紀(jì)曉迪，吳愛明，呂 夢，楊 丁，婁利霞，聶 波，趙久麗，趙明鏡

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700）

心肌梗死（MI）是全世界主要的住院和死亡原因之一。在各個年齡段均有較高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響人類生命健康［1，2］。心力衰竭是心肌梗死的終末階段，而心肌纖維化在心梗后心衰進(jìn)展中扮演重要角色［3］。在MI 后，心臟產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能重塑，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和細(xì)胞外膠原沉積。起初，心臟重塑是一個代償適應(yīng)性過程，但隨著疾病進(jìn)展，會發(fā)生明顯的心臟結(jié)構(gòu)改變，而心肌纖維化則是關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)［4，5］。越來越多的證據(jù)表明micoRNA 與MI 后的纖維化過程密切相關(guān)，是潛在的治療靶點(diǎn)［6-8］，其中miR-133a 參與了MI 的發(fā)生、發(fā) 展［9，10］。多 項(xiàng) 生 物 信 息 軟 件 顯 示TGF-β1 為miR-133a 的靶基因［11］。TGF-β1 被認(rèn)為是主要的促纖維化因子，通過磷酸化激活smad2、smad3 進(jìn)行纖維 化 信 號 傳 導(dǎo)［12-14］。 研 究 線 索 表 明miR-133a/TGF-β1/smads 通路可能是抑制MI 后心肌纖維化進(jìn)展的潛在干預(yù)途徑［15，16］。

芪藶強(qiáng)心膠囊由黃芪、人參、附子、丹參、澤瀉、葶藶子、玉竹、桂枝、紅花、陳皮和香加皮配伍而成，具有益氣溫陽、活血通絡(luò)、利水消腫之功效，可用于心梗后心衰的防治?？ㄍ衅绽?，一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI），是臨床治療心力衰竭的經(jīng)典藥物，多項(xiàng)研究報(bào)道其可以改善心衰大鼠的心肌纖維化［17-19］。因此，本研究以卡托普利為陽性對照藥物，旨在從miR-133a/TGF-β1/smads 通路基因調(diào)控角度研究芪藶強(qiáng)心膠囊改善MI 大鼠心肌組織纖維化的分子機(jī)制，為其在臨床中應(yīng)用提供更多基礎(chǔ)研究證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級雄性Sprague-Dawley 大鼠（SD 大鼠），體重（200±20）g，6 周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證編號SCXK（北京）2012-0001。本研究所有實(shí)驗(yàn)方案及動物應(yīng)用取得北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2藥物及試劑 芪藶強(qiáng)心膠囊（規(guī)格0.3 g/粒，國藥準(zhǔn)字Z20040141，石家莊以嶺藥業(yè)有限公司），卡托普利片（12.5 mg/片，批準(zhǔn)文號：AAN9869，中美上海施貴寶制藥有限公司）。Trizol 試劑（批準(zhǔn)文號：15596026，Thermo Fisher Scientific 公司）；miRNA 提 取 試 劑 盒（批 準(zhǔn) 文 號：217004，QIAGEN 公司）；miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批準(zhǔn)文號：4366596，Applied Biosystems 公司）；實(shí)時熒光PCR 擴(kuò)增試劑盒（批準(zhǔn)文號：4472897，Applied Biosystems 公司）；Masson 染液（批準(zhǔn)文號：D026，南京建成生物工程研究所）；TGF-β1、Smad2、Smad3、col-Ⅰ、col-Ⅲ基因引物均來自諾賽基因組研究中心有限公司。

1.1.3儀器 心電圖機(jī)（日本福田多道分析心電圖機(jī)，型號：FX-7202）；小動物呼吸機(jī)（奧爾科特，型號：ALC-V8S）；基因擴(kuò)增儀（Applied Biosystems，型 號：GeneAmp PCR system 9700）；Real-Time PCR 儀（安捷倫，型號：Mx3000P）；紫外分光光度計(jì)（Pharmacia Biotech，型號：GeneQuant）。石蠟切片機(jī)（徠卡，型號：RM2235），光學(xué)顯微鏡（LEICA，型號：DM300）。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備 參照文獻(xiàn)［20］建立大鼠MI模型。具體操作方法如下：用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠。術(shù)前行12 導(dǎo)聯(lián)心電圖。隨后，對大鼠進(jìn)行氣管插管，在胸骨左緣第三、四肋間剪開皮膚，然后用鑷子鈍性分離肌肉層，肋骨層，連接呼吸機(jī)，開胸，充分暴露手術(shù)視野。在心臟左心耳邊緣下2～3 mm 結(jié)扎左冠狀動脈前降支，術(shù)中見心前區(qū)結(jié)扎位點(diǎn)下心肌缺血變白，立即關(guān)胸，逐層縫合肋骨、肌肉、皮膚。假手術(shù)組只穿線但不接扎，作為平行對照。術(shù)后連續(xù)3 d 腹腔注射青霉素預(yù)防感染。

1.2.2分組及給藥 根據(jù)術(shù)后24 h 心電圖，選擇出現(xiàn)6～8 個病理性Q 波的大鼠入組。將大鼠按照病理性Q 波的個數(shù)隨機(jī)分到模型組、芪藶強(qiáng)心膠囊組、卡托普利組。假手術(shù)組作為正常對照組。術(shù)后第2天開始灌胃治療。芪藶強(qiáng)心膠囊組與卡托普利組按照文獻(xiàn)［21］進(jìn)行等效劑量換算，芪藶強(qiáng)心膠囊組劑量為0.32 g·kg-1·d-1，卡托普利組劑量為2.25 mg·kg-1·d-1，相當(dāng)于臨床成人用量的等效劑量。藥物與去離子水充分混合，連續(xù)灌胃給藥4 周。假手術(shù)組、模型組給予等體積去離子水10 mL·kg-1·d-1灌胃。治療結(jié)束假手術(shù)、模型組、卡托普利組各剩余10 只動物，芪藶強(qiáng)心膠囊組剩余8 只動物。

1.2.3 蘇木素伊紅（HE）染色 心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、修塊、石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟，梯度酒精水化等常規(guī)操作，隨后進(jìn)行HE 染色。蘇木素染色8～15 min，自來水沖洗多余染液。1%鹽酸酒精分化30 s，自來水充分洗滌10 min。1%伊紅溶液染色10 min，自來水沖洗1 min。隨后梯度酒精脫水、二甲苯透明，最后中性樹膠封片、晾干，于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4 Masson 染色 心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、修塊、石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟，梯度酒精水化等常規(guī)操作，溫?zé)崴? 次。隨后按照試劑盒說明書操作：細(xì)胞核染色60 s，沖洗液沖洗30 s，細(xì)胞漿染色60 s，沖洗液沖洗30 s，分色5～8 min、棄去分色液，隨后苯胺藍(lán)染色5～8 min，無水乙醇沖洗干凈，中性樹膠封片，晾干，于光學(xué)顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 分析膠原含量，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF），CVF=膠原面積/（心肌面積+膠原面積）×100%。

1.2.5 實(shí)時熒光PCR 采用Trizol 法提取心臟梗死邊緣區(qū)總RNA。紫外分光光度計(jì)測定吸光度OD260/OD280，計(jì)算樣本濃度。反轉(zhuǎn)錄嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。隨后通過Real-time PCR 檢測基因表達(dá)量，miR-133a 擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性94 ℃×10 min，變性94 ℃×15 s，退火60 ℃×60 s，延伸72 ℃×10 s，共循環(huán)45 次。TGF-β1、Smad2、Smad3、col-Ⅰ、col-Ⅲ擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性95 ℃×10 min，變性95 ℃×30 s，退火55 ℃×30 s，延伸72 ℃×20 s，共循環(huán)40 次。分別以U6，GAPDH 為內(nèi)參，采用2-△△CT法計(jì)算各組樣本miR-133a，TGF-β1、Smad2、Smad3、col-Ⅰ、col-Ⅲ mRNA 的 表 達(dá) 水 平。 引 物 序 列見表1。

表1 PCR 引物序列Tab 1 PCR primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。符合正態(tài)分布的變量采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的變量采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)Kruskal-Wallis，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪藶強(qiáng)心膠囊對各組大鼠心肌組織病理學(xué)的影響

假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，均勻紅染，間質(zhì)正常。與假手術(shù)組相比，模型組可見心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，部分細(xì)胞核丟失，梗死區(qū)可見肌纖維斷裂，肌間隙明顯增寬。與模型組相比，芪藶強(qiáng)心膠囊組和卡托普利組心肌組織形態(tài)均在一定程度上改善，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列相對規(guī)整，破壞減輕，肌間隙明顯縮小。見圖1。

2.2 芪藶強(qiáng)心膠囊對各組大鼠心肌組織纖維化的影響

假手術(shù)組心肌基本未見膠原纖維沉積；但與假手術(shù)組相比，模型組心肌膠原纖維沉積明顯增加，具有心肌纖維化的特點(diǎn)；與模型組相比，芪藶強(qiáng)心膠囊組和卡托普利組心肌膠原纖維沉積明顯降低，心肌纖維化得到明顯改善。見圖2。

與假手術(shù)組比較，模型組CVF 顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，芪藶強(qiáng)心膠囊組和卡托普利組CVF 均減小（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌組織CVF 結(jié)果（±s）Tab 2 CVF results of myocardial tissue in each group（±s）

表2 各組大鼠心肌組織CVF 結(jié)果（±s）Tab 2 CVF results of myocardial tissue in each group（±s）

注：CVF：膠原容積分?jǐn)?shù)；與假手術(shù)組相比，*P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

CVF(%)4.12±0.94 39.98±4.14*15.35±3.68#14.80±1.77#31.741 0.000組別假手術(shù)組模型組卡托普利組芪藶強(qiáng)心膠囊組n 10 10 10 8 HP

2.3 各組大鼠心肌組織col-Ⅰ、col-ⅢmRNA 表達(dá)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組col-Ⅰ、col-ⅢmRNA表達(dá)增加（P＜0.01）。與模型組比較，芪藶強(qiáng)心膠囊組和卡托普利組col-Ⅰ、col-ⅢmRNA 表達(dá)有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織col-Ⅰ、col-ⅢmRNA 表達(dá)結(jié)果（±s）Tab 3 Col-Ⅰ、col-ⅢmRNA expression in myocardial tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠心肌組織col-Ⅰ、col-ⅢmRNA 表達(dá)結(jié)果（±s）Tab 3 Col-Ⅰ、col-ⅢmRNA expression in myocardial tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組卡托普利組芪藶強(qiáng)心膠囊組col-Ⅲ1.04±0.33 4.23±2.61*2.10±0.85 2.04±0.98 20.775 0.000 n 10 10 10 8 HP col-Ⅰ1.10±0.46 3.81±1.59*2.02±1.10 2.59±1.22 19.904 0.000

2.4 各 組 大 鼠 心 肌 組 織miR-133a，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組miR-133a 表達(dá)減少，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)增加（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，芪藶強(qiáng)心膠囊組和卡托 普 利 組miR-133a 表 達(dá) 增 加，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表 達(dá) 減 少（P＜0.05 或P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠心肌組織miR-133a，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)結(jié)果（±s）Tab 4 miR-133a，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA expression in myocardial tissue of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠心肌組織miR-133a，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)結(jié)果（±s）Tab 4 miR-133a，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA expression in myocardial tissue of rats in each group（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

Smad3 mRNA 1.03±0.24 1.39±0.49*0.87±0.26##0.78±0.20##6.362 0.002組別假手術(shù)組模型組卡托普利組芪藶強(qiáng)心膠囊組n 10 10 10 8 FP miR-133a 1.04±0.32 0.39±0.17**0.67±0.24#0.73±0.13##13.063 0.000 TGF-β1 mRNA 1.13±0.52 2.00±0.52**1.12±0.47##1.14±0.31##8.578 0.000 Smad2 mRNA 1.03±0.26 1.43±0.21**1.07±0.35##0.97±0.18##5.999 0.002

3 討論

MI 是不良的心血管事件，其病理變化往往伴隨心室重構(gòu)，影響心臟正常舒縮功能，最終發(fā)展為心力衰竭。這也是MI 住院率和死亡率居高不下的主要原因［22，23］。在MI 早期，瘢痕形成對保留梗死心室壁結(jié)構(gòu)完整性具有重要意義，但是，持續(xù)過度的纖維化則導(dǎo)致心功能障礙［14］。因此，改善MI 后組織纖維化對于提高心功能，防止心梗后心衰意義重大。

芪藶強(qiáng)心膠囊，是經(jīng)過多中心、大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)的治療慢性心力衰竭的中成藥［24］。研究表明，其在調(diào)節(jié)心肌纖維化，改善MI 后心衰中展現(xiàn)出明 顯 療 效［25，26］。但 其 基 因 調(diào) 控 機(jī) 制 仍 有 待 深 入研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MI 模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大，局部斷裂，細(xì)胞間質(zhì)可見大面積膠原增生；與假手術(shù)組比較，CVF 以及col-Ⅰ、col-ⅢmRNA 表達(dá)顯著增加，表明模型組大鼠心臟發(fā)生了明顯的纖維化改變。經(jīng)芪藶強(qiáng)心膠囊治療4 周后，心肌纖維化得到明顯改善，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列相對規(guī)整，細(xì)胞間隙縮小，CVF 顯著下降。而col-Ⅰ、col-ⅢmRNA表達(dá)在芪藶強(qiáng)心膠囊組僅有下降趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心膠囊對膠原基因的抑制作用可隨著治療時間的增加而加強(qiáng)，如：Wang 等［27］報(bào)道芪藶強(qiáng)心膠囊治療自發(fā)性高血壓大鼠1 年，可以明顯降低心肌組織col-Ⅰ、col-ⅢmRNA 的表達(dá)，這為芪藶強(qiáng)心膠囊防治心肌纖維化的中長期應(yīng)用提供了參考。

為揭示芪藶強(qiáng)心膠囊改善心肌纖維化的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步觀察了纖維化通路miR-133a/TGF-β1/Smads 的基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示，MI 模型 組 大 鼠miR-133a 表 達(dá) 降 低，TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA 表達(dá)水平顯著提高，證實(shí)了MI 后心肌纖維化的發(fā)生與miR-133a/TGF-β1/Smads 通路的激活有關(guān)。miR-133a 是最豐富的心臟特異性miRNA 之一，參與MI 早期病理以及隨后的心室重構(gòu)，過表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞肥大減少膠原沉積［28，29］。其下游靶基因TGF-β1，是纖維化的關(guān)鍵增殖因子，TGF-β1 通 過 與 其 受 體 結(jié) 合 激 活Smad2、Smad3 轉(zhuǎn)錄因子，激活的Smads 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核調(diào)控促纖維基因如col-Ⅰ、col-Ⅲ合成［30，31］。Smad3 還可以直 接與基因啟動子內(nèi)的Smad 結(jié)合元件結(jié)合，從而增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄，在纖維化信號傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，MI 模型組大鼠心臟miR-133a 表達(dá)下調(diào)，這似乎導(dǎo)致其對下游促纖維化因子TGF-β1 抑制作用降低，繼而激活Smad2、3 導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生。經(jīng)芪藶強(qiáng)心膠囊治療4 周后，心臟miR-133a 表達(dá)明顯升高，恢復(fù)對TGF-β1 的抑制作用，導(dǎo)致TGF-β1、Smad2、3 mRNA 表達(dá)明顯降低，這可能是其改善心肌組織纖維化的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究表明芪藶強(qiáng)心膠囊在一定程度上改善MI 大鼠心肌纖維化，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)miR-133a/TGF-β1/Smad2、3 信號通路基因表達(dá)有關(guān)。本研究僅在基因水平初步探討了芪藶強(qiáng)心膠囊對MI 大鼠心肌纖維化的調(diào)控作用，接下來將從蛋白層面繼續(xù)研究，并開展細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說明：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為吳愛明、趙明鏡，動物造模以及實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)為婁麗霞、聶波、趙久麗，給藥干預(yù)、實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測為紀(jì)曉迪、呂夢、楊丁，文章執(zhí)筆為紀(jì)曉迪。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。