付佳，朱敏，王亞楠，2＊，石碧，2

（1.四川大學(xué)制革清潔技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，四川成都610065；2.四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都610065）

設(shè)計(jì)開發(fā)有

良好鞣制性能的無鉻鞣劑，制造無鉻生態(tài)皮革，從源頭消除鉻污染，是當(dāng)前皮革行業(yè)的重大需求[1-3]。目前，醛鞣劑如改性戊二醛、噁唑烷、有機(jī)膦鹽等，由于鞣制性能較優(yōu)，已在一定范圍內(nèi)替代部分鉻鞣劑使用[4]。但上述鞣劑在使用時(shí)會(huì)釋放有毒物質(zhì)——甲醛[5]，因此，有必要繼續(xù)研發(fā)無甲醛的環(huán)保型醛鞣劑。

海藻酸鈉作為一種天然多糖，經(jīng)由高碘酸鈉氧化可制得氧化海藻酸鈉（OSA）[6-8]。前期研究表明，OSA結(jié)構(gòu)中富含的醛基可與皮膠原氨基共價(jià)交聯(lián)，形成席夫堿結(jié)構(gòu)，能夠作為皮革鞣劑使用[9]。同時(shí)，由于OSA糖單元結(jié)構(gòu)的C6均為羧基，其在高碘酸鈉氧化過程中不會(huì)產(chǎn)生甲醛[10]，是環(huán)保型醛鞣劑的理想候選之一。OSA的醛基含量、相對(duì)分子質(zhì)量及分布、聚集狀態(tài)等結(jié)構(gòu)因素均可能通過改變其在皮革多層級(jí)結(jié)構(gòu)中的傳質(zhì)行為，最終影響OSA的鞣制效果[11-12]。但是，OSA的結(jié)構(gòu)與其傳質(zhì)特性及鞣制性能之間的關(guān)系，仍有待研究闡釋。

建立合適的測試方法是研究化學(xué)品在皮革中傳質(zhì)行為的前提。對(duì)于金屬鞣劑（如鉻、鋁、鋯鞣劑等），可以用X射線能譜儀（EDS）研究其在皮革中的滲透和分布[13-14]。而對(duì)于酶制劑、丙烯酸復(fù)鞣劑和氨基樹脂復(fù)鞣劑等有機(jī)化學(xué)品，也有研究用熒光素對(duì)其進(jìn)行熒光標(biāo)記和示蹤[15-17]。因此，對(duì)于OSA這類有機(jī)鞣劑，也可以采用這種熒光示蹤技術(shù)來研究其在皮革中的傳質(zhì)和分布情況。N-甲基靛紅酸酐（MIA）是一種具有紫外及熒光特性的小分子標(biāo)記物。它能夠與羥基發(fā)生反應(yīng)，用于多糖、RNA的熒光標(biāo)記[18-21]。本研究擬用熒光素MIA對(duì)OSA（同樣富含羥基）進(jìn)行標(biāo)記，再用標(biāo)記產(chǎn)物對(duì)牛皮進(jìn)行鞣制，進(jìn)而完成其在皮革中傳質(zhì)行為的熒光可視化，以期為OSA鞣劑的分子設(shè)計(jì)、制備與應(yīng)用提供理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

MIA，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖凝膠G25（fine），Sigma-aldrich公司；PEG-20000，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；海藻酸鈉，氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉，碳酸氫鈉，正丙醇，乙醇，白凡士林，分析純，成都科龍化工試劑廠；氧化海藻酸鈉，按文獻(xiàn)方法，用高碘酸鈉氧化法制得[11]；浸酸牛皮，購自山東某制革廠。

BSZ-100自動(dòng)組分收集器、HL-2恒流泵，上海滬西儀器分析廠有限公司；UV-1800BPC紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)公司；F-7100熒光光譜儀，日立公司；LGJ-30F真空冷凍干燥機(jī)，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜儀，Agilent公司；TCLP翻轉(zhuǎn)振蕩器，科博實(shí)驗(yàn)設(shè)備研究所；CM1950冷凍切片機(jī)、DMi8倒置熒光顯微鏡，STELLARIS 5激光掃描共聚焦顯微鏡，Leica公司。

1.2 MIA標(biāo)記OSA的制備

圖1為MIA標(biāo)記OSA的反應(yīng)原理，通過OSA的羥基（電負(fù)性較高）對(duì)MIA苯并噁嗪環(huán)4位位置上羰基（據(jù)共軛效應(yīng)與誘導(dǎo)效應(yīng)判斷，該位置的碳正離子電正性強(qiáng)）的攻擊，使碳氧單鍵和碳氮單鍵斷裂而生成產(chǎn)物，且伴隨著二氧化碳的損失[20-21]。

圖1 MIA熒光標(biāo)記OSA鞣劑的反應(yīng)原理Fig.1 Reaction mechanism of OSA tanning agent labeled by MIA fluorescence

參考涂宗財(cái)?shù)热薣22]的方法，用MIA對(duì)OSA進(jìn)行標(biāo)記。用9.5 mL二次水溶解0.4 g OSA，再用0.5 mL DMSO溶解8~20 mg MIA，將這2種溶液混合，在35℃反應(yīng)2 h，得到MIA-OSA粗品。

用PEG-20000包埋法將MIA-OSA粗品濃縮至3 mL左右。濃縮液通過0.45 μm針頭過濾器過濾后進(jìn)行凝膠色譜分離。色譜分離條件為：柱填料為G25葡聚糖凝膠，流動(dòng)相為二次水，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為0.5 mL。用自動(dòng)組分收集器對(duì)洗脫液進(jìn)行收集，每組分為3 mL，用紫外可見分光光度計(jì)在360 nm（MIA的最大吸收波長）處測定各組分的吸光度。收集到高純度MIA標(biāo)記的OSA組分，將其冷凍干燥后獲得MIA-OSA，于-80℃避光保存。

1.3 MIA-OSA的性質(zhì)表征

1.3.1 薄層色譜分析

取市售薄層色譜板（TLC板）在110℃活化0.5 h，置于干燥器備用。將展開劑（V正丙醇∶V水∶V甲醇=3∶1∶0.5）放在層析缸中，蓋上缸蓋，讓缸內(nèi)蒸汽飽和5~10 min。取MIA-OSA粗品溶液與MIA溶液（對(duì)照），分別點(diǎn)0.2 μL于TLC板距邊緣7 mm處，將其樣點(diǎn)一端朝下放入缸內(nèi)，浸入深度距底邊0.5~1 mm，蓋好缸蓋，待展距在7~17 cm范圍時(shí)，取出、放平并標(biāo)明溶劑前沿位置，干燥后用紫外燈（激發(fā)波長為365 nm）照亮展開完成的TLC板并拍照記錄。

1.3.2 熒光光譜分析

用熒光光譜儀測定了MIA（50 mg/L）、MIA-OSA（200 mg/L）和OSA（50 mg/L）的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為MIA的最大激發(fā)波長360 nm。為了研究MIA-OSA的熒光穩(wěn)定性，在31天內(nèi)連續(xù)監(jiān)測其熒光發(fā)射光譜。

1.3.3 pH對(duì)MIA-OSA熒光強(qiáng)度的影響

取純化后收集的MIA標(biāo)記OSA溶液，用氫氧化鈉和鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH分別為3、4、5、6、7、8和9，并保證樣品溶液濃度相同，用熒光光譜儀在相同參數(shù)下分別測定溶液的熒光發(fā)射光譜。

1.3.4 相對(duì)分子質(zhì)量測定

用尺寸排阻色譜法測定OSA與MIA-OSA的重均相對(duì)分子質(zhì)量（Mw）及多分散系數(shù)（PDI）。配制質(zhì)量濃度為3~5 mg/mL的樣品溶液，用0.45 μm水系濾頭過濾后，按以下條件進(jìn)行分析：流動(dòng)相為0.1 mol/L的NaNO3，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣體積為100 μL，色譜柱為TSK-gel GMPWXL（7.8 mm×300 mm），柱 溫 為30℃。用 普 魯 蘭 多 糖 標(biāo) 樣（180~600000 Da）校準(zhǔn)[10,23]。使用OmniSEC 4.7軟件計(jì)算得到Mw和PDI。

1.4 觀察與測定鞣制過程中MIA-OSA的傳質(zhì)行為

取多塊相鄰對(duì)稱部位的浸酸牛皮（每塊1.0 g左右），質(zhì)量增加200%作為化料用量基準(zhǔn)，按照表1進(jìn)行鞣制實(shí)驗(yàn)。在鞣制過程的多個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)取樣，用冷凍切片機(jī)切取厚度為20 μm的縱切面組織切片，然后用熒光顯微鏡觀察，得到顯微照片，經(jīng)Image J軟件分析處理得到各鞣制階段的熒光強(qiáng)度圖，以確定MIA-OSA在皮革中的相對(duì)含量分布。選擇鞣制時(shí)間為2 h的組織切片，用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，得到一系列高分辨率的熒光及明場圖片。

表1 OSA鞣制工藝Tab.1 OSA tanning process

2 結(jié)果與討論

2.1 MIA-OSA的性質(zhì)

本研究目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)OSA鞣劑在皮革中的傳質(zhì)行為可視化。為此需要保證MIA-OSA中不含游離的MIA，以免影響鞣劑在皮革中的熒光示蹤[24]。首先用薄層色譜法進(jìn)行定性分析。由圖2可知，MIA-OSA粗品中，除了MIA標(biāo)記OSA組分留在原點(diǎn)，還出現(xiàn)了游離MIA，說明粗品中還存在未反應(yīng)的MIA，標(biāo)記反應(yīng)并不完全，后續(xù)須進(jìn)行分離純化處理。

圖2 MIA（左）與MIA-OSA粗品（右）的薄層色譜圖Fig.2 TLC of MIA(left)and crude MIA-OSA(right)

隨后用凝膠色譜法對(duì)MIA-OSA進(jìn)行純化，除去未反應(yīng)的MIA。圖3為MIA-OSA的洗脫曲線，結(jié)果表明MIA-OSA與游離的MIA成功分離，獲得了高純度的MIA-OSA。用熒光光譜法對(duì)MIA、OSA和MIA-OSA進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖4。MIA和MIA-OSA均有明顯的發(fā)射峰，而OSA無明顯熒光，表明MIA成功接枝到OSA上，為MIA-OSA的熒光示蹤提供了條件。

圖3 MIA-OSA的洗脫曲線Fig.3 Elution curve of MIA-OSA

圖4 MIA、OSA和MIA-OSA的熒光發(fā)射光譜Fig.4 Fluorescence emission spectra of MIA,OSA and MIA-OSA

進(jìn)一步考察了存放時(shí)間和pH對(duì)MIA-OSA熒光強(qiáng)度的影響。如圖5（a）所示，存放1個(gè)月期間，MIA-OSA的熒光穩(wěn)定性較好，發(fā)射峰位置沒有變化，峰值強(qiáng)度在2250~3250區(qū)間上下波動(dòng)。由圖5（b）可知，pH對(duì)MIA-OSA熒光強(qiáng)度的影響規(guī)律為，pH為7和8時(shí)的熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，pH低于7時(shí)，熒光強(qiáng)度隨pH降低而減小，故選擇pH=7.5作為MIA-OSA鞣制的pH，以便對(duì)其在皮革中的傳質(zhì)行為進(jìn)行觀測。

圖5 存放時(shí)間（a）和pH（b）對(duì)MIA-OSA熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effects of storage time(a)and pH(b)on the fluorescence intensity of MIA-OSA

相對(duì)分子質(zhì)量是影響化學(xué)品在皮革中滲透速度和傳質(zhì)程度的重要因素之一[15-16]。因此，研究了MIA標(biāo)記對(duì)OSA相對(duì)分子質(zhì)量的影響，結(jié)果見圖6。標(biāo)記前OSA的Mw為7.31×104，PDI為2.25，標(biāo)記后Mw為6.29×104，PDI為2.19，其相對(duì)分子質(zhì)量及分布相似。MIA-OSA的相對(duì)分子質(zhì)量略低于OSA，這可能是因?yàn)橹鶎游鰧?dǎo)致了少量高相對(duì)分子質(zhì)量OSA組分的損失。Ding等人用分級(jí)醇沉的方法得到了OSA的不同相對(duì)分子質(zhì)量組分，證實(shí)高相對(duì)分子質(zhì)量組分具有更好的填充性能，低相對(duì)分子質(zhì)量組分具有更好的交聯(lián)鞣制性能[25]。與該文獻(xiàn)對(duì)比可知，本研究制備的MIA-OSA具有合理的相對(duì)分子質(zhì)量，能夠起到良好的鞣制作用。

圖6 OSA（a）與MIA-OSA（b）的相對(duì)分子質(zhì)量及分布Fig.6 Molecular weight and distribution of OSA(a)and MIA-OSA(b)

2.2 MIA-OSA在皮革中的傳質(zhì)

鞣制過程中MIA-OSA在皮革中的傳質(zhì)行為如圖7所示。從皮革縱切面的熒光顯微照片（圖7a）可以看到，隨著時(shí)間的推移，MIA-OSA由皮革兩面向中間逐漸滲透，到1.5~2 h滲透完全。MIA-OSA在皮革縱切面上的相對(duì)含量分布（圖7b）同樣表明，滲透2 h和4 h時(shí)MIA-OSA的相對(duì)含量分布均較均勻，且變化不大。進(jìn)一步用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了鞣制2 h的組織切片，獲得了不同放大倍數(shù)的高分辨顯微照片（圖8），能夠展示從纖維網(wǎng)絡(luò)到纖維束層級(jí)（Φ 20~200 μm），再到纖維層級(jí)（Φ 2~10 μm）的MIA-OSA分布情況。在纖維束層級(jí)，MIA-OSA熒光強(qiáng)度較高，且分布均勻。但在纖維層級(jí)，熒光十分微弱甚至不再顯現(xiàn)。其原因可能是放大倍數(shù)增大，視野內(nèi)存在的熒光物質(zhì)減少的原因，也可能是能傳遞至該層級(jí)的MIA-OSA很少，有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。總的來說，結(jié)合熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡觀測手段，能夠?qū)崿F(xiàn)MIA-OSA在皮革多層級(jí)中滲透與傳質(zhì)的可視化。

圖7 鞣制過程中皮革縱切面的熒光顯微鏡照片及MIA-OSA的相對(duì)含量Fig.7 Fluorescence micrographs of cross-section of leather and relative content of MIA-OSA during tanning

圖8 MIA-OSA鞣制2 h后皮革的激光掃描共聚焦顯微照片（第一行：熒光圖像；第二行：明場圖像）Fig.8 Confocal laser scanning micrographs of leather tanned with MIA-OSA for 2 h(Top,fluorescence images;bottom,bright-field images)

3 結(jié)論

氧化海藻酸鈉鞣劑OSA可被熒光素MIA成功標(biāo)記，并通過柱層析獲得了高純度的MIA-OSA。該產(chǎn)物在較長時(shí)間（1個(gè)月）和pH 7~8時(shí)具有較高的熒光強(qiáng)度，且相對(duì)分子質(zhì)量及分布與標(biāo)記前相似。將MIA-OSA用于鞣制，實(shí)現(xiàn)了鞣制過程中OSA在皮革多層級(jí)結(jié)構(gòu)中的傳質(zhì)行為觀測，MIA-OSA在鞣制1.5~2 h后可在皮革縱切面中滲透完全。該熒光示蹤技術(shù)的建立有望為新型生物質(zhì)鞣劑的設(shè)計(jì)與應(yīng)用提供理論參考。