唐冰璇，陳 嫻，蔣海燕，曾 奧

（湖南省微生物研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410009）

中草藥是天然藥物，因其低殘留、毒副作用小和抑/殺菌效果明顯且不易產(chǎn)生抗藥性，有些還能提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫功能和抗病能力，從而備受人們的關(guān)注[1-3]。如板藍(lán)根[4-5]、金銀花[6-7]和黃連[8-10]等具有提高動(dòng)物細(xì)胞分泌干擾素、提高免疫細(xì)胞及肝臟網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬作用的功效，因而能有效地抑制病毒的復(fù)制；黃芩[11-12]等對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌和溶血性鏈球菌等革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有殺滅和抑制作用等。國內(nèi)已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)中草藥對(duì)畜禽養(yǎng)殖的常見致病菌具有不同程度的抑菌作用。因此，該部分研究對(duì)26種中草藥對(duì)畜禽養(yǎng)殖中4類致病菌(大腸桿菌、沙門氏菌、葡萄球菌和巴氏桿菌)的抑制作用進(jìn)行檢測(cè)，為進(jìn)一步研究開發(fā)用于畜禽養(yǎng)殖的中草藥發(fā)酵制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用中草藥

板藍(lán)根、地榆、藿香、防風(fēng)、金銀花、艾葉、丹參、烏梅、貫仲、五味子、馬齒莧、虎杖、秦皮、魚腥草、柯子、下青葉、夏枯草、五倍子、黃芩、黃連、黃芪、大黃、連翹、柴胡、黃柏、山楂購買自養(yǎng)天和藥店。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)中用到的細(xì)菌由本院實(shí)驗(yàn)室從畜禽中分離和鑒定，包括致病菌大腸桿菌DH5α、產(chǎn)毒大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、低毒巴氏桿菌（巴氏桿菌439）、中毒巴氏桿菌（巴氏桿菌2010）和強(qiáng)毒巴氏桿菌（巴氏桿菌2011），以及生理菌株副干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌。

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和巴氏桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；金黃色葡萄球菌和沙門氏菌用營養(yǎng)肉湯(含2%NaCl)培養(yǎng)；副干酪乳桿菌用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥制備方法

各藥物超微粉的制備：采用BFM-T6BI型貝利粉碎機(jī)分別對(duì)藥物進(jìn)行粉碎，在-10℃～15℃下粉碎15min，過200目篩，即得各味藥物超微粉體。

采用超微藥物浸提法提取中藥的有效成分，分別取板藍(lán)根、藿香等26味超微中草藥20g，各加入無菌蒸餾水200 mL浸泡24 h，藥液過濾，再將濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至20mL，此時(shí)各超微藥物的最終濃度為1 g/mL。將得到的超微藥液經(jīng)高壓滅菌鍋121℃滅菌15 min后，4℃保存，備用。

1.2.2 菌懸液的制備

受試致病菌株復(fù)蘇后分別接種于斜面培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)24 h,用無菌生理鹽水洗脫,至菌懸液濃度為107CFU/mL，備用。

1.2.3 培養(yǎng)基擴(kuò)散法

取致病菌菌懸液100 μL涂布于固定培養(yǎng)基平板上,然后在培養(yǎng)基上打孔,

孔徑約5 mm,孔間距離≥2 cm,向孔中注入中草藥藥液(每孔注入50 μL),每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行組,置28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察抑菌圈大小(游標(biāo)卡尺檢測(cè)圈直徑)。抑菌圈直徑≥20 mm為極度敏感：++++；15 mm≤抑菌圈直徑＜20 mm為高度敏感:+++；10 mm≤抑菌圈直徑＜15 mm為中度敏感：++；無抑菌圈或抑菌圈直徑＜10 mm為低敏或耐藥：+。

1.2.4 二倍稀釋法

根據(jù)抑菌圈結(jié)果，采用常量肉湯二倍稀釋法測(cè)定中藥超微藥液最低抑菌濃度，每種中藥超微藥液取10支試管，每管加入1 mL菌懸液和9 mL肉湯和藥物原液的混合液，配制成1 g/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5mg/mL、31.25 mg/mL、15.62 mg/mL、7.81mg/mL、3.91 mg/mL以及0 mg/mL（不加藥液對(duì)照）藥物濃度的混合液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，以濁度為指標(biāo)檢查試管中有無細(xì)菌生長(zhǎng)，以不顯示濁度、細(xì)菌不生長(zhǎng)的那一管的超微藥液濃度作為MIC值。

2 結(jié)果與分析

2.1 26種中草藥對(duì)致病菌的抑制效果

如表1所示，26種中草藥對(duì)大腸桿菌（DH5α為工程菌，產(chǎn)毒大腸桿菌為致病菌）的抑菌效果，地榆、防風(fēng)、烏梅、五味子、黃連對(duì)兩種大腸桿菌均表現(xiàn)出一定的抑菌效果，其中貫仲、柯子和大黃還對(duì)產(chǎn)毒大腸桿菌屬有抑菌效果。由此也可看出，同一中草藥對(duì)同一屬不同種細(xì)菌的抑制效果存在差異，DH5α的耐藥性強(qiáng)于產(chǎn)毒大腸桿菌。

表1 26種中草藥對(duì)大腸桿菌的抑菌效果

如表2所示，26種中草藥對(duì)巴氏菌屬的抑菌效果(3種菌均為致病菌)，地榆、防風(fēng)、烏梅、柯子、五倍子、大黃、連翹和山楂均對(duì)巴氏桿菌有抑制作用，其中貫仲和柴胡對(duì)巴氏桿菌439；黃連和黃柏對(duì)巴氏桿菌439和巴氏桿菌2011也表現(xiàn)出抑菌效果，因此可得出在耐藥性方面：巴氏桿菌2010＞巴氏桿菌2011＞巴氏桿菌439。

表2 26種中草藥對(duì)巴氏菌屬的抑菌效果

根據(jù)表3結(jié)果，地榆、防風(fēng)、烏梅、貫仲、五味子、柯子、五倍子、黃連、大黃和山楂對(duì)兩屬致病菌均表現(xiàn)出抑制作用，同時(shí)，丹參、黃芩、黃連、連翹、柴胡對(duì)金黃色葡萄球菌也具有抑制作用。金黃色葡萄球菌相對(duì)較為敏感，其中烏梅、五味子和大黃對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別達(dá)到62.50 mg/mL、62.5 mg/mL和31.25 mg/mL。

表3 26種中草藥對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果

與前面的致病菌不同，副干酪乳桿菌為益生菌，枯草芽孢桿菌為一種無致病性的安全微生物，兩種菌均可用于開發(fā)畜禽養(yǎng)殖中草藥發(fā)酵制劑。由表4可知，板藍(lán)根、地榆、柯子、五倍子、黃連和大黃對(duì)副干酪乳桿菌表現(xiàn)出一定的抑菌效果，地榆、丹參、烏梅、五倍子、虎杖、五味子、黃連、大黃和連翹對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑制作用。

表4 26種中草藥對(duì)副干酪乳桿菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果

3 討論

有關(guān)中草藥在畜禽養(yǎng)殖方面應(yīng)用已有諸多報(bào)道，曲徑等[13]報(bào)道顯示，艾葉、黃連、黃柏、地榆、柴胡對(duì)巴氏桿菌均有抑制作用，這與本研究結(jié)果類似，不同之處在于艾葉的抑制效果，其原因可能是艾葉起抑制效果的有效成分易溶于醇，而水提難以溶出其有效成分；其次，本研究結(jié)果顯示，而巴氏桿菌2010對(duì)黃連黃柏表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐藥性，說明黃連黃柏的抑制效果對(duì)同一屬不同種和不同株的巴氏桿菌存在差異，巴氏桿菌2010如此強(qiáng)的耐藥性有待于進(jìn)一步的研究。

乳酸菌作為益生菌，同時(shí)乳酸菌本身也具有抑制其他細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，一般鮮有報(bào)道中草藥對(duì)乳酸菌的抑制效果[14]。本研究結(jié)果顯示，具有較強(qiáng)抑制作用的中草藥（柯子、五倍子、黃連、大黃和黃柏）同樣對(duì)乳酸菌具有抑制作用，但相對(duì)于其他菌，能夠抑制乳酸菌生長(zhǎng)的中草藥較少。該結(jié)果可為乳酸菌和中草藥的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

4 結(jié)論

綜述上述結(jié)果，大青葉、夏枯草、黃芪、秦皮、魚腥草、馬齒莧、艾葉、金銀花、藿香和板藍(lán)根對(duì)被檢致病菌沒有抑制效果；地榆、防風(fēng)、烏梅、五倍子、五味子、柯子、山楂等對(duì)各致病菌均有抑制效果。結(jié)合中草藥對(duì)枯草芽孢桿菌和副干酪乳桿菌的抑制效果，可選擇貫仲、黃芩和柴胡這一類（對(duì)致病菌具有抑制作用，而對(duì)無毒菌株無抑制作用）中草藥，抑或選擇大青葉、夏枯草、秦皮、魚腥草、馬齒莧、艾葉和金銀花（對(duì)致病菌和無毒菌株均無抑制作用）用于開發(fā)畜禽養(yǎng)殖中草藥發(fā)酵制劑，這些結(jié)果為后續(xù)枯草芽孢桿菌和副干酪乳桿菌發(fā)酵中草藥研究提供參考。