劉佳霖，羅文華，高麗嬌，任 勤，王瑞生

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

蜜蜂是世界上最重要的農(nóng)業(yè)授粉昆蟲，但從2006年開始，全世界蜜蜂的種群數(shù)量快速下降，導(dǎo)致部分農(nóng)作物和野生植物得不到充分授粉，對全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了一定影響[1,2]。自此，深入開展蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用已成為全球養(yǎng)蜂業(yè)的重要任務(wù)之一。

精液保存技術(shù)是蜜蜂種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用的關(guān)鍵配套技術(shù)，為保護(hù)珍貴、優(yōu)良的蜜蜂種質(zhì)資源提供技術(shù)支撐，加快蜜蜂新品種培育的進(jìn)程，但效率低、成本高且保存時間較短仍是制約蜜蜂精液保存技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵難題。由此，本文圍繞多年來蜜蜂精液保存的相關(guān)研究，綜述蜜蜂精液的質(zhì)量檢測方法、保存技術(shù)及影響保存的因素，以全面了解該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀，為進(jìn)一步優(yōu)化蜜蜂精液保存技術(shù)、研發(fā)適宜不同蜜蜂的精液保存方法提供理論依據(jù)，助力實(shí)現(xiàn)蜜蜂精液保存技術(shù)的廣泛應(yīng)用，推動蜜蜂種業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展。

1 蜜蜂精液質(zhì)量的檢測方法

精液質(zhì)量是影響蜜蜂繁殖的重要因素，決定蜂王的產(chǎn)卵力，也決定人工授精的成敗[3]。蜜蜂精液質(zhì)量的傳統(tǒng)檢測方法主要有2種：一是使用顯微鏡統(tǒng)計存活精子或活動精子的數(shù)量，計算精子存活率和活力；二是使用人工授精技術(shù)將精液注入處女王體內(nèi)，評價受精后蜂王的產(chǎn)卵情況。精液的鏡檢準(zhǔn)確性較差，而體內(nèi)檢測依賴人工授精技術(shù)，耗時長、成本高。由此，科學(xué)家們進(jìn)一步開發(fā)了多種檢測方法。如利用雙熒光染色法測定精子的存活率，通過低滲腫脹試驗(yàn)測定精子質(zhì)膜完整性，使用熒光顯微鏡測定頂體完整率和線粒體功能以及利用TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling）技術(shù)或凝膠電泳技術(shù)檢測精子DNA的損傷[3-7]。這些技術(shù)的出現(xiàn)為評價不同因素對蜜蜂精液質(zhì)量的影響提供了技術(shù)支撐。研究顯示：精液質(zhì)量體外檢測的結(jié)果與授精后蜂王受精囊內(nèi)精子的性能顯著相關(guān)，表明精液質(zhì)量的體外檢測結(jié)果可直接反映蜂王的產(chǎn)卵性能，體外檢測技術(shù)可有效提高蜜蜂精液質(zhì)量的檢測效率[8]。

精液保存技術(shù)的價值在于貯存的精液能用于蜂王的人工授精，精液質(zhì)量需保證受精后的蜂王能正常產(chǎn)卵。Collins[9]證實(shí)精液中精子存活率需超過46%才能滿足人工授精的需要。其他研究也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果，精液中精子存活率需超過50%才能保證人工授精后蜂王從春季到冬季正常產(chǎn)卵[10]。由此，成功的精液保存方法應(yīng)滿足精子存活率不低于50%[11]。

2 蜜蜂精液保存技術(shù)

蜜蜂精液保存技術(shù)根據(jù)保存時的精液狀態(tài)分為非冷凍和冷凍保存技術(shù)。非冷凍保存技術(shù)，即液態(tài)保存技術(shù)，是在冰點(diǎn)以上溫度貯存精液；精液的冷凍保存技術(shù)是在低溫冰箱（-20℃和-80℃）或液氮（-196℃）中貯存，保存期間精液維持冷凍狀態(tài)。在實(shí)際貯存時，應(yīng)根據(jù)保存目的選擇合適的保存技術(shù)，以提高保存效率，降低保存成本。

2.1 蜜蜂精液的非冷凍保存技術(shù)

蜂王和雄蜂交尾后將精液貯存在受精囊內(nèi)，可長時間維持精子活力，這一特性推動了國內(nèi)外學(xué)者開展蜜蜂精液的非冷凍保存研究。1960年，Taber和Blum[12]在冰點(diǎn)以上溫度保存蜜蜂精液68 d，隨后進(jìn)行人工授精，蜂王能正常生產(chǎn)受精卵。1970年，Polle和Taber[13]使用硫酸鏈霉素在13～15℃保存精液35周，人工授精后蜂王能正常產(chǎn)卵并成功培育下一代蜂王。2000年，Collins[14]測定精液在不同溫度下保存1～52周后的精子存活率，結(jié)果顯示25℃和12℃實(shí)驗(yàn)組9周時的精子存活率分別為58%和80%，差異顯著，隨后維持相似的精子存活率至39周。隨著研究的不斷深入，蜜蜂精液在非冷凍條件下的有效保存時間逐步延長。使用抗生素凝膠包裹的保存管貯存精液，在14℃成功保存439 d，該貯存時間是蜜蜂精液在非冷凍條件下維持正常授精性能的最長保存時間，證實(shí)了抗生素在蜜蜂精液保存中的重要作用[15]。

除依賴恒溫設(shè)備的非冷凍保存，國內(nèi)外學(xué)者也研究了蜜蜂精液在常溫下的保存方法。將采集的精液裝入微型尼龍管，可在室溫（20～24℃）成功保存25 d[16]。Burley等[17]使用含有0.05%雙氫鏈霉素的Kiev溶液（檸檬酸鈉2.43 g、NaHCO30.21 g、KCl 0.04 g、磺胺0.30 g、葡萄糖0.30 g和100 mL去離子水）稀釋精液，25℃保存5周和6周后精子的存活率分別為83.8%和79.2%。2015年，Collins[18]將新鮮精液移入40μL細(xì)管，在室溫條件下避光保存，發(fā)現(xiàn)隨保存時間的延長，精液濃度和人工授精后蜂王生產(chǎn)受精卵的數(shù)量逐漸降低，該條件僅適用于精液的短期保存。

2.2 蜜蜂精液的冷凍保存技術(shù)

非冷凍保存技術(shù)實(shí)現(xiàn)蜜蜂精液的短期貯存，但隨著貯存時間延長，精液質(zhì)量逐漸下降，難以長時間保存精液。由此，科學(xué)家們參考人類和畜禽精液的保存技術(shù)，逐步開展蜜蜂精液的冷凍保存研究，旨在實(shí)現(xiàn)蜜蜂精液的長期保存。在研究初期，蜜蜂精液的冷凍保存并不順利，有效保存時間短，冷凍保存后（冷凍-融化）的精液質(zhì)量差，導(dǎo)致人工授精后蜂王生產(chǎn)大量未受精卵[19,20]。造成該結(jié)果的主要原因是快速冷凍會破壞精子的細(xì)胞完整性，導(dǎo)致精子死亡[21]。隨后的研究集中于降低快速冷凍對蜜蜂精子的影響，篩選了冷凍保護(hù)劑和保存管，優(yōu)化了降溫程序，逐步延長了冷凍保存的有效時間。薛運(yùn)波等[22]將精液與含有冷凍保護(hù)劑的稀釋液混合后移入0.25 mL麥管，在13℃平衡10 min、4℃平衡30 min，隨后進(jìn)行預(yù)冷凍，將精液放置在液氮罐口下方15 cm處停留20 min，降至25 cm處8 min，在液氮面上方2 cm處停留5 min，最后投入液氮保存。該方法實(shí)現(xiàn)了蜜蜂精液長達(dá)4年的保存，解凍后精子的活力為0.68。程控降溫儀的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了精液從冰點(diǎn)或冰點(diǎn)以上溫度到-40～-60℃的程序降溫，進(jìn)一步降低快速冷凍對精液的影響。Paillard等[23]將平衡后的精液放入程控降溫儀，設(shè)置程序-3℃/min，待精液溫度降至-40℃時快速投入液氮保存，保存1年后精子的存活率超過75%，人工授精后蜂王死亡率低，受精囊內(nèi)活精子數(shù)量大。使用冷凍-融化精液進(jìn)行2代蜂王的人工授精，二代蜂王能正常產(chǎn)卵，表明基于程控降溫儀的冷凍保存技術(shù)可有效貯存蜜蜂精液，該技術(shù)可為開展蜜蜂良種選育、建立種質(zhì)資源基因庫提供關(guān)鍵的技術(shù)支撐[24]。至此，蜜蜂精液的冷凍保存技術(shù)已趨于成熟，盡管不同研究的保存方法存在差異，但主要步驟基本一致，即采集性成熟雄蜂的精液移入離心管，加入稀釋液和冷凍保護(hù)劑，輕柔混勻后在4℃平衡1～2 h，移入冷凍保存管，使用程控降溫儀將溫度降至-40～-60℃，投入液氮保存[23,25]。

雖然基于程控降溫儀的冷凍保存技術(shù)實(shí)現(xiàn)了蜜蜂精液的長時間保存，但該技術(shù)對設(shè)備的依賴性強(qiáng)，成本高，難以實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用。因此，探索替代程序降溫的預(yù)冷凍方法成為近年來的研究熱點(diǎn)。Auth和Hopkins[4]將精液放置在液氮上方2.5 cm處，蒸汽浸漬5 min后放入液氮保存，26 d后測定不同實(shí)驗(yàn)組精液的質(zhì)量，結(jié)果顯示：液氮蒸汽浸漬實(shí)驗(yàn)組精子的活力和存活率與程序降溫實(shí)驗(yàn)組差異不顯著。Stucky等人[26]設(shè)計了直徑較小的精液保存管，使用玻璃化處理進(jìn)行預(yù)冷凍，隨后放入液氮保存，6 d和343 d后的精子存活率分別為93.18%和41.46%，且6 d時精子的存活率顯著高于程序降溫實(shí)驗(yàn)組。以上研究表明：液氮蒸汽浸漬和玻璃化處理可作為程序降溫的替代方法進(jìn)行深入研究。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對蜜蜂精液的冷凍保存技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。如Wegener等人[27]使用透析技術(shù)向精液中混入二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），冷凍保存后進(jìn)行人工授精，提高了蜂王生產(chǎn)受精卵的比例，且蜂王受精囊內(nèi)精子的數(shù)量也明顯高于其他研究，表明通過透析的方式使用保護(hù)劑能提高精液冷凍保存的效果。莊明亮等[25]將精液與稀釋液和保護(hù)液分2步混合平衡，顯著提高冷凍-融化精子的活力和存活率，以及人工授精后蜂王的存活率。這些研究清楚地表明，現(xiàn)有的蜜蜂精液冷凍保存技術(shù)仍有一定的發(fā)展空間，進(jìn)一步延長有效保存時間，提高冷凍-融化精液的質(zhì)量，降低保存成本將是未來的主要研究方向。

3 影響蜜蜂精液保存的因素

3.1 稀釋液

稀釋液在蜜蜂精液保存、質(zhì)量評價以及人工授精等過程中必不可少，合適的稀釋液需保證人工授精后蜂王正常產(chǎn)卵，同時還能提高精液保存效果，降低離心等操作對精液的影響。稀釋液主要包含多種化合物（NaCl、NaHCO3和檸檬酸鈉等）、氨基酸、蛋白質(zhì)、糖、抗氧化酶以及抗生素等，用于冷凍保存的稀釋液還需加入冷凍保護(hù)劑如DMSO和甘油等。稀釋液中的陽離子可作為精子運(yùn)動的可逆抑制劑，降低精子在貯存過程中的能量損耗[28]；蛋白質(zhì)能提高冷凍-融化精子的存活率和活力，降低超低溫對精子質(zhì)膜的影響[6,29,30]；抗氧化酶有助于降低外界脅迫對精子的氧化損傷，其中過氧化氫酶基因在雄蜂和蜂王生殖器官以及精液中高表達(dá)，表明該酶在保護(hù)精液免受氧化損傷的過程中發(fā)揮著十分重要的作用[31]。此外，適宜的pH值和滲透壓有利于提高精子活力，降低冷凍保存對精液的影響[22,28,32]。

不同稀釋液能顯著影響蜜蜂精液非冷凍保存的效果。與VarhomⅡ、Ⅲ、甘氨酸緩沖液和椰子水相比，使用Tris緩沖液（Tris buffer 100 mL、NaCl 0.065 g和KCl 0.060 g）在14℃保存9個月的精液，精子運(yùn)動性能最好，并確定該稀釋液的最佳pH值為7.19，表明優(yōu)化稀釋液配方對延長蜜蜂精液的有效保存時間至關(guān)重要。稀釋液同樣能影響蜜蜂精液的冷凍保存效果。Gül等[33]研究顯示：與葡萄糖溶液相比，稀釋液能改善冷凍-融化精液的質(zhì)量，提高人工授精后蜂王生產(chǎn)受精卵的比例。與大豆卵磷脂相比，稀釋液中加入20%的蛋黃能提高冷凍-融化精子的活力和存活率[34]。Taylor等[35]發(fā)現(xiàn)：稀釋液并不影響精子存活率，但會對精子活力產(chǎn)生顯著影響，使用4號稀釋液（100 mL緩沖液包含檸檬酸鈉2.43 g、NaHCO30.21 g、KCl 0.04 g、阿莫西林0.03 g和過氧化氫酶200μL）冷凍保存精液的效果優(yōu)于其他稀釋液。

稀釋液中加入添加劑能提高精液保存的效果。添加5 mmol/L左旋肉堿L-carnitine可改善冷凍-融化精液的質(zhì)量，顯著提高精子活力、質(zhì)膜完整性、頂體完整率以及線粒體功能，表明左旋肉堿的抗氧化和抗凋亡作用有助于提高精液在低溫下的穩(wěn)定性[36]。蜂王漿是蜜蜂幼蟲和蜂王的重要食物，具有較高的抗氧化活性，稀釋液中添加1%的蜂王漿能顯著提高冷凍-融化精液的精子活力、頂體完整率及質(zhì)膜完整性，表明稀釋液中加入適量蜂王漿有利于蜜蜂精液的冷凍保存[5]。

3.2 冷凍保護(hù)劑

冷凍保護(hù)劑能有效降低超低溫對蜜蜂精液的影響，提高冷凍-融化精子的存活率及活力，在蜜蜂精液的冷凍保存過程中發(fā)揮著十分重要的作用[37]。但冷凍保護(hù)劑對精子有毒性，能造成精子損傷，因此篩選有效且低毒的冷凍保護(hù)劑也成為精液保存研究的一個重要方向。Al ay等[38]評價了4種保護(hù)劑對冷凍-融化精液的影響，結(jié)果顯示DMSO和乙二醇能顯著提高稀釋后、平衡后以及冷凍保存后精子的活力，甘油能顯著改善冷凍-融化精液的質(zhì)量，不同保護(hù)劑的保護(hù)效果由大到小依次為DMSO、乙二醇、甘油和1,2丙二醇，DMSO的最佳濃度為6%。其他研究也獲得了相同的結(jié)果，DMSO對精液冷凍的保護(hù)效果優(yōu)于其他保護(hù)劑，且毒性較低[11,26,35]。為最大限度降低保護(hù)劑對冷凍-融化精子的毒性，科學(xué)家們優(yōu)化了保護(hù)劑的使用方法。與單一保護(hù)劑相比，在相同濃度下同時使用DMSO和乙二醇能提高蜂王受精囊內(nèi)的精子數(shù)量，表明保護(hù)劑的混合使用有助于降低單一保護(hù)劑對精液的毒性[39]。使用透析技術(shù)將DMSO混入精液，能提高蜂王受精囊內(nèi)精子的數(shù)量以及生產(chǎn)受精卵的比例[27]。

3.3 保存管

合適的保存管有利于提高冷凍保存后精液的質(zhì)量。使用0.50 mL和0.25 mL麥管保存精液，精子活力更高，其中0.25 mL麥管的保存效果最好，其次為0.50 mL麥管以及0.25 mL、0.50 mL、1.50 mL和5.00 mL PCR管[22]。使用抗生素凝膠包裹的保存管能顯著延長蜜蜂精液非冷凍保存的有效時間[15]。此外，保存管還能提高精液保存的效率。Stucky等[26]設(shè)計了直徑較小的精液保存管，結(jié)合玻璃化處理簡化了冷凍保存過程中的降溫程序。

3.4 降溫程序

快速冷凍-融化能造成精子不可逆的損傷，優(yōu)化降溫程序一直是蜜蜂精液保存研究的熱點(diǎn)[21]。研究顯示：程序降溫有利于改善冷凍-融化精液的質(zhì)量，提高保存效果[23]。液氮蒸汽浸漬同樣能降低快速冷凍對精子活力及存活率的影響，該預(yù)冷凍方法的保存效果與程序降溫差異不顯著[4]。精液在液氮保存前進(jìn)行玻璃化處理，6 d后的精子存活率為93.2%，高于程序降溫實(shí)驗(yàn)組，但隨后逐漸下降，在保存343 d后精子存活率為41.2%[11]。此外，精液在0℃以前的緩慢降溫也有助于提高冷凍-融化精子的存活率，約為快速降溫的6.93倍[11]。

3.5 保存溫度

精液對溫度敏感，不同保存溫度對精液的保存效果產(chǎn)生顯著影響[11]。Tarliyah等[40]評價不同保存溫度對精子存活率的影響，結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組精子的存活率隨保存時間的延長逐漸降低，其中5℃實(shí)驗(yàn)組的精子存活率下降緩慢，36 h后的精子存活率高于27℃和37℃實(shí)驗(yàn)組。精液與硫酸鏈霉素混合后在室溫（24℃）以及13～15℃下保存13～35周。發(fā)現(xiàn)隨時間的延長，室溫保存的精液質(zhì)量逐漸降低，使用保存13～17周的精液進(jìn)行人工授精，大部分蜂王只生產(chǎn)未受精卵，隨后精液變質(zhì)，不能進(jìn)行人工授精。13～15℃保存35周的精液仍能進(jìn)行人工授精，且蜂王正常產(chǎn)卵[13]。因此，篩選適宜的保存溫度對提高蜜蜂精液的非冷凍保存效果具有十分重要的意義。

目前，精液的冷凍保存主要依賴液氮，保存溫度為-196℃。研究顯示：-196℃保存蜜蜂精液的效果優(yōu)于其他冷凍保存溫度，且液氮保存效率高、成本低[7]。

4 研究展望

通過60年以上的努力，蜜蜂精液保存技術(shù)已趨于成熟，但效率低、成本高且有效保存時間較短仍是制約蜜蜂精液保存技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵難題。因此，國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)緊密圍繞蜜蜂種業(yè)未來發(fā)展的需要，在下一步的研究中利用新技術(shù)和新材料進(jìn)一步優(yōu)化蜜蜂精液保存技術(shù)，研發(fā)適宜不同蜜蜂的精液保存方法，研制專用設(shè)備，為保護(hù)蜜蜂種質(zhì)資源、培育優(yōu)良蜜蜂品種提供更加強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

4.1 優(yōu)化蜜蜂精液保存技術(shù)

以延長有效保存時間，提高保存效率和精液質(zhì)量，降低保存成本為主要目的，對現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行深度優(yōu)化，獲得實(shí)用性強(qiáng)、適用廣泛的蜜蜂精液保存技術(shù)。改良和簡化稀釋液配方，尋找能有效提高精液保存效果和人工授精成功率的添加劑；優(yōu)化冷凍保護(hù)劑的使用方法，評價新型保護(hù)劑在蜜蜂精液冷凍保存中的作用；改良液氮蒸汽浸漬和玻璃化處理等預(yù)冷凍工藝，尋找替代程序降溫的預(yù)冷凍方法；基于3D打印技術(shù)設(shè)計改良現(xiàn)有的保存管，利用新型材料研發(fā)專用保存容器，進(jìn)一步延長蜜蜂精液的保存時間。

4.2 研發(fā)適宜不同蜜蜂的精液保存技術(shù)

多年來，蜜蜂精液保存的研究主要集中于西方蜜蜂，而有關(guān)其他蜜蜂精液的保存鮮有報道。但不同蜜蜂精液的采集量、濃度、精子數(shù)量及理化性質(zhì)存在一定差異，西方蜜蜂精液的保存技術(shù)并不完全適用于其他蜜蜂，導(dǎo)致保存效果差、有效保存時間短[41-44]。為實(shí)現(xiàn)多種蜜蜂精液的長期保存，保護(hù)全世界蜜蜂遺傳資源多樣性，下一步應(yīng)重點(diǎn)研發(fā)適宜不同蜜蜂，特別是適宜各地區(qū)特色蜜蜂品種的精液保存技術(shù)。中華蜜蜂是我國最重要的本土蜜蜂品種，從西方蜜蜂引入我國開始，中華蜜蜂的分布區(qū)域和種群數(shù)量快速下降[45]。2006年中華蜜蜂已納入我國畜禽遺傳資源保護(hù)品種，保護(hù)中華蜜蜂已成為我國蜂產(chǎn)業(yè)的重要任務(wù)之一。目前，有關(guān)中華蜜蜂精液保存的研究較少，現(xiàn)有技術(shù)存在保存效果差，人工授精后蜂王死亡率高、產(chǎn)卵異常等問題[43]。因此，我國亟待研發(fā)適宜中華蜜蜂的精液保存技術(shù)，為保護(hù)我國珍貴的本土蜜蜂種質(zhì)資源、推動中華蜜蜂品種改良奠定基礎(chǔ)。

4.3 研制蜜蜂精液的專用保存設(shè)備

現(xiàn)有的蜜蜂精液保存技術(shù)大多使用通用設(shè)備，適用性不強(qiáng)，效率低，對精液保存有一定影響。針對蜜蜂養(yǎng)殖及精液保存過程中的實(shí)際情況，設(shè)計研制蜜蜂精液專用的保存設(shè)備，如數(shù)控蜜蜂精液保存箱、透析儀、預(yù)冷凍設(shè)備以及專用液氮保存容器等，能有效提高設(shè)備與蜜蜂精液保存技術(shù)的適配程度，提高保存效率，延長蜜蜂精液的有效保存時間。