李 艷，王 建，辜剛鳳

1.川北醫(yī)學院(南充 637000)；2.雅安市人民醫(yī)院(雅安 625000)

近年來，有不少關于認知障礙的研究，也出現(xiàn)了許多類別的動物血管性認知障礙(vascular cognitive impairment，VCI)模型，如鼠、豬、狗、兔等[1-4]，其中最常見的是嚙齒類動物模型。目前，對嚙齒類動物神經(jīng)行為學評價工具的研究已較成熟，如莫里斯水迷宮實驗、放射臂迷宮實驗、物體辨別實驗等[5-7],但因其與非人靈長類動物解剖與病生機制差異較大，且習性等各方面均不同，上述方法對于恒河猴認知功能評估方面并不實用。嚙齒類動物與人類有著千差萬別，這導致嚙齒類動物的研究成果運用于臨床時受到了很大的限制。而非人靈長類動物與人類有著較多相似之處，一直以來被認為是最理想的動物模型，其中恒河猴模型運用頻率較高。恒河猴屬于獼猴類屬，與人類祖先同源，其解剖和相關的病理生理機制都與人類極其相似[8]，制作恒河猴各類VCI動物模型對于后續(xù)的臨床研究有較大的幫助，甚至有望揭示各類VCI的早期預警標志物,達到臨床上早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的，對于后續(xù)的臨床藥物研究也可提供較可靠的突破口。

目前有關恒河猴VCI模型認知功能評估方面的研究還較少，但恒河猴阿爾茲海默病及精神分裂癥等藥理學模型的認知功能評估研究有不少發(fā)現(xiàn)[9]，其中，應用頻率較高的有延遲匹配樣本任務(delay matching sample tasks,DMST)、延遲非匹配樣本任務(delayed nonmatching-to-sample,DNMTS)，兩者同屬于空間延遲反應實驗[10-14]，延遲響應測試(delayed response test,DR)、視空間配對關聯(lián)學習任務(visuo-spatial paired-associates learning,vsPAL)、對象就地場景記憶任務、延遲識別跨度測試(delayed recognition span task,DRST))也較常用[15-18]；應用頻率較少的有物體檢索繞道任務(object retrieval detour task,ORD)、認知集轉(zhuǎn)換任務、手指迷宮實驗[19-21]；此外，還有一些根據(jù)上述實驗原理轉(zhuǎn)變而來的任務測試，例如數(shù)字歧視任務、逆向?qū)W習任務、聲學歧視任務等[22-23]。本文對應用較廣泛任務的具體實驗方法及其優(yōu)缺點進行綜述。

1 空間延遲反應

1.1 DMST

設備：靈長類動物椅、顯示器(cathode ray tube，CRT)(可選用帶有鼠標的電腦顯示器替代)。具體做法：測試時，使恒河猴坐在靈長類動物專用椅上，眼睛距離CRT屏幕前83 cm，在灰色屏幕上出現(xiàn)固定亮點時，使恒河猴按下按鈕，固定點于800～1 020 ms的隨機時間點消失，隨后出現(xiàn)樣本刺激，樣本刺激呈現(xiàn)400 ms后消失，后延遲800、1 000或1 200 ms(3個延遲持續(xù)時間隨機選擇，避免恒河猴預計延遲間隔)。測試刺激(與樣本刺激相同則匹配，不同則不匹配)呈現(xiàn)820 ms。如匹配，恒河猴需松開按鈕。在該時間內(nèi)松開則獲得一滴果汁獎勵。在預訓練中，恒河猴必須在測試刺激消失后 800 ms內(nèi)重按按鈕才可獲得獎勵。為避免恒河猴過度訓練導致神經(jīng)發(fā)生變化，需在每次實驗中隨機生成一種新刺激。如果恒河猴過早或過晚松開按鈕，實驗將自動停止，3～4 s的實驗等待期后再開始實驗且無獎勵，恒河猴對測試刺激的匹配正確率代表其記憶保持的程度。

如需對恒河猴長期記憶進行測試，則將測試刺激多樣化，使其選擇與樣本刺激相匹配的刺激。訓練恒河猴坐在靈長類動物椅上，并使其通過在計算機顯示器上移動光標來執(zhí)行多目標視覺延遲匹配樣本任務。每個實驗由4個連續(xù)階段組成：實驗開始(目標)、樣品(圖像呈現(xiàn))、延遲(空白屏幕)和匹配(多圖像呈現(xiàn))階段。恒河猴將計算機光標移動到屏幕中心的起始目標，然后由互聯(lián)網(wǎng)隨機生成的剪貼畫組成的示例圖像啟動實驗。將光標置于樣本圖像中(20～300 ms)，然后在樣本和匹配之間插入1～30 s的可變延遲間隔，使屏幕空白。然后進行測試階段,該階段由2～6張圖片組成，只有一張是樣本圖片；其他圖像是不匹配或干擾圖像。圖像匹配正確，通過吸管向恒河猴輸送0.5 mL的果汁作為獎勵。所有圖像(樣本、匹配和干擾項)隨機呈現(xiàn)在顯示屏上的9個位置之一；在匹配階段，匹配圖像不放置在與樣本圖像相同的位置。每輪大約有500～600張獨特的圖像，均是從5 000個不同的剪貼畫圖像中隨機選擇。每3～10 s進行1次實驗，每輪共進行150～200 次實驗[24-26]。

DMST評估方式是恒河猴眾多認知評估方式中使用最多的一種。根據(jù)延遲反應實驗原理,DMST可使用多種形式進行，實驗中所使用的儀器及器材均可根據(jù)實驗室所處環(huán)境及經(jīng)濟實力等條件進行實時調(diào)整，實驗原理易理解，且操作簡單，訓練員易掌握，且實驗預訓練及正式訓練所需時間較短。由以往實驗員的經(jīng)驗可知，該實驗所需時間周期比其他實驗方式具有獨特的優(yōu)勢，且在恒河猴身上能順利開展，訓練成功率較高，在其他條件達到的情況下，動物依從性較好。該評估方式是目前最理想的認知評估工具之一。不僅可通過上述動物的視覺對其認知功能進行評估，還可通過觸覺、聽覺進行評估，其中，觸覺主要起評估長期記憶的作用，而聽覺延遲匹配樣本任務主要評估動物的短期記憶。DMST已經(jīng)得到認可，但使用該方法進行評估時，所用時間十分精確，較難把握，且需根據(jù)恒河猴種類及不同生活習性進行合適的調(diào)整。

1.2 DNMS

設備：測試托盤、合適的樣本對象與測試對象、計時器。具體做法：DNMS是一種視覺識別記憶測試，在手動裝置中進行。簡言之，向恒河猴展示一個樣本對象，該對象覆蓋測試托盤中央孔中的食物獎勵，當恒河猴取回食物后，延遲期開始，在此期間降低不透明擋板。在延遲期后，樣本對象與新對象一同呈現(xiàn)，恒河猴選擇新對象則獲得獎勵。在恒河猴獲得獎勵后，保留間隔設置為10 s，直到恒河猴學會該任務的不匹配規(guī)則。一旦恒河猴在這個延遲間隔(100次實驗，20次/d)達到90%或以上正確率，就會通過連續(xù)施加15、30、60、120 s(100次實驗，20次/d)、600 s(總共50次實驗，5次/d)的更長延遲間隔來挑戰(zhàn)識別記憶。在整個測試過程中，實驗間隔為30 s[27]。

DNMS與DMS原理相同，操作方式相反，也可根據(jù)實驗環(huán)境及其他條件實時調(diào)整儀器及器材。雖該方式所用時間較易控制，但該評估工具相比延遲匹配樣本任務使用率低，其主要原因在于該工具預實驗所需訓練時間長，實驗周期長，一般訓練周期長達12個月。若實驗對象依從性不好，則需更長時間對其進行訓練，因此，該方法一般不作為首選認知評估工具。

2 DR

設備：透明/不透明屏幕、食物槽、食物、計時器。具體做法：DR與之前研究中使用的方法等效。恒河猴從透明屏幕后面觀看，同時裝置的一個槽被食物填充，然后兩個槽都被掩體覆蓋。在初始訓練期間，屏幕會立即升起，如果選擇了正確的位置，恒河猴就可移動掩體并取回食物。測試一直持續(xù)到動物達到90%或以上正確率為止。下一階段，在填充好食物和恒河猴響應間強加了1 s保留間隔。通過降低不透明屏幕來實現(xiàn)延遲，使恒河猴看不到食物槽。延遲1 s的訓練持續(xù)到恒河猴達到標準(在90次實驗中正確率達90%)，然后通過連續(xù)施加5、10、15、30、60 s的較長保留間隔，對記憶的要求逐漸變得困難。每個延遲測試總共90次實驗(30次/d；實驗間隔20 s)[28]。

DR在早年的猴認知功能評估中使用較多，該實驗原理最初被用于老鼠的認知功能評估，后經(jīng)過改造用于恒河猴。目前，該評估方式使用次數(shù)相對較少，但仍是一種較可靠的恒河猴認知功能評估方式。DR操作簡單，實驗流程容易理解，所采用的時間單位較易掌握，但是否適用于當前所飼養(yǎng)的恒河猴還取決于動物種類及配合程度，即恒河猴對該任務的依從性。

3 vsPLA

設備：專業(yè)電腦顯示屏、計時器。具體做法：vsPAL中，恒河猴被訓練使用1組6對(12個)視覺刺激來執(zhí)行任務。在每次實驗中，1個注視點呈現(xiàn) 0.8 s，之后提示刺激(12個視覺刺激之一)呈現(xiàn) 1 s。在 2.2 s的延遲期后，出現(xiàn)兩種刺激(提示刺激的配對關聯(lián)物和干擾物)。恒河猴在 1.5 s內(nèi)正確選擇配對關聯(lián)物則獲得獎勵。在這個任務中，恒河猴不需選擇刺激本身，而是選擇與之配對的關聯(lián)物，因此，完成任務需要回憶，而不是識別,直到正確率>90%。如果在延遲期結束前眼位偏離注視點超過1.5～2.0 s，則實驗自動終止[29]。

vsPAL最初常用于對嚙齒類動物的神經(jīng)行為學進行評估[30]，其與對象就地場景記憶任務不同，主要測試的不是恒河猴識別新事物的能力，而是測試其回憶舊事物的能力。該任務需實時監(jiān)測恒河猴的眼球運動方向來判斷恒河猴的注意力變化過程，使用儀器包括能實時監(jiān)測眼球運動的紅外線眼部監(jiān)測器。該評估方式是除延遲匹配樣本任務外使用頻率最高的任務，其測試認知功能的效能得到了許多研究員的認可。若條件允許，該實驗不失為一種較理想的恒河猴認知功能評估評價工具。

4 對象就地場景記憶任務

設備：帶有觸摸屏的視頻顯示器、漏斗、食物盒。具體做法：每次實驗顯示屏中場景均由人工自制。每個場景中有兩個前景對象，由隨機的彩色字符組成，每個字符都被放置在單個場景中的固定位置,其中之一是正確的(恒河猴觸摸可獎勵)，另一個是錯誤的(恒河猴觸摸無獎勵)。使用隨機生成器生成每個獨特場景的背景，即屏幕的背景顏色、字符位置、顏色、大小和方向、干擾字符(在大小上明顯不同于前景對象)和字符顏色隨機變化。所有的顏色有一個限制條件，即與前景對象可區(qū)分。由于這些場景是隨機生成的，所以可呈現(xiàn)無數(shù)個獨特場景。在每只恒河猴學會在黑色背景下觸摸單個前景物體后，在程序中引入額外的場景，直到恒河猴在面對新的場景時較準確地觸摸前景物體。然后引入兩個前景物體，每個階段給出的場景數(shù)量會根據(jù)每只恒河猴的表現(xiàn)逐漸增加。點擊正確的物體將使該字符閃爍2 s，然后消失，獎勵便會被送到漏斗中。當恒河猴觸摸到錯誤對象時，屏幕立即變成空白，恒河猴也獲得獎勵，并間隔10 s。觸摸場景中的其他任何地方都會導致屏幕空白，然后重復實驗。恒河猴通過試錯來學習每個場景中的正確物體。因為在第2次重復時錯誤率較低，所以在第1次瀏覽時非?？臁．敽愫雍锿瓿勺詈?次實驗時，午餐盒自動打開，恒河猴獲得大量食物獎勵。如果實驗錯誤，就會進行糾正實驗，這樣恒河猴只有在正確回答后才會得到大量食物獎勵。同時記錄下20個場景中每個重復塊選擇錯誤次數(shù)(初始接觸不正確前景對象)。訓練持續(xù)進行，直到表現(xiàn)穩(wěn)定[31]。

對象就地場景記憶任務又稱為新物體識別實驗，最初該任務也主要用于老鼠的認知功能評估，后經(jīng)改造用于恒河猴，目前還有不少恒河猴阿爾茲海默癥及精神性疾病的藥理學實驗用該任務對其實驗模型進行評價。該任務相比其他任務所需采用的儀器更繁雜，種類較多，對于條件一般的實驗基地難以達到既定的標準。該任務需人工設定場景，所使用的觸摸顯示屏較難獲得，且步驟較多，雖可對恒河猴認知功能進行評估，但因?qū)嶒灡旧淼膹碗s性，恒河猴學習周期可能較長，需花大量時間對其進行訓練，相比其他周期較短的任務，該測試方式并無太多獨特的優(yōu)勢。

5 DRST

設備：棕色圓盤、不同規(guī)格測試托盤、不透明擋板。具體做法：在DRST測試中，刺激物為直徑約4 cm的棕色圓盤。隨著實驗次數(shù)增多，恒河猴必須在一個實驗中的不同位置上根據(jù)刺激物出現(xiàn)的不同順序，區(qū)分出新位置的刺激。測試托盤由18個(3×6)食物槽組成。將食物放入槽中用圓盤覆蓋時，測試開始，恒河猴可移動圓盤來獲取食物獎勵。擋板在實驗者和恒河猴間隔10 s，在此期間實驗者更換原始位置的圓盤，并在不同位置添加新圓盤(下方有獎勵)。然后屏幕升起，恒河猴必須置換新的圓盤才能獲得獎勵。在每次正確響應后，添加額外的圓盤，直到恒河猴犯錯或恒河猴連續(xù)9次選擇正確圓盤。任務包括新的和重復的兩種序列類型。對于新序列，刺激物隨機放置于托盤上18個食物槽。實驗10次/d，共10 d(100次實驗，包括75個新序列和25個重復序列)。恒河猴在犯錯前正確選擇次數(shù)均數(shù)稱為空間記憶跨度。新序列和重復序列的分數(shù)分別計算[32]。

該實驗中新序列的出現(xiàn)主要用于評估恒河猴工作記憶。對于重復序列，圓盤以獨特的順序出現(xiàn)在托盤上，該順序在實驗中重復，讓恒河猴記住。除了第1個刺激的初始位置外，沒有其他線索與該序列關聯(lián)，這些實驗用于評估恒河猴參考記憶，因為其提供的信息與實驗相關。DRST與對象就地場景記憶任務原理相同，對象就地場景記憶任務主要是識別新的物體，而DRST主要是測試恒河猴識別新位置的能力，其常與DMS、DNMS聯(lián)合進行。該任務操作較簡單，易于理解，實驗周期較適中，從時間成本看，較DNMS有很大的優(yōu)勢，且實驗器材可根據(jù)實際情況做調(diào)整與改進，并根據(jù)當?shù)睾愫雍锏男愿窦耙缽男赃M行設定。目前還未有一種聚集性的實驗對上述6種認知評估方案進行比較分析，認知評估方式選擇仍需結合各實驗基地實際情況進行。

6 總結與展望

空間延遲反應實驗中的DMST是最理想的認知評估方案，且是目前使用范圍最廣，頻率最高的方案，其彈性較好，可根據(jù)實際情況對該方案的形式與做法進行調(diào)整與改進[33]。如需對恒河猴認知功能進一步評價，應綜合考慮實驗對象依從性、實驗任務復雜程度、實驗裝置可獲取性、預訓練時長、測試時長、實驗結果可分析性，實驗條件及可達到的最優(yōu)化條件等，此時，DR[34-35]、DRST[36-37]也是不錯的選擇。相反，DNMS[38]、vsPAL[39-40]、對象就地場景記憶任務[41-42]在應用時有一定的局限，但最終認知功能評價工具的選擇還需結合自身實驗條件及實驗動物的依從性進行取舍。ORD、認知集轉(zhuǎn)換任務、手指迷宮實驗等認知評估工具的效用及推廣度還有待進一步商榷；此外，還有一些根據(jù)上述實驗原理轉(zhuǎn)變而來的大量任務測試，例如數(shù)字歧視任務、聲學歧視任務、學習記憶顏色歧視任務[43]、延遲頻率鑒別任務[44]、黑白歧視任務[45]、獎勵任務[46]、視覺辨別任務[47]等。上述實驗由于使用頻率較低,且結果真實性有待商榷，還需后續(xù)大量實驗對其結果進行驗證。動物認知功能評估工具多種多樣，恒河猴認知功能的評估方式也逐漸多樣化，因此應根據(jù)實驗目的，結合自身條件，選擇合適的VCI恒河猴模型神經(jīng)行為學評估工具。