于 瀾， 徐纓龍， 李 明， 肖渝清

成都市第三人民醫(yī)院肝膽外科，四川 成都 610031

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第五大常見的惡性腫瘤，近幾十年來發(fā)病率不斷上升，其死亡率位居惡性腫瘤第三位[1]。隨著醫(yī)療水平的進步，HCC患者預后得到了一定程度的改善，目前根治性手術切除是治療HCC的主要方式，但術后易發(fā)生復發(fā)轉移，導致多數(shù)患者預后不佳，因此，探究影響HCC患者復發(fā)轉移的因子意義重大[2]。Trophinin相關蛋白(Trophinin-associated protein，TROAP)最初于胚胎滋養(yǎng)層細胞中分離，其可在早期胚胎植入中發(fā)揮作用，并伴隨快速的細胞侵襲和增殖[3]。TROAP不僅與胚胎植入有關，還可在細胞有絲分裂期間參與調節(jié)紡錘體的形成，TROAP過表達導致單極紡錘體形成，其表達下降可導致有絲分裂阻滯并誘導多極紡錘體的形成[4]。近來研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，TROAP在人類癌細胞系中高度表達，但關于TROAP在癌癥發(fā)展中的作用研究較少。Jiao等[5]研究發(fā)現(xiàn)，TROAP在肝癌組織中過度表達，其高表達患者中位總生存期較低表達患者短，TROAP可作為預測肝癌患者總生存期的獨立變量。此外，TROAP可促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移[6]，但TROAP在HCC上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中作用尚不明確。本研究通過檢測TROAP及EMT相關蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin，CDH1)、波形蛋白在HCC組織及癌旁組織中的表達，初步探討TROAP與HCC患者EMT、臨床病理特征的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年1月至2016年2月在成都市第三人民醫(yī)院行根治性肝癌切除術的97例HCC患者，男75例，女22例，年齡(53.18±12.46)歲(36～78歲)，收集所有患者的HCC組織及相應的癌旁組織(距癌組織4 cm以上)。納入標準：(1)病理檢查確認為HCC；(2)術前無介入治療、放化療史；(3)患者或家屬知情同意。排除標準：(1)術后出現(xiàn)膽漏、肝功能衰竭、大出血等嚴重并發(fā)癥者；(2)合并精神疾病者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)臨床資料不齊全者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批同意(批號：20131205)。

1.2 主要試劑兔抗人TROAP單克隆抗體(貨號：H00010024-K)，購自亞諾法生技股份有限公司(Abnova)；鼠抗人FZR1/CDH1單克隆抗體(貨號：H00051343-M02)，購自美國Novus Biologicals公司；鼠抗人波形蛋白(Vimentin)單克隆抗體(貨號：ANT-246)，購自艾美捷科技有限公司；抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(貨號：KIHC-1)，購自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集：在肝癌根治性切除術中，收集患者的新鮮HCC組織及癌旁組織(距癌組織4 cm以上)，制備成石蠟切片(4 μm)備用。

1.3.2 免疫組化法檢測HCC組織及癌旁組織中TROAP、CDH1及波形蛋白表達：石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后，于3% H2O2中滅活內源性過氧化物酶，并用微波爐修復抗原。滴加一抗(TROAP、CDH1、波形蛋白單克隆抗體)50 μl至切片上，4 ℃孵育過夜，滴加二抗37 ℃孵育30 min，經(jīng)DAB顯色、復染后，酒精梯度脫水干燥、二甲苯透明、封片，于鏡下觀察結果。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.3 結果評定：每張切片在顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡(放大400倍)視野，每個視野計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)。細胞膜或細胞質存在棕黃色顆粒記為陽性細胞，其中波形蛋白、TROAP著色于細胞質，CDH1著色于細胞膜。著色強度為0、1、2、3分，分別對應無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色；根據(jù)陽性細胞所占百分比分為：≤5%為0分、6%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。以上兩種計分相乘得出總分，總分<4分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.3.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析：基于GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TROAP在HCC組織及正常組織中的表達情況，以及TROAP表達水平與HCC患者預后的關系。

1.3.5 隨訪：對所有患者進行術后隨訪，采用門診復查、電話或微信等方式，開始時間為術后第1天，截至患者死亡或2021年3月，記錄患者的生存情況。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數(shù)資料以例數(shù)/%表示，組間比較采用χ2檢驗；Spearman法分析TROAP蛋白與CDH1、波形蛋白表達的相關性；采用Kaplan-Meier法分析TROAP蛋白表達情況與患者生存率的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HCC組織及癌旁組織中TROAP、CDH1及波形蛋白的表達情況基于GEPIA數(shù)據(jù)庫，HCC組織TROAP mRNA水平明顯高于正常組織(P<0.05，見圖1)。HCC組織中TROAP蛋白及波形蛋白的陽性率高于癌旁組織(P<0.05)，CDH1蛋白陽性率低于癌旁組織(P<0.05，見表1、圖2～4)。

表1 HCC組織及癌旁組織中TROAP、CDH1及波形蛋白的表達情況 [例數(shù)(%)]

注：*P<0.05。

注：A：HCC組織中TROAP蛋白表達；B：癌旁組織中TROAP蛋白陰性表達。

注：A：HCC組織中CDH1蛋白表達；B：癌旁組織中CDH1蛋白陰性表達。

注：A：HCC組織中波形蛋白表達；B：癌旁組織中波形蛋白陰性表達。

2.2 TROAP表達與HCC患者臨床病理特征的關系TROAP蛋白陽性率與HCC患者的Edmondson分級、TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤結節(jié)數(shù)目有相關性(P<0.05)，而與患者年齡、性別、腫瘤最大直徑、Child-Pugh分級、甲胎蛋白及乙肝表面抗原是否為陽性無相關性(P>0.05，見表2)。

表2 TROAP表達與HCC患者臨床病理特征的關系

續(xù)表2

2.3 HCC組織中TROAP蛋白與CDH1、波形蛋白表達的相關性Spearman法分析顯示，TROAP蛋白表達與CDH1表達呈負相關(P<0.05)，與波形蛋白表達呈正相關(P<0.05，見表3)。

表3 相關性分析

2.4 TROAP蛋白表達對患者預后的影響通過查詢GEPIA數(shù)據(jù)庫可知，HCC患者中TROAP高表達患者累積生存率明顯低于TROAP低表達患者(P=0.0039，見圖5)。本研究中，采用Kaplan-Meier法分析TROAP蛋白表達情況與患者生存率的關系，結果與數(shù)據(jù)庫一致，TROAP蛋白陽性表達者累積生存率29.4%明顯低于陰性表達者的63.8%，兩組比較Log-rank值為5.889(P=0.015，見圖6)。

圖5 GEPIA數(shù)據(jù)庫中TROAP蛋白表達與

圖6 TROAP蛋白表達與HCC患者生存的關系Fig 6 Relationship between TROAP protein expression

3 討論

HCC是全球所面臨的公共衛(wèi)生問題，每年新增病例約80萬例，其中男性發(fā)病率明顯高于女性，HCC患者預后極差，腫瘤侵襲、轉移是影響HCC患者生存率的主要原因[7]。EMT是腫瘤轉移的關鍵過程，腫瘤細胞從上皮表型轉化為間質表型，從而獲得更強的侵襲能力。在侵襲轉移級聯(lián)過程中，EMT可給予非侵襲性的腫瘤細胞轉移潛能，并促進侵襲性腫瘤細胞的遷移，在新轉移灶啟動轉移克隆生長[8-9]。HCC患者預后不良的主要原因是癌細胞具有無限生長能力，并能夠依賴EMT過程轉移至病變組織周邊和全身。在EMT過程中，細胞間粘附能力減弱，細胞侵襲能力增強，CDH1表達下降或缺失是EMT最顯著的特征，CDH1也可作為患者預后不良和轉移的預測指標[10]。波形蛋白可維持細胞完整性、抵御外界應急損傷，是EMT的標志物，其在肝癌組織中表達增加，且與患者TNM分期、轉移復發(fā)、腫瘤結節(jié)數(shù)有關，參與影響患者的預后[11]。本研究結果顯示，HCC組織中CDH1蛋白陽性率低于癌旁組織，波形蛋白的陽性率高于癌旁組織，提示患者癌組織存在EMT，癌細胞粘附能力下降，易脫離原病灶，發(fā)生轉移。

TROAP蛋白由778個氨基酸殘基組成，是一種微血管細胞骨架調節(jié)所需的細胞質蛋白，富含脯氨酸，人TROAP基因定位于12q13.12染色體處，TROAP蛋白參與人類胎盤植入和早期胎盤發(fā)育，且可在有絲分裂期間參與紡錘體組裝、調節(jié)中心體完整性[12]。Trophinin是一種膜蛋白，具有自結合活性，可介導同質細胞粘附，TROAP是Trophinin顯示細胞粘附活性所需的細胞質蛋白，在滋養(yǎng)層細胞中，一旦Trophinin與細胞質中的TROAP結合，Trophinin的胞外域即可作為細胞粘附分子發(fā)揮作用，胎盤細胞與母體上皮細胞初始附著后可誘導更強的粘附，且在胚胎植入部位可觀察到明顯的形態(tài)變化，胚胎植入過程中滋養(yǎng)細胞的攻擊行為與惡性腫瘤細胞類似，因此可能存在某些共享機制[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，TROAP可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Ye等[13]研究發(fā)現(xiàn)，敲低結腸癌細胞中TROAP的表達，可顯著抑制癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞周期G0/G1期停滯，并促進癌細胞凋亡。Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高水平TROAP的肺腺癌患者其淋巴結轉移、遠處轉移占比高于低水平TROAP患者，且高水平TROAP患者臨床分期更高、生存時間更短，TROAP表達是肺腺癌患者預后的獨立標志物。本研究結果顯示，HCC組織中TROAP陽性表達率明顯高于癌旁組織，與Li等[15]研究結果一致，且其表達與CDH1表達呈負相關，與波形蛋白表達呈正相關，提示TROAP可能參與HCC患者的EMT過程。研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者癌組織中TROAP mRNA顯著升高，其上調與腫瘤數(shù)目、分化程度有關，且其表達與患者臨床嚴重程度呈正相關[16]。本研究還顯示，TROAP蛋白陽性率與HCC患者的Edmondson分級、TNM分期、淋巴結轉移及腫瘤結節(jié)數(shù)目有關，進一步提示TROAP可能參與EMT過程，其表達升高可能使癌細胞粘附能力發(fā)生改變，導致癌細胞脫離原發(fā)病灶，從而引發(fā)轉移、結節(jié)數(shù)目增加等。此外，TROAP蛋白陽性患者5年累積生存率明顯低于陰性患者，表明TROAP水平對于預測HCC患者預后有一定價值。

綜上所述，HCC患者癌組織TROAP蛋白陽性率高于癌旁組織，且TROAP表達與EMT過程有關，有成為判斷HCC患者預后標志物的潛力。然而，TROAP在HCC患者中表達失調的分子機制仍有待進一步探究。