）。陽(yáng)性對(duì)照EGCG 的CC50為0.04 mg/mL（圖1 J）。

2.2 藥物對(duì)HRSV-A 的抑制作用

根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇細(xì)胞存活率大于50%的藥物濃度進(jìn)行抗病毒實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各藥物不同濃度處理的細(xì)胞存活率及半數(shù)有效濃度（EC50）。結(jié)果如圖2 和圖3 所示，除了竹葉椒醇提物對(duì)HRSVA 沒(méi)有明顯抑制作用（圖2 I），無(wú)EC50結(jié)果，其他8 種受試藥物（三叉苦水提物、黃皮葉水提物、路邊青水提物、裸花紫珠水提物、膽木水提物、膽木醇提物、角花胡頹子醇提物及角花胡頹子水提物）對(duì)HRSVA 都有不同程度的抑制作用，且均具有劑量依賴(lài)性，EC50分別為0.30、0.70、0.05、0.03、0.11、0.53、＞2、0.05 mg/mL（圖2A～H），其中對(duì)HRSV-A 抑制作用最強(qiáng)的是裸花紫珠水提物，EC50僅為0.03 mg/mL（圖2 D），其次是路邊青水提物和角花胡頹子水提物，EC50均為0.05 mg/mL（圖2 C 和H）。陽(yáng)性對(duì)照EGCG 的EC50為0.002 mg/mL（圖2 J）。

病毒HRSV-A 感染細(xì)胞Hep-2 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞融合形成多核的合胞體，光學(xué)顯微鏡下可觀察到細(xì)胞病變情況，結(jié)果如圖3 所示，病毒感染對(duì)照組（圖3 B）出現(xiàn)大片合胞體，且大部分細(xì)胞脫落漂浮，裸花紫珠水提物和路邊青水提物處理組均未出現(xiàn)明顯合胞體（圖3 C 和D），細(xì)胞形態(tài)均接近正常細(xì)胞對(duì)照組（圖3 A），角花胡頹子水提物處理組有很少量的合胞體，但大部分細(xì)胞形態(tài)接近正常細(xì)胞對(duì)照組（圖3 A）。

計(jì)算各藥物的治療指數(shù)（TI），結(jié)果如表1 所示，TI 最高的為角花胡頹子水提物，達(dá)56.80，其次為裸花紫珠水提物和路邊青水提物，TI 分別為21.67 和18.60，陽(yáng)性對(duì)照EGCG 的TI 為20.00。

表1 藥物的治療指數(shù)（TI）Tab 1 Therapeutic index（TI）of drugs

3 討論

HRSV 是引起ALRI 的最常見(jiàn)病毒病原體之一，對(duì)嬰幼兒健康造成嚴(yán)重威脅。至今臨床上只有帕利珠單抗和利巴韋林被批準(zhǔn)用于HRSV 感染的預(yù)防或治療，且效果欠佳。一直以來(lái)，在病毒性感染疾病的治療中，中國(guó)傳統(tǒng)中藥發(fā)揮了重要作用，具有抗病毒顯著、毒副作用小、來(lái)源豐富等優(yōu)勢(shì)［15］。目前已有多種中藥被報(bào)道具有抗HRSV 活性，復(fù)方主要有金欣口服液、金振口服液、定喘湯、肺炎Ⅰ號(hào)、連花清瘟顆粒、清氣解毒方和貫黃顆粒等，單味中藥主要有黃芩提取物、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、翻白草和菊花總黃酮等［16-20］。

中藥水提取和醇提取是最常用的兩種提取方式，其中水提取主要獲得藥材中的親水性成分，95%乙醇提取可以獲取藥材中的親脂性成分，由于三叉苦、黃皮葉、路邊青和裸花紫珠主要為黃酮類(lèi)和酚苷類(lèi)成分［21-24］，具有較好的水溶性，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了水提取的方式；而竹葉椒主要為木脂素類(lèi)化合物［25］，水溶性較差，因此本文采用了95%乙醇提取的方式；對(duì)于研究較少的膽木和角花胡頹子，在實(shí)驗(yàn)中采用了2 種提取方法進(jìn)行了觀察和比較。本研究結(jié)果顯示，路邊青水提物、裸花紫珠水提物和角花胡頹子水提物具有較好的抗HRSV-A 效果，其中裸花紫珠水提物抗HRSV-A 活性最強(qiáng)，EC50最低，為0.03 mg/mL。治療指數(shù)（TI）通常是評(píng)價(jià)藥物安全性的參考指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)裸花紫珠水提物的TI 值與陽(yáng)性對(duì)照EGCG 相當(dāng)，但裸花紫珠水提物的CC50遠(yuǎn)高于EGCG 的CC50，提示裸花紫珠水提物可能具有更低的毒性。另外，角花胡頹子水提物相對(duì)于路邊青水提物、裸花紫珠水提物和EGCG，TI 值（56.80）最高，這提示角花胡頹子安全性可能優(yōu)于路邊青水提物、裸花紫珠水提物和EGGG，也具有潛在開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

裸花紫珠是一種常用的海南傳統(tǒng)民族藥材，臨床上主要用于止血和抗炎，除此之外，有研究表明裸花紫珠還具有抗菌、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合、抗氧化及抗腫瘤等功能［11，26］。已有報(bào)道證明裸花紫珠具有抗單純皰疹病毒、EV-71 病毒活性［27，28］，但未見(jiàn)關(guān)于其抗HRSV-A 的報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)了裸花紫珠水提物具有較強(qiáng)的抗HRSV-A 活性。角花胡頹子是海南黎族地區(qū)常用的傳統(tǒng)藥材之一，主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腿痛、河豚中毒、支氣管哮喘、慢性支氣管炎等疾病治療［12］，關(guān)于其抗病毒效果未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究通過(guò)體外細(xì)胞感染模型對(duì)角花胡頹子的醇提物和水提物分別進(jìn)行了細(xì)胞毒性和抗病毒作用評(píng)估，結(jié)果表明角花胡頹子醇提物抗病毒效果不甚理想，其細(xì)胞毒性也更強(qiáng)，而角花胡頹子水提取物具有較強(qiáng)的抗呼吸道合胞病毒活性和良好的治療指數(shù)，提示角花胡頹子的抗病毒成分主要為水溶性成分。

目前關(guān)于抗HRSV 的中藥研究中，以復(fù)方研究較為深入，并且獲得良好療效，具有廣泛應(yīng)用前景［16］，因此在今后的研究中，可以對(duì)抗HRSV 效果較好的藥物進(jìn)行聯(lián)合抗病毒活性評(píng)估；同時(shí)也需對(duì)其抗病毒活性成分以及藥理機(jī)制等方面進(jìn)行進(jìn)一步研究探索。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

胡小媛、張旭光：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)處理及論文撰寫(xiě)；李永輝：負(fù)責(zé)藥材收集、樣品制備及實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)；張俊清和尹飛飛：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文修改指正。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。