＊韋采妮 趙晨菊 黃河笑 李顯芳 萬巧玲 余薇薇*

（1.重慶交通大學河海學院水利水運工程教育部重點實驗室 重慶 400074 2.國家城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)重慶監(jiān)測站 重慶 400060 3.重慶市渝東水務(wù)有限公司 重慶 404000）

我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，2013年重慶市養(yǎng)豬當量411.81萬頭，糞便產(chǎn)量達226.93萬噸[1]。大量畜禽糞便帶來了較嚴重的農(nóng)業(yè)面源污染問題，厭氧發(fā)酵工藝具有良好的生物降解性能，作為農(nóng)村消納畜禽糞便，實現(xiàn)畜禽糞污無害化、資源化處理的有效途徑，可將各種有機物轉(zhuǎn)化為CH4和CO2，獲得可再生生物燃料。富含營養(yǎng)物質(zhì)的消化沼液可作為肥料施用，改良農(nóng)田和土壤。豬糞中有機質(zhì)含量、TN、TP等達24.16%、2.65%、0.68%，具有較高的沼氣生產(chǎn)潛力[2]。但厭氧發(fā)酵工藝存在原料利用率低、易出現(xiàn)酸化和氨氮抑制等問題。通過添加Fe、Co、Ni、Mo元素，改善了食物廢棄物厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性和提高發(fā)酵性能[3]，微量元素缺乏是造成厭氧發(fā)酵性能差的首要原因。

微量元素是微生物生長不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)甲烷菌生長到1.32g/L左右時會缺Fe，而產(chǎn)甲烷菌生長到4.830g/L和30g/L時則會相應(yīng)缺乏Ni和Co等元素[4]。此前的研究厭氧發(fā)酵工藝性能優(yōu)化主要集中于對有機污染物的去除效率，且多為單一元素投加作用。因此，本次研究比較一定濃度的單一和混合元素對豬糞厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中產(chǎn)氣性能微生物群落的影響。研究結(jié)果可為提高豬糞厭氧發(fā)酵性能提供理論借鑒。

1.材料與方法

(1)樣品采集與接種

豬糞取自重慶市農(nóng)戶和養(yǎng)豬場，接種污泥取自污水處理廠厭氧池，接種前將馴化好的接種污泥在70～90℃條件下經(jīng)2h熱處理，降低產(chǎn)甲烷菌的活性。稱取一定量糞污、接種污泥與蒸餾水攪拌均勻，使發(fā)酵濃度調(diào)整為6.0% VS，初始pH調(diào)至中性，將配制發(fā)酵底物加入?yún)捬醢l(fā)酵罐中，溫度設(shè)定為37.0±0.5℃，攪拌速率設(shè)置為120r/min。

(2)實驗設(shè)計

①微量元素對厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣影響

根據(jù)前實驗確定厭氧發(fā)酵系統(tǒng)促進COD降解最佳微量元素投加量，微量元素以水溶液形式加入，實驗設(shè)置五組：實驗Ⅰ為空白組；實驗Ⅱ單一Fe（FeCl2·4H2O）元素10mg/L；實驗Ⅲ單一Co（CoCl2·6H2O）元素1.5mg/L；實驗Ⅳ單一Ni（NiCl2·6H2O）元素0.8mg/L；實驗Ⅴ混合Fe、Co、Ni，投加量分別為9mg/L、1mg/L和0.7mg/L。

②微量元素對厭氧發(fā)酵微生物群落影響

采集產(chǎn)氣高峰期添加不同微量元素的厭氧發(fā)酵罐中污泥，采集的樣品經(jīng)10000rpm離心10min，去除上清液，-80℃液氮保存送至上海美吉生物技術(shù)有限公司。

(3)分析方法

產(chǎn)氣量采用排飽和食鹽水法測定；樣品DNA使用Fast DNA?SPIN Kit for Soil試劑盒提??；使用細菌和古菌的通用引物515FmodF（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和806RmodR（GGACTACNVGGGTWTCTAAT），針對16SrRNA基因的V4區(qū)進行PCR擴增。擴增條件為：95℃下初期變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃下延伸45s，循環(huán)26次；72℃下延伸10min。純化產(chǎn)物進行MiSeq高通量測序，使用QIME1.9進行數(shù)據(jù)分析。

2.結(jié)果與分析

(1)產(chǎn)氣特性

添加單一Co、Ni和混合Fe、Co、Ni厭氧發(fā)酵沼氣日產(chǎn)量和累積產(chǎn)量均高于對照組，發(fā)酵第30天結(jié)束時，累積產(chǎn)氣量與對照組相比分別提高了1.18倍、1.69倍和1.85倍。添加單一10mg/L Fe略低于對照組，但累積產(chǎn)氣曲線還呈上升趨勢，推測添加單一Fe元素組還未發(fā)酵完全。有報道指出50～4000mg/L濃度的Fe2+有利于沼氣的產(chǎn)生[5]，說明促進COD降解與促進厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣的微量元素有效添加量有一定差異。Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn)在厭氧發(fā)酵后期Fe2+的添加會抑制纖維素酶的活性，產(chǎn)氣量低于未添加Fe2+組。微量元素的補充量與發(fā)酵基質(zhì)、接種物以及裝置的運行方式有關(guān)，發(fā)酵裝置和發(fā)酵物不同參與各階段產(chǎn)氣途徑所需輔酶的比列會發(fā)生變化。單一微量元素中，Ni元素對產(chǎn)沼氣的促進作用優(yōu)于Fe元素和Co元素，這可能對Ni元素在甲烷過程中參與CO脫氫酶、輔酶F430和甲基-輔酶M還原酶等的合成與催化起著關(guān)鍵作用[7]。單一微量元素對產(chǎn)氣量的促進效果低于混合微量元素，這可能是因為混合元素之間產(chǎn)生協(xié)同作用。

(2)微生物群落多樣性與結(jié)構(gòu)特性

①微生物多樣性

經(jīng)高通量測序，在OTUs為97%序列相似性水平下采用豐富度指數(shù)（Ace、Chao1）、多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）和深度指數(shù)（Coverage）對樣品中微生物群落進行分析，分析結(jié)果如表1。發(fā)酵產(chǎn)氣高峰期時的5個樣品的測序Coverage指數(shù)值均達99%，可全面有效解析發(fā)酵體系中微生物群落變化情況。Ace和Chao1指數(shù)可以反映微生物群落豐富度，同時Shannon指數(shù)越大和Simpson指數(shù)越小表示微生物群落的多樣性越高。隨著Fe、Co、Ni元素的投加，Ace、Chao1和Shannon指數(shù)均大于空白組，且Simpson指數(shù)均小于空白組，說明添加Fe、Co、Ni元素增加了厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物豐富度和多樣性。

表1 Illumina測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

(3)微生物群落結(jié)構(gòu)

厭氧發(fā)酵過程通過多種微生物協(xié)調(diào)配合作用，經(jīng)過水解、產(chǎn)氫產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷階段，最終產(chǎn)生沼氣，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能與微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在門類水平上，主要優(yōu)勢菌種為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、廣古菌門。微生物發(fā)酵產(chǎn)沼氣主要為產(chǎn)氫產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷階段。變形菌門主要用于降解粗蛋白質(zhì)為小分子物質(zhì)，以供產(chǎn)酸和產(chǎn)甲烷階段微生物分解轉(zhuǎn)化，同時能夠促進糞便中碳氮的轉(zhuǎn)化[8]，添加單一Fe元素組的變形菌門占14.09%，相比空白組提高了7.59%，F(xiàn)e元素的投加有助于變形菌門的生長。有研究指出厚壁菌門在富含纖維素底物中較為豐富，將木質(zhì)纖維素降解為有機酸，是水解酸化階段主要細菌群[9]，添加單一Fe元素、Co元素、Ni元素和混合Fe、Co、Ni元素的厚壁菌門豐度分別比空白實驗組提高了6.41%、10.46%、11.23%和7.55%，微量元素的投加促進發(fā)酵系統(tǒng)中的厚壁菌門豐度增大。而擬桿菌門參與木質(zhì)纖維素和多糖的利用，可在厭氧發(fā)酵過程中將有機物轉(zhuǎn)化為乙酸[10]，微量元素投加組擬桿菌門豐度明顯降低，表明微量元素對擬桿菌門具有抑制作用。

在屬水平上，主要以梭菌屬、土耳其螺屬、產(chǎn)芽胞厭氧菌和固氮菌為主，優(yōu)勢菌屬相對豐度在各實驗組中差別不大，不同微量元素對產(chǎn)甲烷菌的影響較大，產(chǎn)甲烷菌與甲烷產(chǎn)量存在密切關(guān)系，各實驗組的古菌主要為甲烷短桿菌和甲烷八疊球菌。甲烷短桿菌和甲烷八疊球菌分別屬于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌、乙酸營養(yǎng)學產(chǎn)甲烷菌，可促進氫營養(yǎng)化和乙酸分解產(chǎn)甲烷作用。添加Fe、Co、Ni和混合Fe、Co、Ni元素甲烷短桿菌比例分別提高了1.14%、0.59%、1.23%、3.76%。各實驗組甲烷八疊球菌比例分別為0.49%、0.28%、0.44%、0.35%和1.46%，投加混合元素協(xié)同作用可促進甲烷八疊球菌的生長，而微量的Fe、Ni元素對甲烷八疊球菌的增長表現(xiàn)出輕微的抑制，投加微量元素使產(chǎn)甲烷菌群落呈產(chǎn)乙酸營養(yǎng)型富集。因此投加Fe、Co、Ni元素對主要優(yōu)勢菌群種類沒有影響，但優(yōu)勢菌群的總占比有明顯提高，有利于水解產(chǎn)酸菌群和產(chǎn)甲烷菌群的繁殖和群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，提高了發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性和產(chǎn)氣性能。

3.結(jié)論

（1）添加一定濃度微量元素可以提高養(yǎng)豬糞污厭氧發(fā)酵中沼氣的產(chǎn)量，混合Fe、Co、Ni元素的協(xié)同作用，對于促進厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣效果最優(yōu)，有效促進了厭氧發(fā)酵的啟動和產(chǎn)氣高峰提前出現(xiàn)，加速厭氧發(fā)酵的進程。

（2）微量Fe、Co、Ni元素的添加增加了微生物群的豐度和多樣性，刺激優(yōu)勢菌群的生長和繁殖，從而提高厭氧發(fā)酵沼氣產(chǎn)速率與產(chǎn)氣量。