陳曉雨,張燁華,陸金苗,朱詩蘭,藺智兵,米榮升,龔海燕,黃 燕,陳兆國,李國清

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種重要的人獸共患病原體,可以感染幾乎所有溫血?jiǎng)游?包括哺乳動(dòng)物和鳥類)[1]。人和動(dòng)物主要通過攝入被貓糞污染的土壤、飲水中的卵囊,或攝入未煮熟的肉類中含有的包囊而感染,感染后可引起腦炎患者或免疫功能低下者的全身性癥狀,如果不加以治療通常會(huì)致死[2]。此外,弓形蟲感染還可引起反應(yīng)遲鈍、精神分裂、情緒失控等精神性問題[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),1990—2018年全球豬弓形蟲血清陽性率約為19%,非洲最高(25%),歐洲最低(13%),亞洲約為21%[5]。我國人弓形蟲的感染率約為7.9%,以隱性感染為主[6]。據(jù)報(bào)道,世界上約1/3人口呈弓形蟲血清陽性[7],造成大面積感染的原因究竟何在,故開展豬肉中弓形蟲攜帶情況的調(diào)查非常必要。

目前弓形蟲感染的檢測(cè)方法很多,其中以血清學(xué)試驗(yàn)[7-8]和分子檢測(cè)方法[9]多見。此外,還可采用動(dòng)物接種、組織培養(yǎng)和染色鏡檢[10]等方法。上述方法中血清學(xué)試驗(yàn)的重復(fù)性和靈敏度較差,易出現(xiàn)交叉反應(yīng);常規(guī)PCR及巢式PCR不能對(duì)樣品進(jìn)行定量分析,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法既可定性又可定量檢查,并且特異性強(qiáng)、敏感性高,能檢出低拷貝樣本[11]。畜禽田間樣品中弓形蟲的含量通常比較低[12]。因此,qPCR方法非常適合對(duì)豬肉樣本進(jìn)行弓形蟲檢測(cè)。

豬肉是人類重要的肉類攝入來源,攝入攜帶弓形蟲的豬肉是人類感染弓形蟲的一個(gè)重要途徑。在世界范圍內(nèi)已報(bào)道許多起因食用豬肉而感染弓形蟲的病例[13-14]。同時(shí),養(yǎng)豬場(chǎng)也不時(shí)報(bào)道暴發(fā)弓形蟲病,給豬場(chǎng)造成嚴(yán)重?fù)p失[15]。近年來,豬肉中弓形蟲的攜帶問題已引起人們關(guān)注。為了調(diào)查近年來上海市和廣東地區(qū)豬肉樣品中弓形蟲的攜帶情況并分析其流行因素,本研究采用qPCR方法對(duì)上海和廣東兩地屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)豬肉樣品進(jìn)行檢測(cè)與分析,以便為人類和豬的弓形蟲病防控提供新的資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 弓形蟲DNA 弓形蟲速殖子基因組DNA由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動(dòng)物源性病原生物學(xué)及食品安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.1.2 主要試劑 血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司,p MD-19T載體、Premix Ex Taq酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司,瓊脂糖購自翊圣生物科技公司,大腸桿菌DH 5α購自北京擎科生物科技有限公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集 本研究從上海市5區(qū)(嘉定、浦東、閔行、松江和奉賢),以及廣東省4市(廣州、惠州、佛山和深圳)的屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)采集豬的肌肉組織樣本,每個(gè)屠宰場(chǎng)采集30份膈肌樣本,每個(gè)菜市場(chǎng)(超市)采集3份腿肌樣本,共1450份。每個(gè)樣本約50 g,標(biāo)記采樣地區(qū)、屠宰場(chǎng)或菜市場(chǎng)(超市)名稱、時(shí)間等信息。將樣本單獨(dú)放在塑料袋中,置于冷凍箱盡快運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室,4℃冰箱保存,2 d內(nèi)處理完畢。

1.2.2 樣品前處理 每份樣品取3～5 g肌肉,用無菌剪刀將其剪碎,置于15 m L離心管中,離心管中裝入無菌鋼珠和5 m L PBS緩沖液。采用FastPrep組織快速破碎儀破碎,速度設(shè)置為6.0 m/s,持續(xù)40 s。取300μL勻漿提取基因組DNA。

1.2.3 基因組DNA提取 采用基因組DNA提取試劑盒提取豬肉組織的基因組DNA。取樣品勻漿進(jìn)行10000×g離心5 min,隨后用蛋白酶K 56℃消化過夜,按照試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的DNA樣品置于—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 弓形蟲529 bp重復(fù)序列(repetitive 529 bp fragment,rep529)重組質(zhì)粒的制備 采用本實(shí)驗(yàn)室建立的巢式PCR方法擴(kuò)增弓形蟲rep529基因。使用DNA純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化后的PCR產(chǎn)物亞克隆到p MD-19T載體中,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH 5α中,用巢式PCR內(nèi)引物篩選陽性重組質(zhì)粒,送至生工生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的陽性質(zhì)粒保存在—20℃冰箱。

1.2.5 qPCR檢測(cè) 以rep529為靶基因,參考藺智兵等[16]方法建立qPCR方法。正向引物和反向引物 分 別 為P1(5′-GCT CGC CTG TGC TTG GAG-3′)和P2(5′-ATC TTC TCC CTC TCC GAC TCT C-3′),探針為P3(FAM-TCG CTT CCC AAC CAC GCC ACC C-BHQ1),引物和探針均由上海擎科生物科技有限公司合成?？偡磻?yīng)體積為20μL,包括10μL Premix Ex Taq(2×Conc)、0.8μL(10 μmol/L)正 向 和 反 向 引 物、0.2 μL探 針、0.2μL ROX Reference Dye、2 μL DNA模 板,最 后 用dd H2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s,95℃變性15 s,60℃退火30 s,45個(gè)循環(huán)。將1×1010copy/μL重組質(zhì)粒DNA 10倍倍比稀釋,采用上述反應(yīng)條件,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,檢測(cè)其敏感性;以日本血吸蟲、新孢子蟲、巴貝斯蟲、賈第蟲、隱孢子蟲和弓形蟲DNA作為模板,檢測(cè)其特異性。

1.2.6 巢式PCR檢測(cè) 采用本實(shí)驗(yàn)室建立的巢式PCR檢測(cè)方法[17],擴(kuò)增豬肉樣本中弓形蟲ITS靶序列。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析上海和廣東地區(qū)豬肉中弓形蟲攜帶情況。采用卡方(χ2)檢驗(yàn)評(píng)估各種因素對(duì)弓形蟲感染的影響,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。利用在線網(wǎng)站(http://www.vassarstats.net/)計(jì)算檢測(cè)結(jié)果的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 弓形蟲qPCR檢測(cè)方法的建立 以弓形蟲DNA為模板,采用PCR技術(shù)擴(kuò)增rep529序列,連接至p MD19-T載體,構(gòu)建含有rep529序列片段的重組質(zhì)粒,測(cè)序結(jié)果表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍倍比稀釋,共設(shè)6個(gè)梯度,每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù),根據(jù)qPCR擴(kuò)增結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1),結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值為0.9989,敏感性可達(dá)到1×102copies/μL。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明qPCR僅擴(kuò)增弓形蟲DNA(圖2)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of real-time PCR

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specific detection with Real-time PCR

2.2 不同地區(qū)、不同年份豬肉樣品中弓形蟲攜帶情況 qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,在1450份豬肉樣品中檢出59份弓形蟲陽性,檢出率4.07%。其中,上海地區(qū)豬肉樣本弓形蟲的檢出率為6.32%(50/791),廣東為1.37%(9/659),上海地區(qū)的檢出率顯著高于廣東(χ2＝20.95,P＜0.01)。不同年份中,以2018年的檢出率最高,為9.29%;2019年未見陽性樣品,2020年檢出率為0.61%,不同年份之間檢出率差異顯著(表1)。

表1 不同年份豬肉中弓形蟲攜帶情況Tab.1 Prevalence of T.gondii infection in pork by year

2.3 不同來源豬肉樣品中弓形蟲攜帶情況 檢測(cè)結(jié)果顯示,屠宰場(chǎng)豬肉的檢出率為3.85%(35/908),其中上海地區(qū)為6.10%(30/492),廣東地區(qū)為1.20%(5/416);市場(chǎng)豬肉的檢出率為4.43%(24/542),其中上海地區(qū)為6.69%(20/299),廣東地區(qū)為1.65%(4/243),不同來源豬肉間陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.26,P＞0.05)(表2)。

表2 不同來源豬肉中弓形蟲攜帶情況Tab.2 T.gondii infection in pork by source

2.4 不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較 采用套式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別對(duì)上海和廣東采集的884份豬肉樣本進(jìn)行弓形蟲檢測(cè),套式PCR檢出率為3.17%(28/884),qPCR檢 出 率 為6.33%(56/884),2種方法檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝8.91,P＜0.05)(表3)。

表3 不同檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果比較Tab.3 Comparison of detection results of two methods

2.5 陽性樣品qPCR擴(kuò)增的Ct值 本次qPCR擴(kuò)增的陽性樣品中,Ct值大于35的占71.19%,屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)分別 為77.14%和62.50;Ct值 在15～35的占16.95%,屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)分別為17.14%和16.67%;Ct值小于15的占11.86%,屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)分別為5.71%和20.83%(表4)。

表4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)豬肉樣品DNA數(shù)據(jù)Tab.4 DNA data for pork samples detected with real-time PCR

3 討論

弓形蟲病是一種由剛地弓形蟲速殖子、包囊和卵囊被人和動(dòng)物吞食后所引起的人獸共患病,豬肉中弓形蟲速殖子和包囊是重要的感染性階段。本研究采用qPCR技術(shù)檢測(cè)來自上海和廣東兩個(gè)地區(qū)2018－2020年的豬肉樣品,比較不同地區(qū)豬肉中弓形蟲的攜帶情況。結(jié)果顯示,兩地豬肉弓形蟲檢出率為4.07%,上海和廣東地區(qū)豬肉樣本弓形蟲的檢出率分別為6.32%和1.37%,上海的檢出率顯著高于廣東(χ2＝20.95,P＜0.01)。不同年份中以2018年的檢出率最高(9.29%),與2019(0%)和2020年(0.61%)相比差異顯著。比較而言,上海地區(qū)的檢出率(6.32%)低于Zhang Y等[17]使用巢式PCR對(duì)上海地區(qū)2016—2018年豬肉弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果(8.3%),豬肉中弓形蟲感染呈下降趨勢(shì)。其原因可能與非洲豬瘟的控制有關(guān)。自2018年8月以來由于我國暴發(fā)非洲豬瘟,各大養(yǎng)殖場(chǎng)相應(yīng)加強(qiáng)了豬場(chǎng)的生物安全措施[18-19],這些措施在控制非洲豬瘟的同時(shí)加強(qiáng)了養(yǎng)豬場(chǎng)的生物安全管理[20],降低了弓形蟲感染的可能性[21]。

檢測(cè)方法不同直接會(huì)影響弓形蟲的檢出率,尤其是在蟲荷比較低的情況下。本研究對(duì)采集的884份豬肉樣品同時(shí)進(jìn)行巢式PCR和qPCR檢測(cè),結(jié)果顯示巢式PCR對(duì)豬肉弓形蟲的檢出率為3.17%,而采用qPCR方法對(duì)相同樣品的檢出率為6.33%,2種方法的檢測(cè)結(jié)果差異顯著(P＜0.05)。此外,本次檢出的陽性樣本Ct值大于35的占71.19%,多數(shù)屬于低感染狀態(tài)。由此說明qPCR方法對(duì)低蟲荷樣本的檢測(cè)效果比巢式PCR好。不過這僅是分子檢測(cè)方法之間的比較,并未涉及與血清學(xué)方法如IFAT和MAT[22-24]之間的比較。本次檢出的陽性樣品中Ct值小于15的占11.86%,其中屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)分別為5.71%和20.83%,差異顯著。這可能是由于采樣部位的不同,在屠宰場(chǎng)采集的是膈肌樣品,而在菜市場(chǎng)采集的是腿肌樣本。此外,市場(chǎng)上采集的豬肉樣本還有可能在分割、運(yùn)輸、銷售等環(huán)節(jié)受到弓形蟲不同發(fā)育階段(如速殖子和卵囊)的污染。綜上所述,不同地區(qū)、不同年份、采樣部位不同,以及在流行病學(xué)調(diào)查中采取的檢測(cè)方法不同都會(huì)影響其調(diào)查的結(jié)果。但據(jù)以往流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,與豬的弓形蟲感染最密切相關(guān)的因素是豬場(chǎng)的綜合控制管理[25]。因此,預(yù)防弓形蟲的感染首先要做好生物安全工作,這是保證豬場(chǎng)安全生產(chǎn)的重中之重。

本研究對(duì)2018—2020年上海和廣東屠宰場(chǎng)和市場(chǎng)豬肉樣品中弓形蟲攜帶情況進(jìn)行了分子流行病學(xué)調(diào)查,檢出率(4.07%)比2016—2018年采用類似方法調(diào)查的結(jié)果稍低;2019年以來豬肉中弓形蟲檢出率顯著下降,提示加強(qiáng)生物安全管理對(duì)于減少豬的弓形蟲感染、提高豬肉產(chǎn)品質(zhì)量與安全具有重要意義。

利益沖突:無

引用本文格式:陳曉雨,張燁華,陸金苗,等.上海和廣東豬肉中弓形蟲感染的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2022,38(10):931-935.DOI:10.3969/j.issn.1002－2694.2022.00.132